糖脂清方對高糖誘導HT22細胞損傷的保護作用

石崯力，王旭，趙云，邱玲艷，徐奚如，孫斯凡

（南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210029）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種復(fù)雜、普遍的全球性慢性疾病，DM 患者中約有90%為2型糖尿?。═2DM）。糖尿病合并認知功能障礙（diabetic cognitive dysfunction，DCD）是由于T2DM 病情進展對患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)所造成的不同程度的損害，具體表現(xiàn)為學習和空間能力減退、注意力不集中、健忘，嚴重可導致不可逆性癡呆［1］，發(fā)病率約為30%［2］，具有病程長、難治愈、預(yù)后差的特點，對患者的生存和預(yù)后帶來不同程度影響。海馬是學習記憶的重要神經(jīng)中樞，其結(jié)構(gòu)、功能變化在DCD 的發(fā)生和發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，海馬區(qū)神經(jīng)元異常凋亡會導致衰老大鼠出現(xiàn)不同程度的學習和記憶障礙［3］。在持續(xù)性高血糖環(huán)境下海馬區(qū)星形膠質(zhì)細胞可出現(xiàn)不同程度損傷，引起細胞功能和形態(tài)上的變化，細胞內(nèi)活性氧累積、凋亡增加、神經(jīng)炎性反應(yīng)增強，導致神經(jīng)毒性改變。此外，細胞自噬異常與細胞凋亡密切關(guān)聯(lián)［4］。適度的自噬可以調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)電活動從而抑制細胞凋亡。然而，過度自噬也會導致細胞程序性死亡［5］，這與高糖誘導海馬區(qū)細胞損傷致使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（endoplasmic reticulum stress，ERS）加重，誘發(fā)蛋白啟動未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）密切相關(guān)［6］。基于上述研究，人們認為海馬區(qū)域神經(jīng)元凋亡和過度自噬可能與認知障礙有著潛在關(guān)聯(lián)，通過某種方式抑制海馬神經(jīng)元的凋亡、氧化應(yīng)激和過度自噬是改善學習和記憶缺陷的一種新策略。

“糖脂清”（TZQ）由黃精、鬼箭羽、枸杞子、澤蘭、炒僵蠶5 味中藥組成。方中黃精補氣養(yǎng)陰、健脾益腎，鬼箭羽活血化瘀，枸杞子益氣滋腎、補肝明目，澤蘭活血祛瘀、利水消腫，炒僵蠶熄風止痙、祛風止痛、化痰散結(jié)，全方共奏補腎活血化瘀、理氣化痰通絡(luò)之效，是王旭教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗與中醫(yī)基礎(chǔ)理論相結(jié)合創(chuàng)制的中醫(yī)經(jīng)驗方，并獲得國家專利（101829271A）?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃精、鬼箭羽、枸杞子均具有改善糖脂代謝紊亂、提高免疫力、抗炎抗氧化和調(diào)節(jié)免疫的功效［7－9］；澤蘭在保肝、降低血脂、抗凝血和抗氧化等方面效果良好［10］；僵蠶具有保護神經(jīng)元、抗炎、抗驚厥和抗凝的作用［11］。前期研究表明［12－14］，TZQ 不僅能顯著降低糖尿病大鼠血糖水平，改善胰島素抵抗，修復(fù)胰島素信號通路以改善糖脂代謝水平，還可調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)應(yīng)激因子和蛋白的表達，抑制海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡，改善DCD 大鼠記憶能力，但具體效果和作用機制仍不明確。本研究將從體外實驗層面驗證TZQ 通過降低神經(jīng)元凋亡、改善氧化應(yīng)激水平和調(diào)控自噬層面對高糖誘導下HT22 細胞的具體作用機制，明確TZQ 治療DCD 的療效，為其可能成為改善DCD 有效且可行的候選藥物提供理論支持。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

18 只Wistar 大鼠，由青龍山動物養(yǎng)殖場提供，動物實驗符合南京中醫(yī)藥大學倫理委員會標準，編號：012071001686。大鼠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學動物實驗動物中心的清潔動物飼養(yǎng)室，溫度18～25 ℃，濕度40%～55%，12 h/12 h晝夜交替光照，噪聲<60 dB。

