外標(biāo)法與主成分校正因子法測定纈沙坦氨氯地平片中已知雜質(zhì)含量的價(jià)值對比

吳健龍，關(guān) 東，呂海亮，黃 松，杜 偉，陳亞軍★，謝 斌★

（1. 武漢科技大學(xué)藥學(xué)系，湖北 武漢 430065 ；2. 珠海潤都制藥股份有限公司，廣東 珠海 519041）

纈沙坦氨氯地平片是一種復(fù)方降壓藥，其主要成分為纈沙坦和苯磺酸氨氯地平。纈沙坦為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，苯磺酸氨氯地平為鈣離子通道阻斷劑。纈沙坦氨氯地平片主要用于治療輕中度高血壓[1]，也可用于治療高血壓合并其他疾病，如高血壓合并糖尿病[2]。與單用纈沙坦或苯磺酸氨氯地平治療高血壓相比，用纈沙坦聯(lián)合苯磺酸氨氯地平治療此病的效果更好，能有效控制患者的血壓[3-4]。纈沙坦氨氯地平片為復(fù)方制劑，其中含有的雜質(zhì)由已知雜質(zhì)和未知雜質(zhì)組成。為了達(dá)到有效控制纈沙坦氨氯地平片質(zhì)量的目的，本試驗(yàn)參考41 版《美國藥典》[5]，分別采用高效液相色譜（HPLC）外標(biāo)法與主成分校正因子法測定纈沙坦氨氯地平片中已知雜質(zhì)在不同濃度中的含量，比較其回收率。本試驗(yàn)規(guī)定的纈沙坦氨氯地平片中的已知雜質(zhì)為纈沙坦水解雜質(zhì)、纈沙坦乙酯、氨氯地平有關(guān)物質(zhì)A 和纈沙坦雜質(zhì)B，但對纈沙坦雜質(zhì)B 不要求進(jìn)行含量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 高效液相色譜儀，包含在線脫氣機(jī)、四元高壓泵、自動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器；XPR6UD5/A、XSR105/A 型電子天平。

1.2 試藥

纈沙坦對照品（生產(chǎn)廠家：珠海潤都制藥股份有限公司；批號：191202 ；含量：99.3%）；苯磺酸氨氯地平對照品（生產(chǎn)廠家：中國食品藥品檢定研究院；批號：100374-201605 ；含量：100.0%）；纈沙坦氨氯地平片（生產(chǎn)廠家：珠海潤都制藥股份有限公司；批號：20200701、20210301）；纈沙坦雜質(zhì)B（生產(chǎn)廠家：廣州雋沐生物科技股份有限公司；批號：DM19032510 ；含量：97.83%）；纈沙坦水解雜質(zhì)（ 生產(chǎn)廠家：廣州雋沐生物科技股份有限公司；批號：DM19011033 ；含量：99.49%）；纈沙坦乙酯（生產(chǎn)廠家：廣州雋沐生物科技股份有限公司；批號：DM18070911 ；含量：99.22%）；富馬酸氨氯地平有關(guān)物質(zhì)A（生產(chǎn)廠家：廣州雋沐生物科技股份有限公司；批號：DM18071201 ；含量：99.31%）；纈沙坦氨氯地平片（生產(chǎn)廠家：珠海潤都制藥股份有限公司；批號：20200701）；空白輔料（生產(chǎn)廠家：珠海潤都制藥股份有限公司；批號：PXA-1202008049）。甲醇、乙腈為色譜純，三乙胺、磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（WatersSymmetryC18，150 mm×3.9 mm，5μm）。流動相A：取三乙胺10 mL 加水至1000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.8。流動相B：甲醇-乙腈（7:3，V/V）。洗脫梯度見表1。檢測波長：237 nm。進(jìn)樣量：10 μL。流速：1.0 mL/min。柱溫：30℃。進(jìn)樣溫度：10℃。

表1 洗脫梯度

2.2 溶液配制

2.2.1 空白溶液/ 稀釋液 將流動相A 與流動相B等比例混合，即制得空白溶液/ 稀釋液。

2.2.2 對照品溶液 取纈沙坦、苯磺酸氨氯地平、已知雜質(zhì)對照品（纈沙坦水解雜質(zhì)、纈沙坦乙酯、富馬酸氨氯地平有關(guān)物質(zhì)A 對照品），用稀釋液分別配制成纈沙坦溶液（濃度為0.32 μg/mL）、氨氯地平溶液（濃度為0.20 μg/mL）、纈沙坦水解雜質(zhì)溶液（濃度為0.32 μg/mL）、纈沙坦乙酯溶液（濃度為0.32 μg/mL）、氨氯地平有關(guān)物質(zhì)A 溶液（濃度為0.5 μg/mL），即制得對照品溶液。氨氯地平與苯磺酸氨氯地平的換算因子為0.721（408.88/567.05），氨氯地平相關(guān)物質(zhì)A 與富馬酸氨氯地平相關(guān)物質(zhì)A 的換算因子為0.778（406.86/522.94）。

