一株強(qiáng)吸附膽固醇乳酸菌的分離鑒定及益生特性研究

曹海鵬，姬鄧紅，黃作芳，甘 濤，袁雨雨，楊良恒，姜 山

（貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550001）

膽固醇是人體內(nèi)重要的生理物質(zhì)，但是隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，過量的血清膽固醇（尤其是低密度脂蛋白膽固醇）導(dǎo)致高血壓、冠心病及動(dòng)脈硬化等心腦血管疾病的發(fā)病率逐年上升[1]。因膽固醇過高引起的心血管疾病是我國(guó)居民死亡的首要原因，其死亡率超過所有癌癥的總和[2]。據(jù)報(bào)道，血清膽固醇水平與心血管疾病發(fā)病呈正相關(guān)，膽固醇水平每高出正常水平1 mmol/L，則心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)便約增加35%，每降低1%，則心血疾病發(fā)病率減少2%～3%[3]。降低血清膽固醇水平的傳統(tǒng)方法是服用他汀類藥物、依澤替米貝和膽汁酸螯合劑等，抑制膽固醇的吸收與合成[4-6]。但是這些藥物昂貴，加重病人費(fèi)用負(fù)擔(dān)，此外，還會(huì)造成橫紋肌溶解、腎功能受損及潮紅等無法逆轉(zhuǎn)的副作用[7]。因此，尋找新的、安全有效的藥物替代品具有重要意義。

大量研究表明，服用乳酸菌及其制品可以有效降低人體血清膽固醇水平。早在1974年，MANN G V[8]研究發(fā)現(xiàn)，非洲Masai人長(zhǎng)期飲用由乳桿菌發(fā)酵的乳制品，其體內(nèi)血清膽固醇含量普遍較低。GILLILAND S E等[9]研究了腸道乳桿菌降膽固醇機(jī)制，提出乳酸菌能在生長(zhǎng)過程中降解膽鹽，并促進(jìn)膽固醇的分解代謝，從而降低膽固醇水平的觀點(diǎn)。此后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者展開了大量降膽固醇乳酸菌的分離、功能和機(jī)制研究。RAI J L等[10]研究發(fā)現(xiàn)，一些豬糞便源乳酸菌能在膽鹽存在的情況下，直接通過菌體細(xì)胞吸收膽固醇，顯著降低發(fā)酵培養(yǎng)基中膽固醇的含量。KLAVER F等[11]研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇能在低pH下與游離膽酸鹽共沉淀，從而降低培養(yǎng)基的膽固醇。馬長(zhǎng)路等[2，12-14]從人體與動(dòng)物糞便及各種食品原料中分離出各種降膽固醇乳酸菌，且這些乳酸菌均具有良好的益生特性，能較好的降低體外降膽固醇水平，表明降膽固醇乳酸菌具有較好的研究和應(yīng)用價(jià)值。但是以上菌株大多是以含膽鹽的培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基，所分離的菌株能水解膽鹽形成游離膽酸，游離膽酸與膽固醇在酸性條件下（pH＜5.0）共沉淀，進(jìn)而降低培養(yǎng)基中的膽固醇水平。然而，人與其他哺乳動(dòng)物腸道一般是中性的，乳酸菌在腸道內(nèi)通過水解膽鹽與膽固醇共沉淀的機(jī)制幾乎不存在[15]。且上述糞便或食品來源乳酸菌的生理環(huán)境與腸道內(nèi)部不同，其在腸道定植、存活時(shí)間及體內(nèi)發(fā)揮活性時(shí)間均有待考證。

本研究以豬腸道黏膜內(nèi)容物、人類糞便及自然發(fā)酵泡菜等為原料，從中分離、篩選出能直接通過吸附、同化等機(jī)制降膽固醇的乳酸菌，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)鑒定，研究其膽固醇降解能力、抗生素敏感性及溫度、pH、0.3%牛膽鹽、模擬胃腸液對(duì)菌株耐受性的影響，探討菌株益生特性，以期為降膽固醇制劑的開發(fā)提供新的出發(fā)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