1.2 細胞株

小鼠HT22 海馬神經(jīng)元細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 實驗藥物及試劑

TZQ組成：黃精、炒僵蠶、鬼箭羽、枸杞子、澤蘭，全部中藥飲片購于江蘇省中醫(yī)院中藥房，符合2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）及相關(guān)項下規(guī)定。按照人與大鼠體表面積換算系數(shù)6.75 大鼠的等效劑量［15］，將成人每日每公斤體重用藥量的10 倍作為低劑量組，成人每日每公斤體重用藥量的20 倍作為中劑量組，成人每日每公斤體重用藥量的40 倍作為小鼠高劑量組，選用中藥水煎劑，將黃精、炒僵蠶、鬼箭羽、枸杞子、澤蘭浸泡30 min 后，煎煮成濃度為含生藥量1.2 g/mL 的湯劑，4 ℃保存?zhèn)溆?。給藥前將藥物復(fù)溫至室溫使用。取一定量的鹽酸二甲雙胍置于已滅菌的10 mL 離心管，以雙蒸水作為溶劑配置成1 mg/mL 的二甲雙胍母液，充分振蕩混勻并使用0.22 μm 濾頭過濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

超氧化物歧化酶測定試劑盒（批號：A001－3）、丙二醛測試盒（批號：A003－1）、乳酸脫氫酶試劑盒（批號：A020－2）購自南京建成生物工程研究所；RIPA 裂解液（批號：P0013B）、脫脂奶粉（批號：P0216）、青霉素-鏈霉素溶液（批號：C0222）、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（H+L）（批號：A0216）、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（批號：A0208）、Caspase－3 一抗（批號：AC030）、Bax 一抗（批號：AB026）、Bcl－2一抗（批號：AB112）、Hoechst 33342 染色液（批號：C1025）、PBS（批號：C0221A）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；JNK 一抗（批號：66210－1－Ig）、Lamp2 一抗（批號：66301－1－Ig）、SIRT1（批號：60303－1－Ig）購自武漢三鷹生物科技有限公司；β－actin 一抗（批號：bs－0061R）購自Bioss 公司；鹽酸二甲雙胍（批號：419K025）、4%多聚甲醛（批號：20170323）購自Solarbio公司；DMEM 培養(yǎng)基（批號：8121441）、0.25%Trypsin－EDTA（批號：2186974）、胎牛血清（批號：SA210407）購 自Gibco 公 司；TritonX－100（批 號：MKBW1852V）購自Sigma 公司；Alexa 488 耦聯(lián)親和純化山羊抗小鼠IgG（H + L）（批號：K1204）購自APE BIO公司。

1.4 主要儀器

恒溫CO2培養(yǎng)箱（HERAcell 150i）；凝膠成像系統(tǒng)（ImageQuant LAS 4 000mini）；Western Blot 電泳槽（上海天能科技有限公司）；多功能酶標儀（PE enspire）；高速冷凍離心機（Eppendorf，Centrifuge 5 430R）；臺式恒溫振蕩器（中國上海精宏實驗設(shè)備有限公司，THZ－312）；生物熒光倒置顯微鏡（日本Olympus BX43）；天平（德國賽多利斯E200）。

2 方法

2.1 含藥血清的制備

將18 只Wistar 大鼠以大鼠維持飼料（碳水化合物60%、蛋白質(zhì)22%、脂肪4.0%）飼養(yǎng)，自由進食、飲水。正式實驗開始前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按照隨機數(shù)字表隨機分為正常組、二甲雙胍組、TZQ低劑量組、TZQ中劑量組、TZQ 高劑量組，二甲雙胍組給藥劑量為0.3 g/kg［16］，按照“1.3”項下計算出TZQ 低、中、高劑量組給藥劑量分別為4.5、9、18 g/kg，每日分2次給藥，正常組給予等量生理鹽水灌胃。灌胃第7 天下午于給藥90 min 后取各組大鼠腹主動脈血10～15 mL，3 000 r/min 離心15 min，取上清液，56 ℃水浴箱中30 min滅活，0.22 μm過濾器除菌，后放置于－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 HT22細胞培養(yǎng)

