HPLC法同時測定續(xù)斷藥材中7個成分的含量

楊昌貴 龔安慧 張成剛 肖承鴻 凡迪 周濤

中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）06-0680-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.06.06

摘 要 目的 建立同時測定續(xù)斷藥材中6個環(huán)烯醚萜類成分（馬錢苷酸、馬錢子苷、當藥苷、續(xù)斷苷B、續(xù)斷苷A、林生續(xù)斷苷Ⅰ）和1個三萜皂苷類成分（川續(xù)斷皂苷Ⅵ）含量的方法。方法 采用高效液相色譜（HPLC）法。以Symmetry? C18為色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，檢測波長為212 nm（川續(xù)斷皂苷Ⅵ）、237 nm（續(xù)斷苷B、續(xù)斷苷A、當藥苷、馬錢苷酸、林生續(xù)斷苷Ⅰ、馬錢子苷），柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。結(jié)果 馬錢苷酸、馬錢子苷、當藥苷、林生續(xù)斷苷Ⅰ、續(xù)斷苷B、續(xù)斷苷A、川續(xù)斷皂苷Ⅵ檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為399.24～931.56、50.30～150.90、48.24～168.84、27.00～70.20、12.93～38.80、40.64～121.92、42.08～147.28 μg/mL（r均大于0.999 0）;精密度、重復性、穩(wěn)定性（24 h）試驗的RSD均小于2%;平均加樣回收率分別為104.43%（RSD=0.63%，n=6）、101.74%（RSD=1.11%，n=6）、100.76%（RSD=1.06%，n=6）、98.00%（RSD=1.58%，n=6）、99.03%（RSD=2.31%，n=6）、102.93%（RSD=2.26%，n=6）、102.31%（RSD=1.00%，n=6）;含量分別為142.5～280.6、5.5～49.0、28.0～112.9、7.2～35.8、4.4～16.9、17.2～79.3、0.8～54.5 mg/g。結(jié)論 所建含量測定方法準確、可靠，可用于續(xù)斷藥材中7個成分的含量測定。

關(guān)鍵詞 續(xù)斷;含量測定;高效液相色譜法;三萜皂苷;環(huán)烯醚萜

Simultaneous determination of 7 components in Dipsacus asper by HPLC

YANG Changgui1，GONG Anhui2，ZHANG Chenggang1，XIAO Chenghong1，F(xiàn)AN Di3，ZHOU Tao1（1. Institute of Traditional Chinese Medicine and Ethnic Medicine Resources， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025， China; 2. Dept. of Pharmacy， Guizhou Health Vocational College， Guizhou Tongren 554300， China; 3. Guizhou Crop Technology Promotion Station， Guiyang 550001， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To establish the method for the simultaneous determination of six iridoids （loganic acid， loganin， sweroside， dipsanoside B， dipsanoside A， sylvestroside Ⅰ） and one triterpene saponin （asperosaponin Ⅵ） in Dipsacus asper. METHODS High performance liquid chromatography （HPLC） method was adopted. The determination was performed on Symmetry? C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelengths were set at 212 nm （asperosaponin Ⅵ） and 237 nm （dipsanoside B， dipsanoside A， sweroside， loganic acid， sylvestroside Ⅰ， loganin）. The column temperature was set at 30 ℃， and sample size was 20 μL. RESULTS The linear range of loganic acid， loganin， sweroside， sylvestroside Ⅰ， dipsanoside B， dipsanoside A and asperosaponin Ⅵ were 399.24-931.56， 50.30-150.90， 48.24-168.84， 27.00-70.20， 12.93-38.80， 40.64-121.92， 42.08-147.28 μg/mL（all r>0.999 0）. RSDs of precision， reproducibility and stability tests （24 h） were all less than 2%. Average recoveries were 104.43%（RSD=0.63%， n=6）， 101.74%（RSD=1.11%，n=6）， 100.76%（RSD=1.06%，n=6）， 98.00%（RSD=1.58%，n=6）， 99.03%（RSD=2.31%， n=6）， 102.93%（RSD=2.26%，n=6）， 102.31%（RSD=1.00%，n=6）， respectively， The contents were 142.5-280.6， 5.5-49.0， 28.0-112.9， 7.2-35.8， 4.4-16.9， 17.2-79.3， 0.8-54.5 mg/g， respectively. CONCLUSIONS Established method is accurate and reliable， and can be used for the content determination of 7 components in D. asper.