健康成年黔北黑豬的豬腸道黏膜內(nèi)容物（飼養(yǎng)期間未施用抗生素和任何微生態(tài)制劑等）：貴州省畢節(jié)市偏遠(yuǎn)山區(qū)散養(yǎng)豬；健康成人糞便：本地健康成年男性志愿者；自然發(fā)酵泡菜：自制。

1.1.2 試劑

胃蛋白酶（酶活250 U/mg）、胰蛋白酶（酶活250 U/mg）：南京都萊生物技術(shù)有限公司；結(jié)合型牛膽鹽（99%）：上海源葉生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片：杭州微生物試劑有限公司；膽固醇（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；DL5000 DNA Marker：南京諾唯贊生物科技有限公司。其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基[16]：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3 g，吐溫80 1.0 mL，葡萄糖20.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，七水硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.6。121 ℃高壓滅菌20 min。MRS固體培養(yǎng)基是在MRS液體培養(yǎng)基上添加1.5%的瓊脂。

改良MRS液體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加0.05%碳酸鈣。121 ℃高壓滅菌20 min。改良MRS固體培養(yǎng)基是在改良MRS液體培養(yǎng)基上添加1.5%的瓊脂。

膽固醇培養(yǎng)基[17]：取膽固醇100 mg，蔗糖酯100 mg，吐溫-80 1.0 mL，冰乙酸5.0 mL，冰浴超聲破碎后，加入到改良MRS液體培養(yǎng)基中，加水調(diào)至膽固醇終質(zhì)量濃度為100 μg/mL，pH 6.5。121 ℃滅菌20 min。

0.3%牛膽鹽培養(yǎng)基：在改良MRS液體培養(yǎng)基中加入0.3%結(jié)合型牛膽鹽。

1.2 儀器與設(shè)備

JA1003電子天平：力辰科技有限公司；DH6000B電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；XMTA-7000智能恒溫干燥箱：上海景邁儀器設(shè)備有限公司；XSP-06光學(xué)顯微鏡：湖北省潛江市教學(xué)儀器廠；THZ-82A雙數(shù)顯旋轉(zhuǎn)氣浴震蕩器、TGL-16A高速離心機(jī)：金壇市城東新瑞儀器廠；FE20 pH計(jì)：深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司；WD-9402B/D聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：北京六一生物科技有限公司；HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；721可見分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人工胃液和人工腸液的制備

人工胃液[18]：氯化鈉0.2 g，胃蛋白酶1.0 g，以pH 2.0的100 mL鹽酸水溶液稀釋，溶解后調(diào)節(jié)pH至3.0，微孔濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

人工腸液[18]：磷酸二氫鉀0.68 g，蒸餾水溶解，以濃度為0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，另取胰蛋白酶1.0 g加適量水使其溶解，將兩液混合后加水定容至100 mL，用微孔過濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株的初篩

用體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒過的解剖剪剪開豬腸道，小心剔除腸道內(nèi)容物，用消毒過的解剖刀刮取腸道黏膜附屬物，收集之后與健康成人糞便、自然發(fā)酵泡菜樣品一起進(jìn)行梯度稀釋，分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6及10-7等梯度，各選取10-5、10-6和10-7等梯度樣品200 μL涂布于改良MRS平板，于厭氧罐37 ℃，培養(yǎng)48 h，分離單菌落，分離方案參考馬長(zhǎng)路等[2]的方法。從豬腸道黏膜樣品的改良MRS固體培養(yǎng)基中挑取40個(gè)乳白色、高圓隆、邊緣整齊且溶鈣圈較大等具有典型乳酸菌特征的菌落，劃線分離，多次純化后轉(zhuǎn)接改良MRS固體培養(yǎng)基斜面，分別編號(hào)為R-1～R-40；采取同樣的分離、純化方法，從成人糞便樣品的改良MRS固體培養(yǎng)基中挑取同樣形態(tài)的菌落30個(gè)，轉(zhuǎn)接斜面后分別編號(hào)FR-1～FR-30；從自制泡菜樣品的改良MRS固體培養(yǎng)基中挑取同樣形態(tài)的菌落30個(gè)，轉(zhuǎn)接斜面后分別編號(hào)為PF-1～PF-30。進(jìn)一步將各菌株純化后，經(jīng)鏡檢后進(jìn)行接觸酶和過氧化氫酶試驗(yàn)，篩選革蘭氏陽性、接觸酶陽性及過氧化氫酶陰性的菌株接種斜面，于4 ℃保藏備用。