配置海馬神經(jīng)元細胞株HT22 使用含有10%胎牛血清、1%青霉素－鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，水浴復(fù)蘇凍存的HT22 細胞，置于37 ℃，正常培養(yǎng)條件下（氣體參數(shù)設(shè)置為：21%O2、74%N2、5%CO2）的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待HT22 細胞密度達到80%左右，將細胞均勻鋪板至6 孔板、12 孔板、96 孔板中進行后續(xù)實驗。將對數(shù)生長期的HT22 細胞，小心倒掉上清培養(yǎng)基，用PBS 清洗2 次，每次時間為1 min，棄去PBS，加入1 mL的0.25% 胰酶，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行消化30 s～1 min，用培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打、重懸，后轉(zhuǎn)移至高速離心機以1 000 rpm/min離心3.5 min，離心完畢后棄上清，加入3 mL培養(yǎng)基進行傳代和接種。

2.3 CCK－8 法檢測不同濃度葡萄糖對HT22 細胞活力的影響

取對數(shù)生長期的HT22 細胞，經(jīng)消化、吹打、離心后，以5 × 104/mL 的密度均勻接種于96 孔板中，用25、50、100、125、150、200、225、250、300 mmol/L 濃度葡萄糖干預(yù)細胞，分別干預(yù)24 h和48 h，并另外設(shè)置空白孔（不含有細胞僅含有培養(yǎng)基），每組細胞平行設(shè)置5個復(fù)孔。處理結(jié)束后每孔加10 μL的CCK－8試劑，37 ℃細胞培養(yǎng)箱孵育1～1.5 h，使用酶標儀于450 nm 波長處讀取各組細胞光密度（OD）值。以濃度－生存曲線作出回歸方程由此求出半數(shù)致死濃度（lethal concentration 50，LC50）。細胞活力計算公式如下：

細胞存活率（%）=（實驗組OD均值－空白組OD均值）/（對照組OD均值－空白組OD均值）×100%

2.4 實驗分組與給藥

待細胞生長穩(wěn)定，均勻接種在6 孔板中，每孔2 mL，待HT22 細胞生長穩(wěn)定后進行分組，具體分為：空白組（Con）、模型組（DM）、二甲雙胍含藥血清組（Met）、低劑量含藥血清組（TZQ－L）、中劑量含藥血清組（TZQ－M）、高劑量含藥血清組（TZQ－H），小心將6 孔板內(nèi)的完培吸出，按照“2.3”項下篩選出的最適造模濃度的高糖培養(yǎng)液分別作用于各組造模細胞，Con 組加入等體積正常糖濃度培養(yǎng)液，干預(yù)時間為CCK－8實驗所篩選出的時間，造模時間結(jié)束后吸出培養(yǎng)液，加入含有不同劑量含藥血清的完全培養(yǎng)基干預(yù)24 h，待給藥結(jié)束后置于高倍顯微鏡下，觀察不同組別之間細胞形態(tài)變化，然后提取細胞上清和蛋白進行后續(xù)實驗檢測。

2.5 檢測指標

2.5.1 各組細胞超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LDH）含量測定

待細胞生長穩(wěn)定，均勻接種在12 孔板中，每孔1 mL，分組造模與給藥步驟同前。待HT22 細胞造模、給藥完畢后，吸取每組細胞上清，4 ℃環(huán)境下以2 000 r/min 速度離心10 min，使用SOD、MDA、LDH 試劑盒說明書操作加樣、孵育，每組細胞測定孔均設(shè)置5 個復(fù)孔，并提前打開酶標儀，以空白孔為調(diào)零孔，450 nm 波長依次測量每孔OD 值，測定數(shù)值應(yīng)快速完成。根據(jù)OD 值計算每組細胞SOD、MDA、LDH 含量水平，并與總蛋白含量進行歸一化處理，比較各組細胞SOD、MDA、LDH水平。

