白豆蔻精油超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化及揮發(fā)性成分分析

馬 鈐，郭川川，張峰軼，李 鎵，楊壹芳

（四川天味食品集團股份有限公司，四川 成都 610200）

白豆蔻（Amomum cardamomum）為芭蕉目姜科豆蔻屬植物白豆蔻的果實，可藥食兼用。按產(chǎn)地不同分成國產(chǎn)豆蔻和進口豆蔻。氣味苦香，味道辛涼微苦，烹飪中可去異味、增辛香，常用于鹵水以及火鍋等[1-2]。目前，國內(nèi)外白豆蔻精油的提取方法主要有水蒸氣蒸餾萃?。╯team distillation extraction，SDE）法[3-4]、微波輔助萃取（microwave assisted extraction，MAE）法[5]、超臨界流體萃?。╯upercritical fluid extraction，SFE）法等[6-7]。水蒸氣蒸餾提取精油香氣濃郁，但幾乎無滋味物質，并且提取得率較低，導致價格昂貴。微波萃取法是指使用適當?shù)娜軇┰谖⒉ǚ磻髦袕闹参?、礦物、動物組織等中提取各種化學成分的技術和方法。微波是指頻率在300 MHz至300 GHz的電磁波，利用電磁場的作用使半固體或固體物質中的某些有機物成分與基體有效的分隔，并能保持分析對象化合物狀態(tài)不變[8]。其主要優(yōu)點是應用面廣、消耗樣品少、提取時間短、操作簡單，但需要借助有機溶劑，導致后期可能存在溶劑殘留。而超臨界CO2提取法作為一種綠色的、重要的工業(yè)化精油生產(chǎn)方法[9]，使用CO2提取的精油無化學污染，并且萃取能力強、提取率高，操作溫度較低，能防止熱敏性物質的功能性被破壞[10]，但由于其設備昂貴，還未在白豆蔻精油的工業(yè)化生產(chǎn)上普遍應用。因此，本試驗選取超臨界流體萃取（SFE）法進行研究，對萃取壓力、萃取溫度、萃取時間、CO2流量4個因素進行單因素試驗研究，并根據(jù)單因素試驗結果進一步進行了正交試驗，獲得白豆蔻精油最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)，并將最優(yōu)工藝條件下生產(chǎn)的白豆蔻精油采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析其組成，并用水蒸氣蒸餾法（SDE）加以對比，從而為白豆蔻揮發(fā)性成分的進一步研究開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮白豆蔻：印度尼西亞；CO2（純度＞99.9%）、氦氣（He）（純度＞99.99%）：成都科源氣體有限公司。

1.2 儀器與設備

3P多功能熱泵干燥車間：廣東凱能電器科技有限公司裝置；WFJ-60食品香料粉碎機：江陰市普友粉體設備有限公司；HA231-50-25超臨界萃取裝置：南通華安超臨界萃取設備公司；Agilent 9000氣相色譜儀、5977B 質譜儀：美國安捷倫公司；THT-4揮發(fā)油提取縮罐冷凝裝置：北京國衛(wèi)和教醫(yī)藥設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白豆蔻粉預處理

新鮮白豆蔻置于多功能熱泵干燥車間中，設置溫度60 ℃連續(xù)干燥，調(diào)節(jié)水分約至12%。干燥好的白豆蔻用食品干燥粉碎機粉碎，過40目篩。制得白豆蔻粉于常溫（25 ℃）干燥儲藏。

1.3.2 超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化單因素試驗

萃取壓力的確定：稱取600 kg粉碎后的白豆蔻，裝入萃取罐中，分別設置萃取壓力為25 MPa、30 MPa、35 MPa、40 MPa、45 MPa，固定設置萃取溫度為40 ℃，萃取時間3.5 h，萃取流量12 mL/min，解吸壓力6 MPa，解吸溫度65 ℃，研究萃取壓力對精油得率的影響。

萃取溫度的確定：稱取600 kg粉碎后的白豆蔻，裝入萃取罐中，設置萃取壓力為25 MPa，分別設置萃取溫度為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃，萃取時間3.5 h，萃取流量12 mL/min，解吸壓力6 MPa，解吸溫度65 ℃，研究萃取溫度對精油得率的影響。