1.3.3 降解膽固醇乳酸菌的復(fù)篩

將上述分離的所有保藏于MRS固體培養(yǎng)基斜面的菌株分別轉(zhuǎn)接入10 mL膽固醇液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取1 mL種子液轉(zhuǎn)接于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)24 h。取1 mL發(fā)酵液，8 000 r/min離心5 min，收集上清液，采用硫酸鐵銨法檢測(cè)上清液與未接種乳酸菌的培養(yǎng)基中膽固醇的含量[19]。計(jì)算膽固醇降解率，初步篩選出膽固醇降解率在10%以上的菌株進(jìn)行復(fù)篩，至膽固醇降解率穩(wěn)定。最終篩選膽固醇降解率最高的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。膽固醇降解率計(jì)算公式如下：

式中：R為降解率，%；A0為培養(yǎng)前的膽固醇含量，μg/mL；A為培養(yǎng)后的膽固醇含量，μg/mL。

1.3.4 降解膽固醇乳酸菌的16S rDNA鑒定

篩選出目的菌株后，以其單菌落為脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：細(xì)菌通用引物27F和1492R為引物，各1 μL，加入2×Taqmix 25 μL，雙蒸水23 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；72 ℃再延伸5 min。用1%的瓊脂糖凝膠驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，驗(yàn)證成功的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列分析。將所測(cè)的16S rDNA序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）GenBank中基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對(duì)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）[20]。并采用MEGA 7.0軟件的鄰近法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析并確定菌株種類。

1.3.5 菌株生長(zhǎng)曲線及膽固醇降解率曲線

取上述篩選出的最佳降解膽固醇菌株種子液，以1%接種量（V/V）接入200 mL膽固醇液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)24 h。期間分別取發(fā)酵時(shí)間為0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h的樣品各5 mL，8 000 r/min離心5 min，收集上清液，檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)上清液pH值，將剩余樣品參照方法1.3.3進(jìn)行降膽固醇試驗(yàn)，并計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)膽固醇降解率[19]。

1.3.6 膽固醇吸附試驗(yàn)

取篩選菌株的MRS培養(yǎng)液10 mL，制備方法同1.3.3，8 000 r/min離心5 min，棄上清收集沉淀，將沉淀用生理鹽水洗滌3次，重懸于生理鹽水中，并將菌體懸液調(diào)至原濃度的2倍，分等體積兩份，其中一份置于121 ℃滅菌20 min。將兩組菌懸液分別與等體積質(zhì)量濃度為200 μg/mL的膽固醇溶液混合（膽固醇用含2%吐溫-80溶液溶解，混勻后膽固醇終質(zhì)量濃度為100 μg/mL），分別取0、0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h、5.0 h時(shí)間點(diǎn)的樣品溶液1 mL，離心取上清液，參照方法1.3.3檢測(cè)膽固醇含量，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)菌體對(duì)膽固醇的清除率。

1.3.7 藥物敏感試驗(yàn)