2.5.2 免疫熒光染色和Hoechst 33342 染色法檢測各組細胞Lamp2表達和細胞凋亡水平

待細胞生長穩(wěn)定，均勻接種在24 孔板中，每孔1 mL，分組造模與給藥步驟同前。用PBS洗滌3遍，4%多聚甲醛固定30 min，用0.1%Triton室溫孵育10 min，后于Blocking Buffer 中室溫封閉30 min～1 h，加入稀釋過的一抗，4 ℃中反應(yīng)過夜。37 ℃復(fù)溫后用PBS 清洗3 遍，加入稀釋后的二抗，于避光濕盒中室溫孵育作用1 h，最后至正置熒光顯微鏡下觀察Lamp2 表達情況。染色結(jié)束后棄去孔內(nèi)液體，PBS 洗滌3 次，在室溫條件下加入適量Hoechst 33342 染色液，再置于熒光顯微鏡下拍照觀察。

2.5.3 Western Blot 法檢測各組HT22 細胞Bax、Bcl－2、Caspase－3、SIRT1和JNK蛋白表達

每組細胞加入含PMSF 的RIPA 裂解液將組織徹底破碎裂解，12 000 r/min 離心15 min，吸取剩余上清，加入5 × protein loading buffer 100 ℃變性5 min。采用6%～12%SDS－PAGE 膠進行蛋白電泳。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至0.45 μm PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉，根據(jù)抗體說明書稀釋抗體，孵育Bax（1∶1 000）、Bcl－2（1∶1 000）、Caspase－3（1∶1 000）、SIRT1（1∶1 000）、JNK（1∶3 000）一抗，同時孵育β－actin（1∶5 000）抗體作為內(nèi)參，孵育相應(yīng)二抗（1∶1 000）。加ECL 化學發(fā)光底物顯色，用化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行顯影，ImageJ 軟件分析目的條帶的凈光密度值。

2.6 統(tǒng)計學方法

用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)± 標準差（±s）表示，并進行正態(tài)分布檢驗。多組間的比較采用方差分析和重復(fù)檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，樣本不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗，以P< 0.05 代表差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 CCK－8檢測結(jié)果

使用25～300 mmol/L的高糖梯度培養(yǎng)基分別作用于HT22 細胞24 h 和48 h 后，結(jié)果表明24 h 時，細胞存活率隨葡萄糖濃度的增加開始下降，但此時下降程度較為緩慢，當葡萄糖濃度為50 mmol/L 和100 mmol/L時，與25 mmol/L濃度相比其存活率之間的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），當葡萄糖濃度大于100 mmol/L 時，存活率較25 mmol/L 濃度相比差異具有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。48 h 時，細胞存活率隨葡萄糖濃度的增加而顯著降低（P< 0.01），葡萄糖濃度為225 mmol/L和250 mmol/L 時，細胞存活率分別下降至（56.33 ±3.22）%和（49.09 ± 3.13）%，差 異有統(tǒng)計學 意義（P< 0.01），其logIC50= 238.5 mmol/L。因此，在后續(xù)實驗中，選擇225 mmol/L的高糖培養(yǎng)基為構(gòu)建HT22細胞損傷模型所用最佳濃度。見表1。

表1 不同糖濃度環(huán)境下處理的HT22細胞存活率（±s，%）

表1 不同糖濃度環(huán)境下處理的HT22細胞存活率（±s，%）

注：與25 mmol/L同一時間相比，*P<0.05，**P<0.01。

濃度（mmol/L）25 50 100 125 150 200 225 250 300 48 h 102.10±0.94 90.46±2.18**80.42±1.79**79.14±1.39**75.15±2.46**63.93±1.20**56.33±3.22**49.09±3.13**31.17±0.76**n5 5 5 5 5 5 5 5 5 24 h 100.00±3.00 94.10±3.03 90.44±1.60 85.74±2.85*85.75±3.93*79.31±2.67**76.86±3.90**68.92±4.64**33.42±0.90**

3.2 各組HT22細胞形態(tài)變化比較

在正常濃度下培養(yǎng)的HT22 細胞間隙小，排列緊密，突觸數(shù)量多，密度大，網(wǎng)絡(luò)發(fā)達。經(jīng)48 h 高糖培養(yǎng)基干預(yù)后，DM 組HT22 細胞出現(xiàn)細胞間隙變寬，排列疏松，密度小，鏡下細胞密度減弱，形態(tài)及生長受到抑制。經(jīng)二甲雙胍和不同濃度TZQ 含藥血清干預(yù)后的神經(jīng)細胞在形態(tài)、生長和排列分布方面都有一定程度的改善。見圖1。

