膿毒癥患者早期外周血外泌體中miR-1-3p的表達(dá)分析

劉振密 劉曉君 王 熙 馬永輝 陳友蓮 陳懷生

暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/南方科技大學(xué)附屬醫(yī)院/深圳市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 (廣東 深圳 518020)

膿毒癥是重癥醫(yī)學(xué)科常見危重病，死亡率高，嚴(yán)重威脅著人類健康，病患年增長(zhǎng)量超過1900萬，死亡率超過25%[1]。膿毒癥最新的定義是感染引起的宿主反應(yīng)失控導(dǎo)致的致命性器官功能障礙，序貫器官功能評(píng)分(SOFA)≥2分[2]。膿毒癥的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其發(fā)病核心機(jī)制為全身炎癥反應(yīng)失衡。近來越來越多研究表明在全身炎癥反應(yīng)進(jìn)展期間，細(xì)胞分泌的外泌體在調(diào)節(jié)疾病進(jìn)展中起不同作用，而外泌體中不同生物功能成分包括蛋白質(zhì)、mRNA、微小RNA(microRNA，miRNA)，對(duì)膿毒癥的受損器官及其預(yù)后均有不同的影響[3]。外泌體是從內(nèi)吞細(xì)胞器釋放的納米級(jí)細(xì)胞外囊泡，稱為幾乎所有類型細(xì)胞的多囊泡體[4-5]。已知外泌體具有生物功能成分，包括蛋白質(zhì)，信使RNA(mRNA)和microRNA(miRNA)，并介導(dǎo)鄰近和遠(yuǎn)處細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊[6]。本研究通過檢測(cè)膿毒癥患者外周血中外泌體的miR-1-3P的表達(dá)水平，并監(jiān)測(cè)這些膿毒癥患者的血常規(guī)、C-反應(yīng)蛋白、降鈣素原(PCT)、白介素6(IL6)等指標(biāo)，了解膿毒癥患者外周血中外泌體的miR-1-3P的表達(dá)水平，并探討其與常用的炎癥指標(biāo)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料于2019年1月至2019年8月納入17例膿毒癥患者，其中男性11名，女性6名。年齡29～102歲，平均年齡(65±22)歲。APACHE Ⅱ評(píng)分(25.65±7.60)分，SOFA評(píng)分(11.06±5.53)分?；颊叩闹饕腥静课恢饕獮榉尾?、腹腔、血液等部位。另取9例健康志愿者作為對(duì)照組。研究獲本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，并簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合膿毒癥sepsis3.0[2]的膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡＞18歲；患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病，如心肺復(fù)蘇后、特重型顱腦損傷，預(yù)后極差，可能成為主要死因的病癥；預(yù)計(jì)24h內(nèi)死亡的患者；合并自身免疫性疾病。

1.2 治療與檢測(cè)患者進(jìn)入ICU后，根據(jù)感染情況選用抗感染藥物治療。如果休克，則給與早期液體復(fù)蘇治療，并根據(jù)患者病情選用機(jī)械通氣等生命支持?；颊叱Ｒ?guī)檢測(cè)血常規(guī)、C-反應(yīng)蛋白、降鈣素原(PCT)、白介素6(IL6)等指標(biāo)?；颊呒?例健康志愿者均留取2mL血樣，并3000r/min離心15min，取上清液，置于-80°C冰箱中備用。

將血清通過商業(yè)化試劑盒分別提取外周血中外泌體后，對(duì)外泌體中含有miR-1-3p表達(dá)進(jìn)行熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)，同時(shí)也對(duì)血漿外泌體中U6表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并以U6表達(dá)作為內(nèi)參。全部試驗(yàn)均為三復(fù)孔檢測(cè)，取其平均值。計(jì)算方法：先在對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組中，用目的基因平均Ct值減去內(nèi)參基因表達(dá)平均Ct值(ΔCt)，得到差值；然后以2為底數(shù)，以差值的相反數(shù)作為指數(shù)，計(jì)算其最終數(shù)值，從而得出該基因的相對(duì)表達(dá)量(2-ΔCt)；最后根據(jù)最終的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行做圖比較兩組之間表達(dá)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用(±s)表達(dá)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用四分位法表達(dá)。miR-1-3p與實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的關(guān)系研究采用雙變量相關(guān)分析。SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05提示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

17例患者的性別、年齡、診斷、評(píng)分系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)室檢查感染和炎癥相關(guān)的指標(biāo)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、降鈣素原(PCT)、超敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)和白介素6(IL-6)。記錄外泌體中miR-1-3p相對(duì)表達(dá)量，以及患者的臨床結(jié)局、ICU住院日和機(jī)械通氣日?；颊叩呐R床及實(shí)驗(yàn)室檢查特征見表1。

表1 膿毒癥患者臨床特征表

與健康者比較，膿毒癥患者的外周血外泌體中miR-1-3p相對(duì)表達(dá)量明顯增高(圖1)，膿毒癥患者外周血外泌體中miR-1-3p相對(duì)表達(dá)量增高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。

圖1 膿毒癥與健康對(duì)照者外周血外泌體miR-1-3p相對(duì)表達(dá)量差異。

健康對(duì)照者外周血外泌體miR-1-3p相對(duì)表達(dá)量與炎癥因子相關(guān)性研究，結(jié)果提示，患者外周血外泌體miR-1-3p相對(duì)表達(dá)量與外周血WBC、PCT、hsCRP缺乏相關(guān)性(p值均＞0.05)，而與IL-6具有明顯相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r=0.514，P=0.035，見圖2)。

