替考拉寧和萬(wàn)古霉素高效液相色譜手性固定相的研究

劉金月，蘇 鵬，祝金艷，艾 萍，袁黎明

(云南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650500)

所謂手性就是像人的左手與右手，互為實(shí)物與鏡像的關(guān)系，兩兩不能完全重合。如同手的這一特征，也廣泛存在于其他事物中，并且在生命的產(chǎn)生和演變過(guò)程中也有所體現(xiàn)[1]。分子是否是手性分子，其本質(zhì)是要判斷分子有無(wú)對(duì)稱(chēng)面和對(duì)稱(chēng)因素[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前用于臨床的藥物種類(lèi)約有3 500～4 000種，其中很大一部分藥物，是通過(guò)合成或半合成的生產(chǎn)方式制備的，在這些藥物中，約有40%以上并非僅由一種對(duì)映體組成，通常都是外消旋體[2]。在外消旋體藥物中，在大多數(shù)情況下只有其中的一種立體異構(gòu)體可用于臨床治療，而它的另一種旋光異構(gòu)體可能根本沒(méi)有療效，或者具有完全相反的藥效，甚至可能具有一定的毒副作用，對(duì)機(jī)體造成一些不可逆的損傷。隨著生活水平的提高，人們對(duì)低毒性高效用的藥品需求也越來(lái)越大，同時(shí)為了避免類(lèi)似“反應(yīng)停”悲劇事件的重演，各國(guó)特別是美國(guó)、日本、法國(guó)等國(guó)都極其重視對(duì)外消旋藥物的拆分[3-8]。采用現(xiàn)代分析方法進(jìn)行臨床醫(yī)學(xué)樣本的分析檢驗(yàn)，已經(jīng)成為生命科學(xué)中的一個(gè)重要領(lǐng)域，具有極大的臨床醫(yī)學(xué)價(jià)值[9]。早在20世紀(jì)90年代初，美國(guó)相關(guān)部門(mén)就規(guī)定：只要是研究具有旋光異構(gòu)體的藥物，必須對(duì)它的每一個(gè)對(duì)映體進(jìn)行藥理和毒理性質(zhì)研究和評(píng)估[10]。研究如何獲得純的對(duì)映體、并研究單一手性化合物的性質(zhì)具有重要的實(shí)用價(jià)值[11-13]。制備單一手性的手性固定相拆分外消旋體[14]與已有的手性分離的方法相比，HPLC因其高效性、低成本和重現(xiàn)性而被認(rèn)一種合適的方法，也被廣泛應(yīng)用在生產(chǎn)生活的各個(gè)領(lǐng)域[15-18]。

替考拉寧和萬(wàn)古霉素都是糖肽類(lèi)大環(huán)抗生素，它們的結(jié)構(gòu)上含有羥基、羧基、氨基等多種官能團(tuán)及孔穴結(jié)構(gòu)，并具有良好的立體選擇性，是非常有效的手性識(shí)別材料[19-20]。用不同的鍵合臂分別制備了四種HPLC替考拉寧和萬(wàn)古霉素CSP，并在反相模式和極性有機(jī)相模式下考察了這八種手性柱的性能。結(jié)果表明，固定相制備方法的不同和色譜條件的改變對(duì)色譜柱拆分性能有一定的影響。不相同的鍵合臂，能拆分的對(duì)映異構(gòu)體可能不一樣，這些柱之間具有一定的互補(bǔ)性，自制的八種色譜柱在手性分離方面有一定的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；Model 1666 Slurry Packer 高效液相色譜裝柱機(jī)(美國(guó)Alltech公司)；高效液相色譜儀(大連依利特)；XL30ESEM-TMP型掃描電子顯微鏡(荷蘭飛利浦公司)；PHS-25雷磁 pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；高純水機(jī)(英國(guó)ELGA Lab Water)；AL204 梅特勒-利托多電子天秤(上海梅特勒-利托多儀器有限公司)；DHG-9035A 電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；EYELA 磁力攪拌低溫恒溫水槽(PSL-1810，上海愛(ài)朗儀器有限責(zé)任公司)；紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器(SPD-15C，日本島津)；高壓恒流輸液泵(LC-15C，日本島津)；液相色譜勻漿裝柱機(jī)(液相色譜勻漿裝柱機(jī)，美國(guó)Alltech公司)；臺(tái)式低速離心機(jī)(TDZ5-WS，湘儀公司)；超聲波清洗儀(As3120，天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