圖1 各組HT22細胞形態(tài)變化（Bar=50 μm）

3.3 各組對高糖誘導HT22 細胞氧化應(yīng)激損傷的作用

給藥24 h 后測定各組HT22 的抗氧化活性，結(jié)果顯示DM 組SOD 含量顯著低于Con 組（P<0.01），MDA和LDH 含量顯著高于Con 組（P<0.01）。經(jīng)過藥物干預(yù)后，Met組和各劑量TZQ含藥血清組SOD與DM組相比明顯升高（P< 0.01），MDA 和LDH 水平明顯降低（P<0.01）。表明應(yīng)用不同濃度的TZQ 進行干預(yù)對高糖誘導下HT22 細胞的氧化損傷可起到一定程度的保護作用。見表2。

表2 各組HT22細胞氧化應(yīng)激損傷參數(shù)水平比較（±s）

表2 各組HT22細胞氧化應(yīng)激損傷參數(shù)水平比較（±s）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

組別Con組DM組Met組TZQ－L組TZQ－M組TZQ－H組LDH（U/L）249.30±37.99 768.80±66.11##399.70±7.17**325.40±38.55**403.20±16.40**410.30±13.95**n 6 6 6 6 6 6 SOD（U/mgprot）63.16±7.11 6.95±2.24##13.49±1.00 41.43±9.64**46.53±6.04**50.06±4.46**MDA（nmol/mgprot）2.52±0.46 10.60±1.19##2.41±0.35**1.80±0.37**2.79±0.43**1.68±0.37**

3.4 各組HT22細胞Lamp2表達水平比較

通過細胞免疫熒光檢測各組HT22 細胞Lamp2 表達情況。結(jié)果顯示，與Con組比較，DM 組HT22細胞內(nèi)溶酶體膜損傷，熒光強度降低；經(jīng)過二甲雙胍和TZQ中、高劑量含藥血清干預(yù)后HT22 細胞溶酶體的破損得到一定程度的修復(fù)，Lamp2表達量增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P< 0.05），而TZQ－L 組與DM 組相比Lamp2 表達量無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）。見圖2、表3。

表3 各組HT22細胞Lamp2熒光定量水平比較（±s）

表3 各組HT22細胞Lamp2熒光定量水平比較（±s）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別Con組DM組Met組TZQ－L組TZQ－M組TZQ－H組Mean fluorescence per cell（Fold of Con）1.000±0.007 0.050±0.006##0.260±0.009**0.160±0.030 0.200±0.030*0.290±0.040**n3 3 3 3 3 3

圖2 免疫熒光法檢測各組HT22細胞Lamp2表達（Bar=50 μm）

3.5 各組HT22細胞凋亡水平比較

Con 組HT22 細胞核凋亡少，細胞膜完整，細胞質(zhì)分布均勻，可見散在低藍色分布；DM 組細胞膜受到破壞，膜通透性增加，細胞核凋亡增加，鏡下可見高亮藍色規(guī)則或不規(guī)則形狀點；經(jīng)二甲雙胍和不同濃度TZQ 含藥血清干預(yù)后，細胞核凋亡得到一定程度的改善，細胞趨于正常，亮藍色熒光變暗變少。見圖3。

圖3 各組HT22細胞凋亡情況（Bar=50 μm）

3.6 各組HT22 細胞Bax、Bcl－2、Caspase－3、JNK 和SIRT1蛋白表達比較

與Con組相比，DM組Bax、Caspase－3、JNK、SIRT1蛋白表達水平顯著增加（P< 0.05），Bcl－2 蛋白表達水平顯著下降（P< 0.05），經(jīng)二甲雙胍和不同濃度TZQ 含藥血清干預(yù)后，與DM 組相比，Met 組可顯著下調(diào)SIRT1 蛋白的表達水平（P< 0.01），TZQ－L 組Bax表達量顯著下調(diào)（P<0.05），TZQ－H 組Bcl－2蛋白表達量顯著上調(diào)（P< 0.05），其余各組在調(diào)控蛋白表達方面與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義。而在Caspase－3、JNK 和SIRT1 蛋白的調(diào)控上，各劑量含藥血清組均能下調(diào)其表達水平，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。表明二甲雙胍和TZQ 含藥血清的干預(yù)能在一定程度延緩高糖環(huán)境下HT22 神經(jīng)細胞損傷，其機制可能與抑制神經(jīng)元凋亡和自噬存在關(guān)聯(lián)，見表4、圖4。