萃取時間的確定：稱取600 kg粉碎后的白豆蔻，裝入萃取罐中，設置萃取壓力為25 MPa，萃取溫度為40 ℃，分別設置萃取時間3.5 h、4.0 h、4.5 h、5.0 h、5.5 h，萃取流量12 mL/min，解吸壓力6 MPa，解吸溫度65 ℃，研究萃取時間對精油得率的影響。

CO2流量的確定：稱取600 kg粉碎后的白豆蔻，裝入萃取罐中，設置萃取壓力為25 MPa，萃取溫度為40 ℃，設置萃取時間3.5 h，分別設置萃取流量為8 mL/min、10 mL/min、12 mL/min、14 mL/min、16 mL/min，解吸壓力6 MPa，解吸溫度65 ℃，研究CO2流量對精油得率的影響。

1.3.3 超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以揮發(fā)油萃取得率為評價指標，考察4個因素（萃取壓力、萃取溫度、CO2流量和萃取時間）對白豆蔻精油得率的影響。設置L9（34）試驗設計進行4因素3水平正交試驗，以確定最佳提取工藝。正交試驗因素與水平見表1。

表1 超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for supercritical CO2 extraction process optimization

1.3.4 水蒸氣蒸餾法提取白豆蔻精油

取150 kg白豆蔻加入500 L濃縮罐中，以300 L蒸餾水為溶劑，浸泡3 h后通入冷凝水，加熱回流4 h，停止加熱，自然冷卻至室溫。從揮發(fā)油提取裝置中收集白豆蔻揮發(fā)油，稱量，記錄數(shù)據(jù)，平行試驗3次，精油得率計算公式如下：

1.3.5 GC-MS分析

采用氣質聯(lián)用法，分析不同條件提取的白豆蔻精油的揮發(fā)性物質。GC-MS條件和參數(shù)如下：AgilentJ&WDB-WAX色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm），載氣為高純氦氣（He），流速1 mL/min，分流進樣（分流比20∶1），升溫程序：起始溫度50 ℃，從10 ℃/min升至160 ℃，保持2 min；以8 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。掃描范圍35～600m/z。利用Mass Hunter工作站，美國國家標準技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）17質譜庫檢索鑒定各種化學成分，按峰面積歸一化法確定各組分的相對含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

實驗樣品均有3次以上獨立重復，所有數(shù)據(jù)采集均使用Microsoft Office Excel 2010統(tǒng)計。正交試驗采用SPSS 2.0軟件設計分析。差異顯著性分析采用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（data processing system，DPS）7.5，P＜0.05認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 萃取工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 超臨界CO2萃取壓力對白豆蔻精油得率的影響

壓力是影響CO2超臨界萃取的關鍵因素之一。隨著超臨界流體壓力的增加，不同化合物的溶解度普遍急劇增加。特別是在臨界壓力附近，各種化合物的溶解度參數(shù)的增加值可達到兩個數(shù)量級以上。研究發(fā)現(xiàn)超臨界的溶解能力與壓力的關系可用超臨界流體的密度表示，其溶解能力一般隨著密度的增加而增加[11-12]。在臨界點附近，壓力對密度的影響特別明顯，流體的密度隨壓力的增加而迅速提高，溶解度增加效應越大。超過此范圍則壓力對密度增加的影響變小，溶解度增加效應也趨于緩慢。當?shù)孜镆约捌渌蛩匾欢〞r，隨著壓力的進一步增大，精油得率不再增加。

CO2超臨界萃取壓力對白豆蔻精油得率的影響結果見圖1。由圖1可知，隨著萃取壓力在25～45 MPa范圍內(nèi)的增加，白豆蔻精油得率總體有先上升后下降的趨勢。當萃取壓力在25～30 MPa時，白豆蔻精油得率顯著增加（P＜0.05）；當萃取壓力在30 MPa時，白豆蔻精油得率最高，為6%；當萃取壓力＞30 MPa之后，白豆蔻精油得率呈緩慢下降趨勢。因此，選擇最佳萃取壓力為30 MPa。