KEYWORDS? ?Dipsacus asper; content determination; high performance liquid chromatography; triterpene saponins; iridoids

續(xù)斷為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷Dipsacus asper Wall. ex Henry的干燥根，現(xiàn)收載于2020年版《中國藥典》（一部），具有補肝腎、強筋骨、續(xù)折傷、止崩漏的功效，用于治療肝腎不足、筋傷骨折、胎漏等癥[1]。川續(xù)斷資源豐富，廣泛分布于我國貴州、湖北、湖南、江西、廣西、云南、四川和西藏等地[2]。有研究表明，續(xù)斷主要含有三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜類、生物堿類、揮發(fā)油類等成分[3]。其中，三萜皂苷類和環(huán)烯醚萜類成分為該藥材的主要藥效成分[4]。三萜皂苷類成分主要包括川續(xù)斷皂苷Ⅵ、川續(xù)斷皂苷Ⅸ、川續(xù)斷皂苷Ⅹ、川續(xù)斷皂苷Ⅻ、灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙等[4-5]，具有修復和愈合骨損傷的作用[6-7]，尤以川續(xù)斷皂苷Ⅵ的研究較為深入?，F(xiàn)代藥理研究表明，川續(xù)斷皂苷Ⅵ可通過抑制軟骨基質(zhì)蛋白多糖分解來降低關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎癥介質(zhì)的表達，從而阻止關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)改變，延緩關(guān)節(jié)退變[8-10]。環(huán)烯醚萜類化合物的主要成分為當藥苷、馬錢苷酸、馬錢子苷、續(xù)斷苷A、續(xù)斷苷B、林生續(xù)斷苷Ⅰ等[4]，具有促進骨傷愈合、改善學習記憶、提高腦組織抗氧化的作用[10-12]。

2020年版《中國藥典》（一部）規(guī)定了續(xù)斷藥材中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量不得少于2.0%，同時亦規(guī)定了水分、總灰分、酸不溶性灰分分別不得過10.0%、12.0%、3.0%，水溶性浸出物不得少于45.0%[1]。此外，有學者對續(xù)斷的質(zhì)量進行了評價：馮汪銀等[13]以川續(xù)斷皂苷Ⅵ為質(zhì)量評價指標，比較了不同等級續(xù)斷藥材的質(zhì)量差異;魏慶紅等[14]以川續(xù)斷皂苷Ⅵ和總皂苷含量為評價指標，探討了不同加工工藝對續(xù)斷藥材質(zhì)量的影響。但上述研究的評價指標較為單一，不能全面表征藥材的整體質(zhì)量;加之續(xù)斷藥材所含藥效成分復雜，除川續(xù)斷皂苷Ⅵ外，馬錢苷酸、馬錢子苷、當藥苷、續(xù)斷苷A、續(xù)斷苷B及林生續(xù)斷苷Ⅰ這6個環(huán)烯醚萜類成分在續(xù)斷藥材中的含量也較高，且目前尚未見基于環(huán)烯醚萜類成分的質(zhì)量報道?；诖?，本研究擬采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法建立同時測定續(xù)斷藥材中6個環(huán)烯醚萜類成分（馬錢苷酸、馬錢子苷、當藥苷、續(xù)斷苷B、續(xù)斷苷A及林生續(xù)斷苷Ⅰ）和1個三萜皂苷類成分（川續(xù)斷皂苷Ⅵ）含量的方法，旨在為續(xù)斷藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有e2695型HPLC儀及配備的四元梯度輸液泵、二極管陣列檢測器、自動進樣器和柱溫箱（美國Waters公司），ME204型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，101-2AB型超聲清洗機（天津市泰斯特儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

馬錢苷酸、馬錢子苷、當藥苷、林生續(xù)斷苷Ⅰ、續(xù)斷苷B、續(xù)斷苷A、川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品均由山東省分析測試中心制備，通過核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance，1H-NMR）、核磁共振碳譜（13C nuclear magne- tic resonance，13C-NMR）、質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）法驗證結(jié)構(gòu)，并經(jīng)HPLC法檢測純度均大于98%（面積歸一化法）;乙腈、甲醇均為色譜純，乙醇、磷酸均為分析純，水為重蒸餾水。