圖4 各組細胞Bax、Bcl－2、Caspase－3、JNK和SIRT1相關(guān)蛋白表達

表4 各組細胞Bax、Bcl－2、Caspase－3、JNK和SIRT1蛋白表達量比較（±s）

表4 各組細胞Bax、Bcl－2、Caspase－3、JNK和SIRT1蛋白表達量比較（±s）

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

SIRT1/actin 0.73±0.02 1.63±0.08##1.08±0.08**0.80±0.05**0.89±0.15*0.71±0.23*組別Con組DM組Met組TZQ－L組TZQ－M組TZQ－H組n3 3 3 3 3 3 Bax/actin 1.12±0.09 1.88±0.24#1.39±0.19 1.13±0.12*1.25±0.13 1.30±0.19 Bcl－2/actin 0.21±0.01 0.11±0.02#0.11±0.02 0.16±0.02 0.20±0.03 0.23±0.03*Caspase－3/actin 0.44±0.07 0.90±0.12#0.56±0.13 0.45±0.07*0.45±0.09*0.52±0.08*JNK/actin 0.22±0.02 0.57±0.07##0.37±0.02 0.33±0.03*0.29±0.06*0.21±0.03*

4 討論

DCD 是以獲得性認知行為缺陷為特征的糖尿病常見并發(fā)癥之一。通過長期的臨床實踐發(fā)現(xiàn)中藥組方在調(diào)節(jié)DCD 的臨床療效方面不亞于甚至優(yōu)于西藥治療。前期相關(guān)研究認為［17］，DCD 是多由痰濕、瘀血、濁毒等侵犯機體，以致腎氣虧損，氣血運行不足，髓?？仗?，神機失用，從而發(fā)病，其病位在腦，與脾、腎密切相關(guān)。TZQ 配伍嚴謹，其中黃精、枸杞子性味甘平，健脾固腎、益氣養(yǎng)陰；澤蘭性辛溫味苦，鬼箭羽性寒味苦，二者相互配伍同起活血化瘀之效；炒僵蠶性辛平味咸，善走經(jīng)絡(luò)、祛頑痰。全方切合脾腎虧虛、痰瘀互結(jié)的病機，共奏具有益氣養(yǎng)血、豁痰化瘀、滋腎養(yǎng)肝之效，既治DCD 痰瘀互結(jié)之標，又療脾腎虧虛之本。

DCD 的發(fā)生、發(fā)展與細胞異常凋亡、過度氧化應(yīng)激和細胞自噬關(guān)系密切。在長期的高糖環(huán)境刺激下，機體內(nèi)自由基成分如活性氧（ROS）出現(xiàn)過度堆積，氧化與抗氧化動態(tài)平衡被打破，炎性因子表達增加，造成神經(jīng)細胞功能障礙和細胞凋亡［18］。細胞自噬是另一種存在于機體細胞的正常代謝過程，可幫助降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積聚的未折疊或錯誤折疊蛋白，降低ERS，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定性，保護細胞存活，在這個過程中需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、線粒體和自噬小體等多種細胞器的配合參與［19－20］。然而，自噬在抑制糖尿病發(fā)生進展中起到何種作用仍然存在爭議［21］。越來越多的證據(jù)表明，過度自噬對神經(jīng)元有害［22］。氧化應(yīng)激、細胞凋亡和細胞自噬之間相互關(guān)聯(lián)，在DCD 的生成機制中占據(jù)著重要的作用。SOD、MDA 和LDH 的含量高低間接反應(yīng)HT22細胞受自由基攻擊和細胞膜損傷的嚴重程度，是評估氧化應(yīng)激損傷的重要指標，它影響機體磷脂中不飽和脂肪酸含量以引起神經(jīng)元脂質(zhì)過氧化，從而誘發(fā)細胞凋亡［23］。本實驗研究中，在確定最適造模濃度情況下觀察各組HT22細胞氧化應(yīng)激指標、Hoechst 33342染色結(jié)果顯示，與Con 組相比較，高糖環(huán)境下HT22 細胞氧化應(yīng)激損傷增加，細胞核凋亡增加，而在給予二甲雙胍和不同濃度的TZQ 干預(yù)后可一定程度提高神經(jīng)元的自我修復(fù)能力，恢復(fù)細胞功能。