圖1 萃取壓力對精油得率的影響Fig.1 Effect of extraction pressure on essential oil yield

2.1.2 萃取溫度對白豆蔻精油得率的影響

溫度對超臨界萃取的影響比壓力更為復雜，主要包含兩個方面，即溫度對超臨界流體密度的影響和溫度對物質蒸汽壓的影響[13-14]。一般來說，隨著溫度的升高，密度降低，使物質在超臨界CO2流體中的溶解度下降。而溫度對物質蒸汽壓也有一定的影響，隨著溫度的升高，物質的蒸汽壓增大，使物質的溶解度增大。這兩個相反的影響導致在一定壓力下達到等壓溶解度的最低點。在最低溫度以下，前者占優(yōu)勢，溶解度呈下降趨勢，在最低溫度以上，后者占優(yōu)勢，溶解度呈上升趨勢。

CO2超臨界萃取溫度對白豆蔻精油得率的影響結果見圖2。由圖2可知，隨著萃取溫度的升高，白豆蔻精油得率總體有先上升后下降的趨勢。當萃取溫度在40～50 ℃時，白豆蔻精油得率隨之顯著增加（P＜0.05），且萃取溫度由45 ℃升高至50 ℃時的精油得率增長率高于40 ℃到45 ℃；當萃取溫度在50 ℃時，白豆蔻精油得率最高6%；當萃取溫度在50～60 ℃時，白豆蔻精油得率連續(xù)顯著降低（P＜0.05）。因此，選擇最佳萃取溫度為50 ℃。

圖2 萃取溫度對精油得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on essential oil yield

2.1.3 萃取時間對白豆蔻精油得率的影響

萃取時間對萃取率的影響可以從底物的量與萃取時間的關系來考慮[15-16]。在萃取底物及其他因素一定時，白豆蔻精油最大萃取量是一定的。隨著萃取時間的延長萃取率相應增加，但增加的曲線斜率逐漸減小，最后趨近于平緩，所以一般萃取時間控制在一定范圍內(nèi)。

CO2超臨界萃取時間對白豆蔻精油得率的影響見圖3。由圖3可知，隨著萃取時間在3.5～4.5 h范圍內(nèi)的增加，白豆蔻精油得率總體有先上升后趨于平緩的趨勢。當萃取時間在3.5～4.5 h時，白豆蔻精油得率隨之顯著增加（P＜0.05）；當萃取時間在4.5 h時，白豆蔻精油得率最高，為5.90%；當萃取時間在4.5～5.5 h時，白豆蔻精油得率不再有顯著變化（P＞0.05）。因此，選擇最佳萃取時間為4.5 h。

圖3 萃取時間對精油得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on essential oil yield

2.1.4 CO2流量對白豆蔻精油得率的影響

流量是萃取過程中的一個經(jīng)濟型指標，也是影響得率的重要因素之一。流量的變化對萃取率的影響應從兩方面考慮，即流量對傳質速率的影響和流量對萃取時間的影響[17-18]。流量的增加導致萃取器內(nèi)流速增加，流體與原料的萃取作用時間減少，萃取效率降低；但是，隨著流量的增加，與物質間相作用的單位時間流體溶劑增大，新鮮不含精油的流體溶劑，原料中精油物質向容劑中的傳質濃度梯度增大，精油向溶劑中的擴散速率提高，從而使萃取速率增大。CO2超臨界萃取流量對白豆蔻精油得率的影響結果見圖4。由圖4可知，隨著萃取CO2流量在8～16 mL/min范圍內(nèi)的增加，白豆蔻精油得率總體有先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。當萃取CO2流量由8～12 mL/min時，白豆蔻精油得率隨之顯著增加（P＜0.05），且萃取CO2流量由10 mL/min增長12 mL/min時的精油得率增長率高于8 mL/min到10 mL/min；當萃取CO2流量在12 mL/min時，白豆蔻精油得率最高，為5.70%；當萃取CO2流量在12～16 mL/min時，白豆蔻精油得率無顯著性變化（P＞0.05）。因此，選擇最佳萃取CO2流量為12 mL/min。