取200 μL篩選菌株菌液，制備方法同方法1.3.3，均勻涂布于MRS培養(yǎng)基平板中，小心放置氨芐西林、慶大霉素、頭孢唑林、四環(huán)素、丁胺卡那、環(huán)丙沙星、氯霉素、青霉素、復(fù)方新諾明、諾氟沙星及紅霉素11種抗生素藥敏紙片（藥片直徑為6 mm），每個(gè)紙片的間距≥24 mm。其中，氨芐西林、慶大霉素、青霉素和諾氟沙星每片10 μg，頭孢唑啉、四環(huán)素、丁胺卡那和氯霉素每片30 μg，環(huán)丙沙星每片5 μg，復(fù)方新諾明每片23.75 μg，紅霉素15 μg。于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，測(cè)量并統(tǒng)計(jì)抑菌圈直徑。菌株對(duì)抗生素敏感性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考李艷莉[21]的方法，乳酸菌對(duì)抗生素的耐藥標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 乳酸菌對(duì)抗生素的耐藥標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Antibiotic resistance standards of lactic acid bacteria

1.3.8 菌株耐受性試驗(yàn)

針對(duì)過程控制儀表應(yīng)用能力的培養(yǎng)需求，增設(shè)高級(jí)PLC技術(shù)、現(xiàn)代測(cè)控系統(tǒng)兩門選修課程；改進(jìn)電氣控制與PLC技術(shù)、控制儀表及裝置等專業(yè)課程的教學(xué)模式，如電氣控制與PLC技術(shù)增加大量的工程案例教學(xué)及利用實(shí)驗(yàn)室設(shè)備進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)編程調(diào)試等形式的技能測(cè)試環(huán)節(jié)，控制儀表及裝置利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器設(shè)備以及實(shí)驗(yàn)教學(xué)平臺(tái)實(shí)施現(xiàn)場(chǎng)儀表教學(xué)，并增加平時(shí)預(yù)留查閱作業(yè)以及儀表技能測(cè)試內(nèi)容；工業(yè)控制網(wǎng)絡(luò)課程也逐步采取考試方法改革，提高學(xué)生儀表通信與控制方面的實(shí)時(shí)設(shè)計(jì)能力。

（1）溫度耐受性

取上述制備篩選菌株的MRS培養(yǎng)液，制備方法同1.3.3，離心（8 000 r/min、5 min），取沉淀，生理鹽水清洗3次后重懸于等體積的生理鹽水中。將菌懸液分成等體積5份，分別置于30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃及60 ℃處理30 min，梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6及10-7等，分別選取10-5、10-6和10-7梯度樣品200 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板中，37 ℃培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計(jì)乳酸菌數(shù)量，計(jì)算菌株存活率，存活率計(jì)算公式如下：

式中：S為存活率，%；A為處理后乳酸菌數(shù)量，CFU/mL；B為處理前乳酸菌數(shù)量，CFU/mL。

（2）酸、膽鹽耐受性

取篩選菌株菌液，離心棄上清，沉淀經(jīng)生理鹽水清洗后重懸于等體積的生理鹽水中，并取400μL菌液接種于8 mL pH2的MRS液體培養(yǎng)基和0.3%牛膽鹽培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)。取處理0、2 h、4 h、6 h的菌液稀釋涂布于改良MRS平板，并置于厭氧培養(yǎng)罐中，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h。從稀釋度較高（稀釋度為10-6）的平板中統(tǒng)計(jì)乳酸菌數(shù)，計(jì)算菌株存活率[23]。

（3）模擬胃腸液耐受性

取篩選菌株菌懸液400 μL，接種于8 mL人工胃液和人工腸液中，37 ℃靜置培養(yǎng)6 h。取0、2 h、4 h、6 h稀釋液涂布于改良MRS平板中。靜置培養(yǎng)后，從稀釋度較高（稀釋度為10-6）的平板中統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算菌株存活率[22]。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

以上數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用Excel 2017進(jìn)行分析、處理與制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的初篩