2.2.3 供試品溶液 取供試品（纈沙坦氨氯地平片）10 片，置于500 mL 的量瓶中，加稀釋液溶解后進(jìn)行定容、離心處理，取上清液作為氨氯地平供試品溶液，取上清液稀釋10 倍作為纈沙坦供試品溶液。

2.2.4 加樣供試品溶液 分別取供試品2 片、各已知雜質(zhì)對照品適量，置于100 mL 的量瓶中，加稀釋液溶解，定容至刻度，分別配制成纈沙坦水解雜質(zhì)溶液（濃度為1.6 μg/mL）、纈沙坦乙酯溶液（濃度為1.6 μg/mL）、氨氯地平相關(guān)物質(zhì)A 溶液（濃度為2.5 μg/mL）。對上述溶液進(jìn)行離心處理，取上清液作為氨氯地平加樣供試品溶液，取上清液稀釋10 倍作為纈沙坦加樣供試品溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性溶液 取各已知雜質(zhì)對照品適量，制成含纈沙坦雜質(zhì)B0.08 mg/mL、纈沙坦0.16 mg/mL、氨氯地平0.10 mg/mL 的溶液，即制得系統(tǒng)適用性溶液。

2.2.6 空白輔料溶液 取空白輔料95 mg，置于50 mL 的量瓶中，用稀釋液溶解，定容至刻度后進(jìn)行離心處理，取上清液作為空白輔料溶液。

2.2.7 線性儲備溶液 取纈沙坦、苯磺酸氨氯地平、已知雜質(zhì)對照品，用稀釋液分別配制成纈沙坦溶液（濃度為3.2 μg/mL）、氨氯地平溶液（濃度為2.0 μg/mL）、纈沙坦水解雜質(zhì)溶液（濃度為3.2 μg/mL）、纈沙坦乙酯溶液（濃度為3.2 μg/mL）、氨氯地平相關(guān)物質(zhì)A 溶液（濃度為5.0 μg/mL），即制得線性儲備溶液。

2.2.8 雜質(zhì)定位溶液 取已知雜質(zhì)對照品適量，分別配制成纈沙坦水解雜質(zhì)溶液（濃度為0.32 μg/mL）、纈沙坦乙酯溶液（濃度為0.32 μg/mL）和氨氯地平相關(guān)物質(zhì)A 溶液（濃度為0.5 μg/mL），即制得雜質(zhì)定位溶液。

2.2.9 已知雜質(zhì)回收率溶液 分別取已知雜質(zhì)對照品適量與本品4 片，置于200 mL 的量瓶中，分別配制成纈沙坦水解雜質(zhì)溶液（濃度為0.800 μg/mL）、纈沙坦乙酯溶液（濃度為0.795 μg/mL）、氨氯地平有關(guān)物質(zhì)A 溶液（濃度為0.052 μg/mL），將其作為定量限（Limit of Quantitation，LOQ）回收率溶液。同法配制成纈沙坦水解雜質(zhì)溶液（濃度為0.16 μg/mL）、纈沙坦乙酯溶液（濃度為0.16 μg/mL）、氨氯地平相關(guān)物質(zhì)A 溶液（濃度為0.25 μg/mL）作為50% 回收率溶液。同法配制成纈沙坦水解雜質(zhì)溶液（濃度為0.32 μg/mL）、纈沙坦乙酯溶液（濃度為0.32 μg/mL）、氨氯地平相關(guān)物質(zhì)A溶液（濃度為0.5 μg/mL）作為100% 回收率溶液。同法配制成纈沙坦水解雜質(zhì)溶液（濃度為0.48 μg/mL）、纈沙坦乙酯溶液（濃度為0.48 μg/mL）、氨氯地平相關(guān)物質(zhì)A 溶液（濃度為0.75 μg/mL）作為150% 回收率溶液。以上溶液各配制3 份。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性 精密量取“2.2”項(xiàng)下的系統(tǒng)適用性溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖。色譜圖見圖1。進(jìn)行系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)的結(jié)果顯示，系統(tǒng)適用性溶液中的其他成分對測定結(jié)果無干擾。

圖1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)圖譜

2.3.2 選擇性考察 精密量取“2.2”項(xiàng)下的空白溶液、空白輔料溶液、雜質(zhì)定位溶液、供試品溶液與加樣供試品溶液各10 μL，以空白溶液作對比，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行HPLC 檢測。檢測的結(jié)果顯示，空白溶液、空白輔料對檢測結(jié)果無干擾；供試品溶液、加樣供試品溶液中各峰的分離度均≥1.5，纈沙坦、氨氯地平的峰純度均為1000.0。這表明本檢測方法的選擇性良好。