6批續(xù)斷藥材（編號S-01～S-06）經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學藥學院江維克教授鑒定為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷D. asper Wall. ex Henry的干燥根。6批續(xù)斷藥材的來源信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以Symmetry? C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～5 min，10%A;5～12 min，10%A→13.3%A;12～23 min，13.3%A;23～45 min，13.3%A→37%A;45～55 min，37%A）;檢測波長為212 nm（川續(xù)斷皂苷Ⅵ）、237 nm（續(xù)斷苷B、續(xù)斷苷A、當藥苷、馬錢苷酸、林生續(xù)斷苷Ⅰ、馬錢子苷）;柱溫為30 ℃;流速為1.0 mL/min;進樣量為20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取續(xù)斷藥材樣品細粉，約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入20%乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，浸泡30 min后超聲（功率100 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用20%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置于25 mL量瓶中，用20%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液 取各對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，制成馬錢苷酸、馬錢子苷、當藥苷、林生續(xù)斷苷Ⅰ、續(xù)斷苷B、續(xù)斷苷A、川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量濃度分別為6.654、2.012、2.412、1.080、0.970、2.032、3.156 mg/mL的單一對照品儲備液。分別精密吸取上述各單一對照品儲備液1.5、0.9、0.8、0.9、0.4、0.8、0.4 mL，置于同一20 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得馬錢苷酸、馬錢子苷、當藥苷、林生續(xù)斷苷Ⅰ、續(xù)斷苷B、續(xù)斷苷A、川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量濃度分別為499.05、90.54、96.48、48.60、19.40、81.28、63.12 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 空白溶劑 以20%乙醇為空白溶劑。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、空白溶劑，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，理論板數(shù)按馬錢苷酸峰計均不低于5 000，各色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，各成分測定不受其他組分的干擾，空白溶劑對測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.2”項下馬錢苷酸對照品儲備液0.9、1.2、1.5、1.8、2.1 mL，置于15 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制得質(zhì)量濃度分別為399.24、532.32、665.40、798.48、931.56 μg/mL的馬錢苷酸系列工作溶液;精密吸取馬錢子苷對照品儲備液0.5、0.7、0.9、1.1、1.5 mL，置于20 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制得質(zhì)量濃度分別為50.30、70.42、90.54、110.66、150.90 μg/mL的馬錢子苷系列工作溶液;精密吸取當藥苷對照品儲備液0.4、0.6、0.8、1.0、1.4 mL，置于20 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制得質(zhì)量濃度分別為48.24、72.36、96.48、120.60、168.84 μg/mL的當藥苷系列工作溶液;精密吸取林生續(xù)斷苷Ⅰ對照品儲備液0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mL，置于20 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制得質(zhì)量濃度分別為27.00、37.80、48.60、59.40、70.20 μg/mL的林生續(xù)斷苷Ⅰ系列工作溶液;精密吸取續(xù)斷苷B對照品儲備液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置于15 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制得質(zhì)量濃度分別為12.93、19.40、25.87、32.33、38.80 μg/mL的續(xù)斷苷B系列工作溶液;精密吸取續(xù)斷苷A對照品儲備液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于20 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制得質(zhì)量濃度分別為40.64、60.96、81.28、101.60、121.92 μg/mL的續(xù)斷苷A系列工作溶液;精密吸取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品儲備液0.2、0.3、0.4、0.5、0.7 mL，置于15 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制得質(zhì)量濃度分別為42.08、63.12、84.16、105.2、147.28 μg/mL的川續(xù)斷皂苷Ⅵ系列工作溶液。取各工作溶液按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以各待測成分質(zhì)量濃度（x）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，結(jié)果見表2。

2.5 精密度試驗

取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，馬錢苷酸、馬錢子苷、當藥苷、林生續(xù)斷苷Ⅰ、續(xù)斷苷B、續(xù)斷苷A、川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積的RSD分別為0.51%、0.49%、0.44%、0.33%、0.33%、0.47%、0.84%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.1”項下供試品溶液（編號S-01），分別于室溫下放置0、2、4、6、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，馬錢苷酸、馬錢子苷、當藥苷、林生續(xù)斷苷Ⅰ、續(xù)斷苷B、續(xù)斷苷A、川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積的RSD分別為0.35%、1.56%、1.18%、1.89%、0.72%、1.94%、1.52%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗

精密稱取續(xù)斷藥材（編號S-01）粉末，每份約0.5 g，共6份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量。結(jié)果顯示，馬錢苷酸、馬錢子苷、當藥苷、林生續(xù)斷苷Ⅰ、續(xù)斷苷B、續(xù)斷苷A、川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量的RSD分別為1.20%、1.70%、1.78%、1.58%、1.78%、0.44%、1.36%（n=6），表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的續(xù)斷藥材（編號S-01）粉末，每份約0.25 g，共6份，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，分別精密加入“2.2.2”項下各單一對照品儲備液5.5、2.6、2.9、1.6、1.1、2.1、2.6 mL，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.9 樣品含量測定

精密稱取6批續(xù)斷藥材粉末，各約0.5 g，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量（質(zhì)量濃度若超出線性范圍，則適當稀釋或濃縮）。每樣品平行操作5次，取平均值，結(jié)果見表4。