從豬腸道黏膜內(nèi)容物、成人糞便、自然發(fā)酵泡菜樣品中分離的100株菌株的菌落特征均為乳白色、高隆起、邊緣整齊，產(chǎn)酸能力強(qiáng)，有乳香味，其表菌株的菌落形態(tài)特征見圖1。所有分離菌株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為紫色，為革蘭氏陽性菌，且接觸酶陽性、過氧化氫酶陰性，具備典型的乳酸菌理化特征。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及生理生化試驗(yàn)可以初步判斷所分離菌株為乳酸菌。

圖1 分離代表菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of isolated representative strains

2.2 降解膽固醇乳酸菌的篩選

將上述分離的100株菌株分別接入膽固醇培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，采用硫酸鐵銨法檢測(cè)發(fā)酵液與對(duì)照培養(yǎng)基中膽固醇的含量，經(jīng)復(fù)篩共篩選出19株膽固醇降解率在10%以上的乳酸菌菌株，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，豬腸道黏膜內(nèi)容物源、成人糞便、自制泡菜源降解膽固醇菌株分別有6株、3株、10株，這可能與糞便中微生物過于集中、且多為糞腸球菌等有關(guān)[2]；菌株R-15的膽固醇降解率最高，為60.5%；菌株R-21和PF-28膽固醇降解率均＞30%。除菌株R-15之外，其余分離菌株的膽固醇降解率普遍低于當(dāng)前研究報(bào)告中乳酸菌的膽固醇降解率[2，12-13，19]。本研究以非膽鹽培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基，排除膽鹽共沉淀干擾，篩選出能直接吸附或同化膽固醇的乳酸菌。其中，豬腸道黏膜源菌株R-15能直接吸附或同化培養(yǎng)基中約60%以上的膽固醇，降膽固醇性能穩(wěn)定，受環(huán)境干擾少，具有更重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。因此，后續(xù)試驗(yàn)均使用菌株R-15為出發(fā)菌株。

圖2 分離菌株的膽固醇降解率Fig.2 Cholesterol degradation rates of isolated strains

2.3 菌株R-15的16S rDNA鑒定結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳驗(yàn)證，菌株R-15的16S rDNA的長(zhǎng)度見圖3。

圖3 菌株R-15的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification product of 16S rDNA of strain R-15

由圖3可知，PCR擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度約1 500 bp。測(cè)序后，將16S rDNA測(cè)序序列提交GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/），結(jié)果顯示菌株R-15的16S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的Lactiplantibacillus plantarumATG-K6的同源率較高（＞99%）。選取同源性較高乳酸菌的16S rDNA序列，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。由圖4可知，菌株R-15與植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）聚于一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合菌株的菌落特征，鑒定菌株其為植物乳桿菌，并將其命名為植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）R-15。并將菌株R-15保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（China center for type culture collection，CCTCC），保藏編號(hào)為CCTCC M2018010。

圖4 基于16S rDNA序列菌株R-15系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain R-15 based on 16S rDNA sequence

2.4 菌株R-15生長(zhǎng)曲線及膽固醇降解率曲線

菌株R-15生長(zhǎng)曲線與膽固醇降解率結(jié)果曲線見圖5。由圖5可知，菌株R-15液體培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)迅速，菌種濃度在12 h時(shí)基本達(dá)到穩(wěn)定（12～24 h）。膽固醇的降解率變化與菌體生長(zhǎng)量（OD600nm值）基本一致，菌株R-15在8～12 h降膽固醇效果更好，培養(yǎng)12 h時(shí)，其膽固醇降解率達(dá)50%以上，表明菌株R-15對(duì)膽固醇的降解主要發(fā)生在微生物生長(zhǎng)期，與菌體生長(zhǎng)量有直接關(guān)系，即降解機(jī)制主要為同化或細(xì)胞吸收。

圖5 菌株R-15生長(zhǎng)曲線與膽固醇降解率Fig.5 Growth curve and cholesterol degradation rates of strain R-15

2.5 菌株R-15膽固醇吸附試驗(yàn)