2.3.3 強(qiáng)降解試驗(yàn)

2.3.3.1 破壞試驗(yàn) 取纈沙坦氨氯地平片2 片分別置于100 mL 的容量瓶中，加水10 mL 使其崩解，并按如下條件進(jìn)行破壞試驗(yàn)：1）酸：加1.0 mol/L 的鹽酸溶液10 mL，放置20 h。2）堿：加1.0 mol/L 的氫氧化鈉溶液10 mL，放置30 min。3）氧化：加30% 的過氧化氫溶液10 mL，放置90 min。4）光照：在照度為（4500lx±500lx）的光照箱中放置9 d。5）高溫：在80℃下放置140 h。完成上述操作后，將樣品放冷并將其pH 調(diào)至中性，加稀釋液至刻度線定容，搖勻后進(jìn)行離心處理，取上清液按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定。檢測結(jié)果見圖2。進(jìn)行破壞試驗(yàn)的結(jié)果表明，纈沙坦氨氯地平片經(jīng)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、高溫和光照破壞后，雜質(zhì)峰數(shù)目和面積顯著增加；所有雜質(zhì)峰均能與氨氯地平峰、纈沙坦峰完全分離。這表明本檢測方法的專屬性良好。

圖2 強(qiáng)降解試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3.2 雜質(zhì)歸屬 分別取2 片纈沙坦氨氯地平片當(dāng)量苯磺酸氨氯地平原料藥、纈沙坦原料藥、輔料，將其分別混合后得到待檢品苯磺酸氨氯地平原料藥、纈沙坦原料藥、氨氯地平原料藥+ 輔料、纈沙坦原料藥+ 輔料。每種待檢品均按照“2.3.3.1”項(xiàng)下的方法進(jìn)行破壞試驗(yàn)并實(shí)施HPLC 檢測，將檢測結(jié)果與“2.3.3.1”項(xiàng)下的結(jié)果對比即得到雜質(zhì)歸屬。詳見表2。

表2 纈沙坦氨氯地平片的雜質(zhì)歸屬

2.3.4 LOQ、檢測限與線性關(guān)系考察 配制各物質(zhì)濃度為對照品溶液3 倍的LOQ 儲備液，取一定量的LOQ 儲備液，用稀釋液逐步進(jìn)行稀釋，至信噪比≥10:1，搖勻即得到LOQ 溶液。精密量取檢測限（limit of detection，LOD）溶液3 mL，置于10 mL的量瓶中，用流動相A 稀釋至刻度并搖勻。精密量取LOQ 溶液與LOD 溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行HPLC 檢測。分別精密量取

線性儲備液5 mL、8 mL、10 mL、12 mL、15 mL，置于100 mL 的容量瓶中，用稀釋液定容至刻度，配制成濃度為50%、80%、100%、120%、150%的線性溶液。精密量取各線性溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行HPLC 檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程及線性范圍見表3。

表3 回歸方程及線性范圍

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號的供試品（批號為20200701），按照“2.2”項(xiàng)下的方法配制成纈沙坦加樣供試品溶液、氨氯地平加樣供試品溶液，平行配置6 份。精密量取各加樣供試品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行HPLC 測定。檢測的結(jié)果顯示，氨氯地平相關(guān)物質(zhì)A、纈沙坦水解雜質(zhì)、纈沙坦乙酯峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為3.82%、4.27%、3.72%，其他單個(gè)雜質(zhì)未檢出。這表明本檢測方法的重復(fù)性良好。

2.3.6 溶液穩(wěn)定性 按照“2.2”項(xiàng)下的方法配制加樣供試品溶液與對照品溶液，將上述兩種溶液在10℃的環(huán)境中儲存一定時(shí)間，分別在放置0 h、24 h、48 h 后精密量取溶液10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行HPLC 檢測，測試加樣供試品溶液與對照品溶液在10℃環(huán)境中的穩(wěn)定性。檢測的結(jié)果表明，加樣供試品溶液與對照品溶液在10℃的環(huán)境中放置48 h 的穩(wěn)定性良好。

2.4 主成分校正因子法

2.4.1 相對校正因子 按照“2.3.4”項(xiàng)下的線性關(guān)系考察試驗(yàn)，在不同人員、儀器、色譜柱條件下重復(fù)檢測2 次，根據(jù)所得線性關(guān)系式按照雜質(zhì)歸屬計(jì)算相對校正因子。相對校正因子=（主成分斜率/ 雜質(zhì)斜率）。取2 次線性關(guān)系考察校正因子的均值作為實(shí)際校正因子f，結(jié)果見表4。