圖2 膿毒癥患者外周血外泌體miR-1-3p相對(duì)表達(dá)量與IL-6相關(guān)。

3 討 論

膿毒癥為感染引起的宿主反應(yīng)失控，進(jìn)而導(dǎo)致危及生命的多器官功能障礙，嚴(yán)重危害人類健康。關(guān)于膿毒癥的發(fā)病機(jī)制有較多學(xué)說，目前普遍認(rèn)為感染導(dǎo)致的失控的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體的自身傷害作用才是膿毒癥發(fā)生的核心機(jī)制。雖然目前臨床與膿毒癥相關(guān)的生物標(biāo)志物有很多，但卻沒有一項(xiàng)生物標(biāo)志物能夠確切地反映膿毒癥患者的預(yù)后。隨著基礎(chǔ)研究的深入，發(fā)現(xiàn)人體的多種液體(包括血漿和尿液)的外泌體可被視為膿毒癥和炎性組織損傷的生物標(biāo)志物，外泌體中的miRNA在膿毒癥的炎癥反應(yīng)損傷及器官功能障礙有著不同的調(diào)節(jié)作用[3]。Goodwin等[7]的研究發(fā)現(xiàn)在人類膿毒癥中，隨著休克的發(fā)展，血漿miRNA發(fā)生明顯改變，觀察到發(fā)生休克的膿毒癥患者中miR-15a和miR-27a的下調(diào)以及miR-34a的上調(diào)，通過使用miRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行的生物信息學(xué)分析，提示miR-15a、miR-27a和miR-34a參與相關(guān)途徑(包括LPS-刺激的信號(hào)傳導(dǎo)，內(nèi)皮細(xì)胞周期，VEGF信號(hào)傳導(dǎo)和NF-κB信號(hào)傳導(dǎo))靶基因的調(diào)節(jié)。另外Wu等[8]報(bào)道內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)外泌體顯著改善了脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的內(nèi)皮血管通透性，并在體外和體內(nèi)均恢復(fù)了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，遷移和血管生成能力，通過功能喪失研究發(fā)現(xiàn)，富含EPC外泌體的miR-126可轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細(xì)胞上，并且對(duì)外泌體功能至關(guān)重要，這些發(fā)現(xiàn)表明EPC外泌體具有治療ALI/ARDS的治療潛力，其中外泌體miR-126通過負(fù)調(diào)節(jié)關(guān)鍵分子，如含發(fā)芽相關(guān)EVH1域的蛋白1(SPRED1)。所以，監(jiān)測(cè)患者血漿中miRNA的定量變化對(duì)膿毒癥的診斷、進(jìn)展和治療有重要意義。

如上所述，外泌體是從內(nèi)吞細(xì)胞器釋放的納米級(jí)細(xì)胞外囊泡，稱為幾乎所有類型細(xì)胞的多囊泡體，其生物功能成分包括蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA。而miRNA是一類由19至24個(gè)核苷酸單位組成的內(nèi)源性非編碼RNA分子，廣泛存在于真核生物中[9]。miRNA參與眾多生理病理過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移和損傷等。miR-1-3p是一種與多種惡性腫瘤進(jìn)展相關(guān)的miRNA，Shang等[10]研究證實(shí)與正常組織和細(xì)胞相比，膀胱癌組織和細(xì)胞的miR-1-3p和SFRP1的表達(dá)顯著降低，而人膀胱癌細(xì)胞系J82在這些表達(dá)中的降低最為明顯(P＜0.05)，MiR-1-3p上調(diào)膀胱癌細(xì)胞中SFRP1的表達(dá)，miR-1-3p的過表達(dá)可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，侵襲和遷移能力。而近年研究發(fā)現(xiàn)miR-1-3p與心血管疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)，張榮峰等[11]發(fā)現(xiàn)急性ST段抬高型心肌梗死患者血清中miR-1-3p相對(duì)表達(dá)量低于急性非ST段抬高型心肌梗死組，且與TC、LDL-C、NT-proBNP、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)程負(fù)相關(guān)。而本研究通過檢測(cè)本重癥醫(yī)學(xué)科17例膿毒癥患者的外周血外泌體中的miR-1-3p的表達(dá)量，通過與9例健康者對(duì)比發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者的外周血外泌體中miR-1-3p相對(duì)表達(dá)量明顯增高(圖1)，另外患者外周血外泌體miR-1-3p相對(duì)表達(dá)量與外周血WBC、PCT、hsCRP缺乏相關(guān)性(P＞0.05)，而與IL-6具有明顯相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r=0.514，P=0.035，圖2)。IL-6是由IL-1與腫瘤壞死因子-α (TNF-α)誘導(dǎo)產(chǎn)生的多效細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著核心調(diào)節(jié)功能，是關(guān)鍵的炎癥反應(yīng)遞質(zhì)。IL-6的檢測(cè)值在細(xì)菌感染時(shí)明顯升高，可以作為感染評(píng)估和檢測(cè)的常用指標(biāo)，且其水平與患者疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[12]。此外，IL-6對(duì)膿毒癥及病情嚴(yán)重程度的判定具有重要意義。有研究表明，膿毒癥患者血清 IL-6 水平顯著高于非膿毒癥患者，膿毒性休克患者血清IL-6水平顯著高于非膿毒性休克患者[13]。本研究膿毒癥患者外周血外泌體中miR-1-3p相對(duì)表達(dá)量明顯增高及其與炎癥因子IL-6的相關(guān)性，可能是miR-1-3p參與膿毒癥炎癥反應(yīng)調(diào)控的結(jié)果，可能成為膿毒癥預(yù)測(cè)的一個(gè)指標(biāo)，但其具體作用和機(jī)制需待進(jìn)一步深入研究。