Bax 和Bcl－2 是調(diào)節(jié)和控制細胞凋亡的一組基因。Caspase 家族蛋白是一種半胱氨酸蛋白酶，其引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)引起細胞形態(tài)學上的改變促使細胞凋亡［24］。Caspase－3 則是最下游的執(zhí)行者，其活化受Bax、Bcl－2 調(diào)控［25］。Bcl－2 可以抑制CytC 的釋放，維持Ca2+的動態(tài)平衡、拮抗促凋亡基因Bax 的表達，抑制細胞凋亡［26］。SIRT1 作為一種去乙?；?，廣泛存在于全身各組織細胞中，可通過多種復(fù)雜形式參與細胞自噬［27］，參與糖尿病、腫瘤、心血管等多種疾病治療作用的雙向過程，其調(diào)控自噬的方式存在正向和逆向調(diào)控。Western Blot 實驗結(jié)果顯示，HT22 細胞在高糖環(huán)境刺激下可激活SIRT1 相關(guān)自噬通路，該自噬可能與去乙?；允上嚓P(guān)基因的表達產(chǎn)物的增加、激活線粒體調(diào)控途徑相關(guān)［28］。另一方面，JNK 作為應(yīng)激活化蛋白激酶，該基因的激活可介導下游底物磷酸化進而誘導自噬發(fā)生［29］，自噬長期上調(diào)會引起細胞質(zhì)內(nèi)容物的過度降解，最終出現(xiàn)凋亡［30］。此外，自噬體的成熟需要溶酶體相關(guān)蛋白的參與［31］。Lamp2是位于溶酶體上的一種膜蛋白，雖然Lamp2的轉(zhuǎn)錄、合成和溶酶體的靶向功能并不會隨著年齡的增長而發(fā)生改變，但Lamp2 在溶酶體膜上的穩(wěn)定性會隨著年齡的增長而下降［32－33］。在本研究中，HT22 小鼠海馬神經(jīng)元相關(guān)自噬標志物SIRT1、JNK 表達顯著增加，提示神經(jīng)元細胞處在“積極”自噬流活化階段，而Lamp2 表達水平卻顯著下降，由此本課題組推測，神經(jīng)元雖然處在“積極”自噬環(huán)境，但溶酶體轉(zhuǎn)膜功能受到阻礙，自噬體和溶酶體結(jié)合異常，神經(jīng)元無法進行正常降解，由此誘導細胞出現(xiàn)凋亡，故而激活凋亡信號通路上Bax、Caspase－3 等凋亡蛋白表達。而TZQ 的干預(yù)可能是通過抑制自噬小體轉(zhuǎn)運、促進溶酶體降解異常代謝物的方式，從而抑制Caspase 家族等炎癥相關(guān)蛋白的激活，抑制神經(jīng)元過度自噬和凋亡。

在本次研究中，筆者觀察到中藥復(fù)方TZQ 對高糖誘導的HT22 神經(jīng)細胞損傷能起到一定保護作用，這種保護作用是通過下調(diào)Bax、Caspase－3、MDA、LDH炎癥、氧化應(yīng)激相關(guān)因子和JNK、SIRT1 自噬相關(guān)因子的表達水平，上調(diào)SOD、Bcl－2、Lamp2 的表達水平來實現(xiàn)的。TZQ 可通過多重機制產(chǎn)生對神經(jīng)元的保護作用，其有望成為治療糖尿病患者合并認知功能障礙的候選藥物。