試劑：色譜硅膠(Unisil 5-120，蘇州納微科技有限公司)；替考拉寧(蘇州法母進(jìn)出口有限公司)；3-(2,3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(>99%，Adamas試劑公司)；3-巰基丙基三甲氧基硅烷(>99%，Adamas試劑公司)；偶氮二異丁腈(AIBN)(>99%，Adamas試劑公司)；10-十一碳烯酰氯(>99%，Adamas試劑公司)；1,6-己二異氰酸酯、異氰酸丙基三乙氧基硅烷(>99%，上海阿達(dá)瑪斯試劑公司)；4, 4′-二苯基甲烷二異氰酸、3-氨丙基三乙氧基硅烷(>99%，上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司)；YQG80型球形硅膠(粒徑5 μm，購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)青島美高化工有限公司)；萬(wàn)古霉素在蘇州法母進(jìn)口有限公司購(gòu)買(mǎi)；2-乙氧基-1-乙氧碳?；?1,2-二氫喹啉(EEDQ，99%，上海共價(jià)化學(xué)科技有限公司)；手性化合物均購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；其余試劑均為分析純，均購(gòu)于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 固定相制備

替考拉寧手性固定相CSP-1的制備：參考文獻(xiàn)[21]的方法，稱(chēng)取1.6 g替考拉寧，用25 mL 無(wú)水吡啶-無(wú)水DMSO (1∶1，體積比，下同)，于60 ℃攪拌直至替考拉寧完全溶解后，加入2 g已經(jīng)活化好的硅膠，用超聲處理5 min 后，在N2保護(hù)下，緩慢加入0.4 mL異氰酸丙基三乙氧基硅烷，100 ℃反應(yīng)12 h，冷卻后分別用DMF、乙腈、甲醇洗滌反應(yīng)物，離心洗滌數(shù)次，60 ℃真空干燥至恒重備用。

替考拉寧手性固定相CSP-2的制備：參考文獻(xiàn)[22]的方法，同CSP-1的方法將替考拉寧溶解，在室溫下，小心加入0.3 mL 10-十一碳烯酰氯25 ℃反應(yīng)24 h，充分反應(yīng)后，向上述冷卻至室溫的溶液中，加入2.0 g已經(jīng)巰基化的硅膠和0.1 g偶氮二異丁腈，在N2保護(hù)下，升高溫度酯60 ℃，并保持24 h，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，洗滌、干燥方式同上，產(chǎn)物備用。

替考拉寧手性固定相CSP-3的制備：參考文獻(xiàn)[22]的方法，同CSP-1的方法將替考拉寧溶解，在室溫下，小心加入0.2 mL甲基丙烯酸異氰酸乙酯60 ℃反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫，在上述溶液中加入2 g巰基化硅膠和0.1 g偶氮二異丁腈，氮?dú)獗Ｗo(hù)下60 ℃反應(yīng)24 h，洗滌、干燥方式同上，產(chǎn)物備用。

替考拉寧手性固定相CSP-4的制備：參考文獻(xiàn)[23]的方法，稱(chēng)取1.6 g替考拉寧，用無(wú)水DMF溶解，加入已經(jīng)環(huán)氧丙氧基化的硅膠2 g，100 ℃反應(yīng)12 h，反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫后，洗滌、干燥方式同上，產(chǎn)物備用。

萬(wàn)古霉素手性固定相CSP-A的制備：將已經(jīng)氨丙基化的3 g硅膠中放入圓底燒瓶中，在冰浴、N2保護(hù)下加入50 mL干燥過(guò)的甲苯、2.5 mL1,6-己二異氰酸酯，將混合物在70 ℃油浴中反應(yīng)2 h，關(guān)掉加熱開(kāi)關(guān)，將裝置從油浴中提起，產(chǎn)物冷卻至25 ℃，產(chǎn)物分別用吡啶、乙腈、二氯甲烷洗滌多次，在60 ℃下減壓干燥備用。

萬(wàn)古霉素手性固定相CSP-B的制備：在N2保護(hù)下，依次在圓底燒瓶中加入2.5 g氨丙基硅膠、10 mL無(wú)水DMF、4, 4′-二苯基甲烷二異氰酸酯。將混合物在100 ℃油浴中反應(yīng)2 h后，待產(chǎn)物冷卻至25 ℃，用DMF離心洗滌3遍后移入燒瓶中，在N2保護(hù)下，加入萬(wàn)古霉素和25 mL無(wú)水DMF，在100 ℃下反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后丙酮、乙醇、甲醇洗滌多次，產(chǎn)物在60 ℃下真空干燥備用。

萬(wàn)古霉素手性固定相CSP-C的制備：在N2保護(hù)下，依次在圓底燒瓶中加入4 g氨丙基硅膠、萬(wàn)古霉素、EEDQ和20 mL無(wú)水DMF。將混合物在100 ℃油浴中反應(yīng)6 h后，待產(chǎn)物冷卻至25 ℃，依次用水、甲醇洗滌干凈，將固體于60 ℃ 抽真空干燥過(guò)夜，產(chǎn)物備用。