菌株R-15對(duì)膽固醇的吸附率隨時(shí)間變化結(jié)果見圖6。由圖6可知，菌株R-15的活菌與死菌的膽固醇吸附曲線一致，但菌株R-15的活菌能迅速吸附大量的膽固醇。當(dāng)吸附時(shí)間為0.5 h時(shí)，活菌的膽固醇吸附率在50%以上（吸附速率高達(dá)109.4 μg/（mL·h），隨著吸附時(shí)間在0.5～1.0 h范圍內(nèi)的增加，活菌的膽固醇吸附率明顯增加；繼續(xù)增加吸附時(shí)間至4 h，膽固醇吸附率增加至最高值，為70%；隨后，繼續(xù)延長(zhǎng)吸附時(shí)間，膽固醇吸附率有所下降。死菌膽固醇吸附較慢，當(dāng)吸附時(shí)間為0.5 h時(shí)，死菌膽固醇吸附率約為34.77%，延長(zhǎng)吸附時(shí)間至4.0 h，膽固醇吸附率逐漸增加；當(dāng)吸附時(shí)間＞4.0 h，吸附率逐漸平穩(wěn)，達(dá)到70%左右。當(dāng)吸附時(shí)間為4 h時(shí)，休眠菌體與死亡菌體的膽固醇吸附率均達(dá)70%。數(shù)據(jù)表明，植物乳桿菌R-15對(duì)膽固醇的降解機(jī)制主要為細(xì)胞吸附，吸附能力強(qiáng)且迅速，與李杰等[18，24-25]研究結(jié)論一致，說明吸附是部分乳酸菌體外降膽固醇的主要機(jī)制；菌體滅活后會(huì)影響其吸附速率，但不影響其最終吸附率。

圖6 菌株R-15對(duì)膽固醇的吸附率隨時(shí)間變化結(jié)果Fig.6 Change of adsorption rates of strain R-15 to cholesterol with time

2.6 菌株R-15藥敏試驗(yàn)結(jié)果

菌株R-15的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見圖7。由圖7可知，菌株R-15對(duì)氨芐西林、頭孢唑啉、氯霉素和青霉素等敏感，藥敏直徑均＞6 mm；對(duì)紅霉素中度敏感，藥敏直徑約20 mm；對(duì)四環(huán)素耐藥，藥敏直徑≤14 mm；對(duì)喹諾酮類諾氟沙星和環(huán)丙沙星，氨基糖苷類慶大霉素和丁胺卡那及磺胺類復(fù)方新諾明等完全耐藥。乳酸菌的多重耐藥現(xiàn)象有利于其在抗生素存在的情況存活，或與相關(guān)抗生素聯(lián)用治療細(xì)菌性疾病。但多重耐藥現(xiàn)象的存在增大了耐藥基因種間轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，存在一定的生物安全問題，需進(jìn)一步研究其耐藥機(jī)制和耐藥基因遺傳轉(zhuǎn)移的潛在可能性[24-25]。

圖7 菌株R-15的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Results of drug sensitivity tests of strain R-15

2.7 菌株R15耐受性試驗(yàn)結(jié)果

2.7.1 溫度耐受性

不同溫度處理30 min條件下菌株R-15的存活率結(jié)果見圖8。由圖8可知，處理溫度范圍在30～45 ℃時(shí)，菌株R-15活菌數(shù)基本無變化；當(dāng)處理溫度高于50 ℃時(shí)，菌株R-15的存活率開始有所下降；當(dāng)處理溫度達(dá)60 ℃時(shí)，存活率降至約40%。說明分離菌株對(duì)溫度有一定耐受性，在一定程度上能抵抗巴氏消毒、薄膜蒸發(fā)或熱氣流干燥等處理，便于食品工業(yè)或微生態(tài)制劑生產(chǎn)及加工。

圖8 不同溫度處理下菌株R-15的存活率Fig.8 Survival rates of strain R-15 after treatment under different temperature