圖4 CO2流量對精油得率的影響Fig.4 Effect of CO2 flow rate on essential oil yield

2.2 超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化正交試驗設計及結果

在單因素試驗的基礎上，以揮發(fā)油萃取得率為評價指標，考察萃取壓力（A）、萃取溫度（B）、CO2流量（C）和萃取時間（D）對白豆蔻精油得率的影響，設置L9（34）正交試驗設計進行4因素3水平正交試驗，正交試驗結果與分析見表1。

由表2可知，對結果影響由大到小順序為萃取壓力＞萃取溫度＞CO2流量＞萃取時間，最優(yōu)組合為A1B2C3D1，即萃取壓力25 MPa、萃取溫度50 ℃、CO2流量14 mL/min、萃取時間4 h。在此最佳萃取工藝條件下進行3次平行驗證試驗，三次萃取平均白豆蔻精油得率為6.16%，且在此條件下白豆蔻精油的提取率高于正交試驗方案中的最高值（6.09%），說明該優(yōu)化方案是可行的[19-22]。由表3可知，萃取壓力對結果影響顯著（P＜0.05），萃取溫度、CO2流量及萃取時間對結果影響不顯著（P＞0.05）。

表2 超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for process optimization by supercritical CO2 extraction

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

2.3 GC-MS分析白豆蔻精油揮發(fā)性成分分析

2.3.1 總離子色譜圖

兩種不同方法提取白豆蔻精油揮發(fā)性成分GC-MS分析總離子流色譜圖見圖5。由圖5可知，水蒸氣蒸餾和超臨界萃取前幾個峰的峰型幾乎相似，說明兩種萃取精油中沸點低的易揮發(fā)性物質成分相似。水蒸汽蒸餾揮發(fā)性成分的GC-MS圖譜中10.766 min的化合物為乙酸松油酯（CAS.80-26-2），超臨界CO2萃取中10.790 min的化合物為L-α-松油醇（CAS.10482-56-1），不是同一種物質。

圖5 白豆蔻水蒸氣蒸餾萃?。╝）及超臨界CO2萃?。╞）提取精油揮發(fā)性成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.5 Total ion chromatogram of volatile compounds of Amomum cardamomum essential oil by steam distillation extraction (a)and supercritical CO2 extraction (b) analyzed by GC-MS

2.3.2 兩種提取方法提取的白豆蔻精油揮發(fā)性化合物分析

兩種不同方法提取白豆蔻精油揮發(fā)性成分GC-MS分析結果見表4。兩種提取方法提取的白豆蔻精油揮發(fā)性化合物種類及峰面積對比見表5。由表4及表5可知，兩種提取方法提取的白豆蔻精油中共檢出揮發(fā)性化合物158種，其中水蒸氣蒸餾法共檢出97種，獨有的化合物有47種；超臨界萃取法共檢出111種，獨有的化合物有61種；兩種提取法中共有的化合物有50種。水蒸氣蒸餾提取法中沒有檢出茚類，但檢出醚類。從檢出化合物的種類數(shù)量上比較，超臨界萃取法中檢出了更多種類的揮發(fā)性化合物。

表4 白豆蔻精油揮發(fā)成分測定結果Table 4 Determination results of volatile components in Amomum cardamomum essential oil

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

表5 兩種提取方法提取的白豆蔻精油中揮發(fā)性化合物種類及峰面積比較Table 5 Comparison of volatile compound types and peak areas in cardamom essential oil between two extraction methods

由表5可知，超臨界CO2萃取法樣品中總峰面積是水蒸氣蒸餾提取法中的2.70倍，其中醇類、烯烴類、醛類、酸類、烷烴類和萘類是峰面積增加的主要揮發(fā)性化合物，分別增加了8.07、4.39、8.39、13.07、18.72、16.47倍。從檢出化合物的峰面積大小來看，超臨界CO2萃取法能提取出更多的揮發(fā)性化合物，提取效果更佳。