萬(wàn)古霉素手性固定相CSP-D的制備：用50 mL無(wú)水吡啶-無(wú)水DMSO (1∶1)溶解萬(wàn)古霉素成懸浮液，取2 g酸活化過(guò)的硅膠在圓底燒瓶中，在冰浴、N2保護(hù)下，加入溶解好的萬(wàn)古霉素懸浮液和少量的異氰酸丙基三乙氧基硅烷，將混合液在100 ℃油浴中反應(yīng)24 h，待產(chǎn)物冷卻至25 ℃，分別用甲醇、乙腈、二氯甲烷洗滌，最后在60 ℃下干燥，產(chǎn)物備用。

1.3 高效液相色譜柱的制備

采用高壓勻漿法，將上述制備好的八種固定相過(guò)250目篩，分別稱(chēng)取1.2 g固定相，以甲醇-水(90∶10，體積比，下同)溶液為頂替液，在壓力為40～50 MPa下裝柱，制得2.0 mm×250 mm的色譜柱。

1.4 儀器工作條件

檢測(cè)波長(zhǎng)210～254 nm，流動(dòng)相為甲醇-水(80∶20)、甲醇-水(60∶40)、甲醇-三乙胺(1 000∶0.03)、甲醇-冰醋酸(1 000∶0.03)，溶液流速為0.1 mL/min，柱溫25 ℃，色譜柱的分離特性用保留因子k、分離因子α1,2、分離度Rs評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與討論

2.1 手性固定相的元素分析

將色譜硅膠、8種手性固定相進(jìn)行元素分析表征，結(jié)果見(jiàn)表1。與色譜硅膠相比，所制備的手性固定相的氮、碳、氫三種元素的含量都有所增加，說(shuō)明替考拉寧和萬(wàn)古霉素已經(jīng)成功鍵合到硅膠上。

2.2 手性固定相的掃描電鏡(SEM)表征

將八種手性固定相做掃描電鏡表征，結(jié)果如圖1所示。從表征結(jié)果可以看出，八種手性固定相都是均勻的球形，符合液相色譜柱對(duì)固定相的要求，適用于高效液相色譜手性分離。

表1 元素分析測(cè)試結(jié)果

圖1 八種手性固定相的SEM表征Fig.1 SEM Characterization of eight chiral stationary phase

2.3 手性固定相的紅外表征

將空硅膠及八種手性固定相進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果如圖2所示。通過(guò)紅外光譜圖可知，四種替考拉寧固定相，在1 654 cm-1處酰胺羰基的特征吸收峰加強(qiáng)，結(jié)合元素分析說(shuō)明替考拉寧已經(jīng)鍵合到硅膠表面。四種萬(wàn)古霉素固定相，在2 900 cm-1左右均有C-H伸縮振動(dòng)，結(jié)合元素分析結(jié)果，萬(wàn)古霉素和硅烷化試劑已經(jīng)鍵合至硅膠表面上。

2.4 八種手性固定相拆分手性化合物

2.4.1 四種替考拉寧固定相手性拆分手性化合物

為了檢測(cè)4種替考拉寧固定相手性拆分性能，對(duì)手性化合物進(jìn)行拆分實(shí)驗(yàn)。以甲醇-水(85∶15，體積比，下同)作為流動(dòng)相，測(cè)量波長(zhǎng)為210 nm，此條件下用于拆分α-氨基酸；以甲醇-水(60∶40)作為流動(dòng)相，測(cè)量波長(zhǎng)為254 nm，此條件下用于拆分其他手性化合物，拆分結(jié)果如表2所示。

a.CSP-1 b.CSP-2 c.CSP-3 d.CSP-4 A:CSP-A; B:CSP-B; C:CSP-C; D:CSP-D; E:empty silica gel圖2 空硅膠及八種手性固定相的紅外表征圖Fig.2 Infrared characterization of emptysilica gel and eight chiral fixed phase

表2 CSP-1至CSP-4手性柱拆分手性化合物的結(jié)果

a代表流動(dòng)相條件為甲醇-水(85∶15)，b代表流動(dòng)相條件為甲醇-水(60∶40)