2.7.2 酸、膽鹽耐受性

人和哺乳動(dòng)物的胃消化道環(huán)境是酸性的，空腹時(shí)胃消化液pH一般＜2.0。乳酸菌作為腸道益生菌需要具備一定的耐酸性能，以確保其能順利通過酸性胃消化道進(jìn)入腸道，發(fā)揮益生功能。另外，哺乳動(dòng)物腸道一般含有0.03%～0.30%膽鹽，乳酸菌必須對(duì)高濃度膽鹽有一定的耐受性，以確保其順利通過消化道，才能在腸道內(nèi)存活、增殖或定植，發(fā)揮益生活性[7]。菌株R-15的耐酸、耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果見圖9。由圖9可知，菌株R-15在pH 2.0條件下，隨著處理時(shí)間在0～6 h范圍內(nèi)的延長(zhǎng)，其乳酸菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)值逐漸下降；至處理時(shí)間6 h時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)值下降至6.83，較初始值下降1.34。在0.3%牛膽鹽條件下，隨著處理時(shí)間在0～6 h范圍內(nèi)的延長(zhǎng)，菌株R-15活菌數(shù)對(duì)數(shù)值逐漸下降；處理時(shí)間6 h時(shí)，對(duì)數(shù)值降至6.12，較初始值下降2.05。與陳儀婷等[26]所分離乳酸菌相比，菌株R-15對(duì)酸和膽鹽的抵抗力較弱，但考慮到乳酸菌隨食物通過胃的時(shí)間一般小于4 h，且腸道內(nèi)不會(huì)一直處于高膽鹽濃度，該乳酸菌已滿足其基本生存條件[19]。另外，菌株R-15降膽固醇主要機(jī)制是吸附，即使死菌依然有較強(qiáng)的降膽固醇性能。

圖9 菌株R-15的耐酸、耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果Fig.9 Resistance results of strain R-15 to acid and bile salt

2.7.3 模擬胃腸液耐受性

益生菌經(jīng)過胃腸道環(huán)境時(shí)，除受低pH、高濃度膽鹽影響，還要承受胃蛋白酶、胰蛋白酶等多種消化酶的影響。菌株R-15在模擬胃腸液中的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值隨時(shí)間的變化見圖10。由圖10可知，該菌株在模擬胃液、模擬腸液中連續(xù)處理6 h時(shí)，其活菌數(shù)對(duì)數(shù)值呈逐漸較小的趨勢(shì)，模擬胃液中乳酸菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)值比初始值僅減少1.54；模擬腸液中乳酸菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)值減少1.05。表明菌株R-15在模擬胃腸液中有一定的穩(wěn)定性，對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶具有一定的抵抗力，有助于其通過消化道，在腸道內(nèi)發(fā)揮活性。

圖10 菌株R-15的模擬胃液耐受性試驗(yàn)結(jié)果Fig.10 Resistance results of strain R-15 to simulated gastric juice

3 結(jié)論

本研究以未施用過抗生素的健康成年黔北黑豬的腸道黏膜內(nèi)容物、本地健康陳年人糞便和自然發(fā)酵泡菜為原料，從腸道黏膜內(nèi)容物中篩選出1株具有極強(qiáng)吸附膽固醇能力的乳酸菌R-15；分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，該菌株為植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）；菌株R-15降膽固醇能力與菌株的生長(zhǎng)量（OD600nm值）呈正相關(guān)，主要機(jī)制為吸附作用；當(dāng)吸附時(shí)間為4.0 h時(shí)，活菌與死菌的膽固醇吸附率相近（70%）；對(duì)氨芐西林和頭孢唑啉較敏感，藥敏直徑約為30 mm；可耐受30～45 ℃的溫度；對(duì)pH2、0.3%膽鹽、模擬胃腸液具有一定耐受性。因此，該菌株在預(yù)防和治療高膽固醇疾病方面具有一定的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。