3 討論

本課題組采用二極管陣列檢測器在190～800 nm波長范圍內(nèi)對7個待測成分進行掃描后發(fā)現(xiàn)，馬錢苷酸、馬錢子苷、當藥苷、林生續(xù)斷苷Ⅰ、續(xù)斷苷B、續(xù)斷苷A、川續(xù)斷皂苷Ⅵ的最大吸收波長分別為236、238、246、237、236、237、212 nm;為了檢測方便并能有效反映各成分含量，暫定川續(xù)斷皂苷Ⅵ的檢測波長為212 nm;馬錢苷酸等其余6個成分的檢測波長為237 nm。預實驗結(jié)果顯示，與在相應最大吸收波長條件下所得結(jié)果比較，在上述波長條件下所得各成分含量均無顯著差異，故選擇川續(xù)斷皂苷Ⅵ的檢測波長為212 nm，馬錢苷酸等其余6個成分的檢測波長為237 nm。系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果顯示，在該條件下，各色譜峰分離度良好、基線平穩(wěn)。同時，本課題組考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液2種流動相體系的分離效果。結(jié)果顯示，以乙腈-水為流動相時，續(xù)斷苷B、續(xù)斷苷A的色譜峰峰形欠佳且分離度較差;以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相時，馬錢苷酸等7個成分均能較好地分離，且出峰時間穩(wěn)定，故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相。此外，本課題組前期通過單因素實驗比較了不同體積分數(shù)（10%、20%、30%、40%、50%、75%、95%）乙醇超聲和回流的提取效果及對方法學考察的影響。結(jié)果顯示，當以10%乙醇為溶劑時，方法的重復性較差;當以20%乙醇為溶劑時，馬錢苷酸等7個成分含量和方法穩(wěn)定性均較優(yōu)。同時，筆者發(fā)現(xiàn)，超聲提取和回流提取的效果相當，從操作的簡便性和方法的重復性考慮，本研究選擇超聲提取。在此基礎(chǔ)上，本課題組還考察了不同超聲處理方式（浸泡30 min后超聲處理、直接超聲處理）、提取時間（50、40、30、20 min）對提取效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將藥材浸泡30 min后再超聲處理的提取率和方法的重復性均優(yōu)于直接超聲處理;提取20～50 min時，馬錢苷酸等7個成分的含量無顯著差異。綜合考慮，本研究選擇20%乙醇為溶劑，浸泡30 min后超聲提取30 min。

本研究結(jié)果顯示，馬錢苷酸、馬錢子苷、當藥苷、林生續(xù)斷苷Ⅰ、續(xù)斷苷B、續(xù)斷苷A、川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量分別為142.5～280.6、5.5～49.0、28.0～112.9、7.2～35.8、4.4～16.9、17.2～79.3、0.8～54.5 mg/g，提示7個成分含量存在較大差異，平均含量最高的為馬錢苷酸（201.2 mg/g），最低的為續(xù)斷苷B（10.1 mg/g），二者平均含量相差近20倍。從7個成分的總量來看，總含量最高的為成都荷花池藥材市場的樣品（S-04，526.2 mg/g），最低的為貴州威寧彝族回族苗族自治縣的樣品（S-01，258.2 mg/g），含量相差近2倍。不同批次藥材間7個成分的含量亦存在顯著差異，如從馬錢苷酸含量來看，成都荷花池藥材市場樣品的含量最高（S-04，280.6 mg/g），廣州清平藥材市場樣品的含量最低（S-05，142.5 mg/g），二者含量相差近2倍，其原因可能與樣品的產(chǎn)地環(huán)境和加工炮制方式有關(guān)。有研究表明，不同產(chǎn)地續(xù)斷藥材中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量差異較大，可達10倍以上[15]，其含量與產(chǎn)地海拔呈正相關(guān)[16];此外，不同炮制方法會影響續(xù)斷中馬錢苷酸、川續(xù)斷皂苷乙、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、綠原酸等成分的含量，加工方式的不同可造成川續(xù)斷皂苷乙、綠原酸成分含量相差近20倍[17-18]。

中藥成分復雜，其藥效的發(fā)揮往往是多個成分協(xié)同作用的結(jié)果，若僅以一、兩個成分作為質(zhì)量評價指標難以反映藥材的真實質(zhì)量，而采用多指標評價的方法可更全面地表征藥材質(zhì)量，故多成分的含量測定已成為中藥材質(zhì)量評價的發(fā)展趨勢[19]。本研究所建續(xù)斷藥材中馬錢苷酸等7個成分含量的檢測方法，不僅包括了2020年版《中國藥典》（一部）規(guī)定的指標成分川續(xù)斷皂苷Ⅵ的測定，同時還對具有藥理活性的6個環(huán)烯醚萜類成分（馬錢苷酸、馬錢子苷、當藥苷、林生續(xù)斷苷Ⅰ、續(xù)斷苷B、續(xù)斷苷A）進行了同時檢測，可以更加全面地反映續(xù)斷藥材的內(nèi)在質(zhì)量。

綜上所述，本研究所建含量測定方法準確、可靠，可用于續(xù)斷藥材中7個成分的含量測定。

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（收稿日期：2021-11-08 修回日期：2022-02-05）

（編輯：陳 宏）