從表2中的結(jié)果可知CSP-1成功拆分了13種手性化合物，對(duì)苯甘氨酸、蛋氨酸、對(duì)羥基苯甘氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、天門(mén)冬酰胺、DNB-亮氨酸這7種達(dá)到基線分離；CSP-2成功拆分了13個(gè)手性化合物，其中苯甘氨酸、蛋氨酸、對(duì)羥基苯甘氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、脯氨酸、天門(mén)冬酰胺、纈氨酸、組氨酸這9種達(dá)到基線分離；CSP-3成功拆分了9個(gè)α-氨基酸，其中苯甘氨酸、對(duì)羥基苯甘氨酸這2種達(dá)到基線分離；CSP-4成功拆分了7個(gè)α-氨基酸，其中對(duì)羥基苯甘氨酸、蛋氨酸、苯甘氨酸這3種達(dá)到基線分離。

圖3為CSP-1至CSP-4拆分手性化合物的部分分離圖譜。

圖3 CSP-1至CSP-4拆分手性化合物的部分分離圖譜Fig.3 Partial separation map of CSP-1 to CSP-4 split chiral compounds

2.4.2 四種萬(wàn)古霉素固定相手性拆分手性化合物

為檢測(cè)四種萬(wàn)古霉素手性柱對(duì)手性化合物的拆分效果，實(shí)驗(yàn)分別采用了甲醇-水(80∶20，體積比，下同)、甲醇-三乙胺(100∶0.03)、甲醇-三氟乙酸(100∶0.03)、甲醇-冰醋酸(100∶0.03)作流動(dòng)相，流速0.1 mL/min，手性藥物紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，氨基酸為210 nm測(cè)試，其分離結(jié)果見(jiàn)表3。

分離結(jié)果顯示手性柱CSP-A拆分了8種手性化合物，其中氧氟沙星、扁桃酸、沙丁胺醇這3種手性化合物達(dá)到了基線分離，其余的5種手性化合物有不同程度的拆分；手性柱CSP-B拆分了9種手性化合物，其中噻嗎洛爾、鹽酸西替利嗪這2種手性化合物達(dá)到基線分離，其余7種手性化合物有不同程度的拆分；手性柱CSP-C拆分了5種手性化合物，其中1,2-二苯基-1,2-乙二醇、氨氯地平、二氫黃酮、酪氨酸這4種手性化合物達(dá)到基線分離，其余的手性化合物也有不同程度的拆分；手性柱CSP-D對(duì)5種手性化合物有不同程度的拆分。這四根手性柱在不同的模式之間有較好的互補(bǔ)性。萬(wàn)古霉素手性柱對(duì)流動(dòng)相的組成以及酸堿的添加比例都比較敏感，如果能選擇適當(dāng)?shù)哪Ｊ?，進(jìn)一步優(yōu)化這些參數(shù)，將會(huì)有更多的手性化合物被拆分開(kāi)。

表3 CSP-A至CSP-D手性柱拆分手性化合物的結(jié)果

c代表流動(dòng)相條件為甲醇-水(80∶20)、d代表流動(dòng)相條件為甲醇-三氟乙酸(100∶0.03)、e代表流動(dòng)相條件為甲醇-三乙胺(100∶0.03)、f代表流動(dòng)相條件為甲醇-冰醋酸(100∶0.03),k1、k2代表保留因子、α代表分離因子、Rs代表分離度

圖4是CSP-A至CSP-D拆分手性化合物的部分分離圖譜，圖譜如下所示：

圖4 CSP-A至CSP-D拆分手性化合物的部分分離圖譜Fig.4 Partial separation map of CSP-A to CSP-D split chiral compound

3 結(jié)論

所制備的八種手性固定相都表現(xiàn)出不同程度的手性拆分能力，特別是對(duì)α-氨基酸的拆分有較好的效果。四種不同的替考拉寧手性固定相相比較，CSP-1 在四種固定相中拆分的手性化合種類(lèi)最多；CSP-2拆分的手性化合物個(gè)數(shù)較前者少，但是其對(duì)同種手性化合物的分離性能優(yōu)于前者；其他2種固定相就拆分化合物的種類(lèi)及拆分性能而言，都稍遜色于前兩種固定相。替考拉寧手性固定相一共累計(jì)拆分了18種不同的手性化合物，其中有10種手性化合物達(dá)到了基線分離。四種不同的萬(wàn)古霉素手性固定相相比較，CSP-B 在四種固定相中拆分的手性化合種類(lèi)最多；CSP-A拆分的手性化合物個(gè)數(shù)次之；CSP-C雖然只拆分了5種手性化合物，但拆分效果較好；CSP-D拆分效果相對(duì)不佳，但也有一定拆分效果。萬(wàn)古霉素手性固定相一共累計(jì)拆分了18種不同的手性化合物，其中有9種手性化合物達(dá)到了基線分離。所制備的八種不同手性固定相，鍵合臂不同，能拆分的對(duì)映異構(gòu)體可能不一樣，這些柱之間具有一定的互補(bǔ)性，在高效液相色譜法拆分手性化合物中有一定的應(yīng)用前景。