表4 已知雜質(zhì)校正因子

2.4.2 不同色譜條件下校正因子法對有關(guān)物質(zhì)的測定 考察色譜條件的變化對纈沙坦氨氯地平片有關(guān)物質(zhì)檢出情況的影響。按照“2.2”項(xiàng)下的方法配制氨氯地平相關(guān)物質(zhì)A、纈沙坦水解雜質(zhì)、纈沙坦乙酯（濃度分別為0.257 μg/mL、0.1598 μg/mL、0.1736 μg/mL）加樣供試品溶液，考察流動相比例為52:48 和49.5:50.5、柱溫變化為±2℃、流速變化為±0.1 mL/min、不同批次的色譜柱對本品雜質(zhì)檢測結(jié)果及雜質(zhì)分離度的影響。結(jié)果表明，本品雜質(zhì)的檢測結(jié)果不受色譜條件變化的影響，主峰與鄰近雜質(zhì)峰及已知雜質(zhì)的分離度良好。上述條件下測得雜質(zhì)含量與實(shí)際含量的絕對變化值為：氨氯地平相關(guān)物質(zhì)A 的絕對變化值為0 ～0.02%，纈沙坦水解雜質(zhì)的絕對變化值為0 ～0.01%，纈沙坦乙酯的絕對變化值為0。其他未知的單個(gè)雜質(zhì)未檢出，總雜質(zhì)的絕對變化值為0 ～0.02%。測得雜質(zhì)含量大于0.05% 雜質(zhì)峰的個(gè)數(shù)一致，主峰純度均為1000.0。由此可見，本檢測方法的耐用性良好。

2.5 外標(biāo)法與主成分校正因子法測定

按照“2.2”項(xiàng)下的方法制備已知雜質(zhì)回收率溶液，每種濃度平行制備3 份，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別采用外標(biāo)法與主成分校正因子法進(jìn)行檢測，重復(fù)檢測3 次，得到回收率。取3 次測得回收率的平均值，采用SPSS 軟件對其進(jìn)行成對樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，采用外標(biāo)法與主成分校正因子法測得的纈沙坦氨氯地平片中已知雜質(zhì)的回收率相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表5。

表5 采用外標(biāo)法與主成分校正因子法測得纈沙坦氨氯地平片中已知雜質(zhì)回收率的對比

2.6 樣品中雜質(zhì)含量的測定

分別采用外標(biāo)法和主成分校正因子法對纈沙坦氨氯地平片中的已知雜質(zhì)進(jìn)行計(jì)算，除去苯磺酸的峰，其他所有未知雜質(zhì)均參照強(qiáng)降解試驗(yàn)雜質(zhì)歸屬表進(jìn)行雜質(zhì)歸屬。取2 批樣品（20200701，20210301）按照“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液并進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示纈沙坦水解雜質(zhì)、纈沙坦乙酯和其他單個(gè)未知雜質(zhì)均未檢出。采用外標(biāo)法進(jìn)行檢測時(shí)，氨氯地平相關(guān)物質(zhì)A 的含量分別為0.034% 和0.030%，單一最大雜質(zhì)的含量分別為0.034% 和0.030%，總雜質(zhì)的含量分別為0.034% 和0.030%。采用主成分校正因子法進(jìn)行檢測時(shí)，氨氯地平相關(guān)物質(zhì)A 的含量分別為0.036%和0.030%，單一最大雜質(zhì)的含量分別為0.036% 和0.030%，總雜質(zhì)的含量分別為0.036%和0.030%。

3 討論

本試驗(yàn)的設(shè)計(jì)參考了《美國藥典》（41 版）和相關(guān)的資料、文獻(xiàn)[6-8]。從本試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，采用外標(biāo)法與主成分校正因子法測定纈沙坦氨氯地平片中已知雜質(zhì)回收率的準(zhǔn)確性均良好，組間相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這說明采用上述兩種方法測定纈沙坦氨氯地平片中已知雜質(zhì)的含量具有良好的可行性和可靠性。但在對纈沙坦氨氯地平片中已知雜質(zhì)含量的限度考察中，主成分校正因子法減少了對照品的使用量，可實(shí)現(xiàn)以主成分為對照品進(jìn)行纈沙坦氨氯地平片中有關(guān)物質(zhì)含量的測定，在質(zhì)量評價(jià)中能大幅降低測定成本。

綜上所述，外標(biāo)法與主成分校正因子法均可用于測定纈沙坦氨氯地平片中已知雜質(zhì)的含量。但采用主成分校正因子法測定纈沙坦氨氯地平片中已知雜質(zhì)的含量更加方便、經(jīng)濟(jì)。