2.3.3 兩種提取方法提取的白豆蔻精油中主要揮發(fā)性成分比較

兩種提取方法提取的白豆蔻精油中主要揮發(fā)性成分對比結果見表6。由表6可知，采用水蒸氣蒸餾法共檢測出97種揮發(fā)性化合物，其中主要的成分有：桉葉油醇、α-蒎烯、4-異丙基甲苯、順式十五烯酸、棕櫚酸、乙酸松油酯等。采用超臨界CO2萃取法共檢測出111種揮發(fā)性化合物，其中主要的成分有：桉葉油醇、棕櫚酸、油酸、α-蒎烯、順式十五烯酸、9（E）,11（E）-共軛亞油酸、4-異丙基甲苯、L-α-松油醇、1-亞甲基-4-（1-甲基乙烯基）-環(huán)己烷、蒎烯、（4aS順式）-2,4a,5,6,7,8,9,9a-八氫-3,5,5-三甲基-9-亞甲基-1H-苯并環(huán)庚烯、山萮醇、4-亞甲基-1-（1-甲基乙基）-雙環(huán)[3.1.0]己烷、Z-11-十六碳烯酸、三十二烷、D-檸檬烯、亞油酸、（1S-cis）-1,2,3,5,6,8a-六氫-4,7-二甲基-1-（1-甲基乙基）-萘、3-苯基-2-丙烯醛等。從檢出的主要揮發(fā)性化合物種類來看，水蒸氣蒸餾為6種，超臨界CO2萃取為19種，均包含桉葉油醇、α-蒎烯、4-異丙基甲苯、順式十五烯酸、棕櫚酸5種；超臨界CO2萃取法提取的揮發(fā)性化合物種類更多，但未檢出乙酸松油酯。

由表6可知，從檢出的總峰面積來看，超臨界CO2萃取是水蒸氣蒸餾提取的2.41倍，超臨界萃取明顯地提升了順式十五烯酸和棕櫚酸的提取率，其峰面積分別是水蒸氣蒸餾提取法的6.33、8.78倍。綜上所述，用超臨界CO2萃取提取白豆蔻精油，效果更佳。

表6 兩種提取方法提取的白豆蔻精油中主要揮發(fā)性化合物及峰面積比較Table 6 Comparison of major volatile compounds and peak areas in Amomum cardamomum essential oil between two extraction methods

劉金敏等[23]采用頂空固相微萃取法-氣質聯(lián)用技術從白豆蔻中鑒定出了40種成分，其中含量最高的是桉油精（即桉葉油醇），其相對百分含量為32.95%；其次是，烯烴類化合物豐富，相對百分含量為39.12%；王芳[5]使用聚二甲基硅氧烷固相微萃取-氣質聯(lián)用技術分析白豆蔻精油32種揮發(fā)性成分，其中主要的化合物有1,8-桉樹腦（即桉葉油醇）、β-蒎烯、α-蒎烯、α-松油醇等。張耀華等[25]采用非極性溶劑微波萃取-氣相色譜-質譜法測定白豆蔻中的揮發(fā)油成分，共鑒定出60種揮發(fā)性化學成分，其中主要的化合物為桉油精（即桉葉油醇，70.34%）、β-蒎烯（6.81%）、α-松油醇（3.36%）和α-蒎烯（2.54%）等。張耀華等[25]采用超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取白豆蔻揮發(fā)油進行氣質分析，共鑒定出23個化合物，主要包括桉油精（即桉葉油醇，75.16%）、α-蒎烯（1.73%）、β-蒎烯（3.88%）、4-松油烯醇（1.37%）、乙酸松油酯（6.73%）等。以上研究成果中的主要成分，均與本次結果相似，再次驗證了本次分析結果的準確性。

3 結論

本研究采用超臨界CO2萃取裝置對白豆蔻進行萃取，以精油得率為考察指標，在單因素的基礎上進行正交試驗，通過正交試驗得出最佳的萃取條件為：萃取壓力25 MPa、萃取溫度50 ℃、CO2流量14 mL/min、萃取時間4 h，同時進行水蒸氣蒸餾萃取，通過GC-MS對所制備的精油進行分析，白豆蔻精油中主要含有桉葉油醇、α-蒎烯、乙酸松油酯、α-松油醇等揮發(fā)性風味物質，超臨界CO2萃取法比水蒸氣蒸餾萃取法檢測出主要揮發(fā)性風味物質的含量更高，且檢測出的種類更豐富。超臨界CO2萃取法應用于白豆蔻精油的提取，效果更優(yōu)，為白豆蔻的進一步開發(fā)利用提供了研究基礎。