淫羊藿苷不同給藥途徑對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)研究

陶榮品，姚文慧，丁選勝

（中國藥科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 211198）

淫羊藿苷（Icariin，ICA）屬于黃酮類化合物，是淫羊藿的主要活性成分之一，主要從小檗科植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、巫山淫羊藿、柔毛淫羊藿或朝鮮淫羊藿的干燥莖葉中提取得到[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淫羊藿苷具有廣泛的生物活性，包括調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[2]、抗炎[3]、延緩衰老[4]、抗腫瘤[5]等，可以改善阿爾茲海默病、帕金森、抑郁癥、骨質(zhì)疏松、腦缺血、動(dòng)脈粥樣硬化、風(fēng)濕病等多種疾病[6-8]。

目前關(guān)于淫羊藿苷藥理學(xué)研究中給藥方式有灌胃給藥[9]及注射給藥[10]兩種，然而關(guān)于這兩種給藥方式的安全性評(píng)價(jià)研究尚不足。《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》指出為盡可能觀察到動(dòng)物的急性毒性反應(yīng)，可采用不同給藥途徑進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)[11]。因此，本研究參照急性毒性試驗(yàn)方法[11-13]，開展淫羊藿苷灌胃及靜脈給藥急性毒性試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)淫羊藿苷不同給藥途徑的急性毒性安全性評(píng)價(jià)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

淫羊藿苷灌胃給藥急性毒性試驗(yàn)所用SPF 級(jí)ICR小鼠共20 只，雌雄各半，體質(zhì)量為18 ～ 22 g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0007，合格證編號(hào)為No.202008319。淫羊藿苷靜脈給藥急性毒性預(yù)試驗(yàn)所用SPF 級(jí)ICR 小鼠共40 只，雌雄各半，體質(zhì)量為18 ～ 22 g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0007，合格證編號(hào)為No.202008319。淫羊藿苷靜脈給藥急性毒性正式試驗(yàn)所用SPF 級(jí)ICR 小鼠共80 只，雌雄各半，體質(zhì)量為18 ～ 22 g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002，合格證編號(hào)為No.20200803Abzz0118000188。

1.2 試驗(yàn)材料與儀器

淫羊藿苷（98%，HPLC，批號(hào)：18102102）購自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMCNa，批號(hào)：F20111021）、聚乙二醇（批號(hào)：20200331）、二甲基亞砜（批號(hào)：20191112）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Tween 80（批號(hào)：180104064D）購自南京化學(xué)試劑股份有限公司；0.9%氯化鈉注射液（批號(hào)：1806134）購自安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司；BS124S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

2 方法

2.1 淫羊藿苷灌胃給藥急性毒性試驗(yàn)

取SPF級(jí)健康ICR小鼠20只，體質(zhì)量為18 ～ 22 g，隨機(jī)分為空白組、灌胃給藥組，每組10 只，雌雄各半?！端幬飭未谓o藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》指出由于大多數(shù)中藥的急性毒性可能相對(duì)較低，中藥常常采用最大給藥量法進(jìn)行急性毒性研究[12]，因此淫羊藿苷灌胃給藥采用最大給藥量法[13]。根據(jù)指導(dǎo)原則可知小鼠單次灌胃給藥的最大體積是1 mL/20 g，由前期試驗(yàn)可知淫羊藿苷藥物在羧甲基纖維素鈉中的最大配制濃度是0.36 g/mL，早、中、晚各給藥1 次，因此，小鼠淫羊藿苷灌胃給藥的最大給藥量為54 g/kg。

2.2 淫羊藿苷靜脈給藥急性毒性預(yù)試驗(yàn)

靜脈給藥急性毒性預(yù)試驗(yàn)正常組小鼠與灌胃給藥急性毒性試驗(yàn)正常組小鼠共用。再取SPF 級(jí)健康ICR小鼠40 只，體質(zhì)量為18 ～ 22 g，隨機(jī)分為淫羊藿苷A 組（0 mg/kg，iv）、淫羊藿苷B 組（50 mg/kg，iv）、淫 羊 藿 苷C 組（100 mg/kg，iv）、淫 羊 藿 苷D 組（200 mg/kg，iv）。淫羊藿苷溶于5%的二甲基亞砜后，再依次加入40%聚乙二醇、5%聚山梨酯-80 和50%生理鹽水，采用最大給藥體積0.5 mL/20 g[13]。給藥前，動(dòng)物禁食12 h，給藥后，觀察14 d，根據(jù)各組小鼠毒性反應(yīng)情況確定淫羊藿苷靜脈給藥最大非致死劑量（LD0）與絕對(duì)致死劑量（LD100）。

2.3 淫羊藿苷靜脈給藥急性毒性正式試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，可以初步確定50 mg/kg 為淫羊藿苷靜脈給藥LD0，200 mg/kg 為淫羊藿苷靜脈給藥LD100。按下式求算組間距（i值），確定正式試驗(yàn)的具體分組方案[12-13]。

經(jīng)過計(jì)算，i= 0.120 412。求得的i值加上LD0對(duì)應(yīng)劑量的對(duì)數(shù)值即得次低劑量組（第2 組）劑量的對(duì)數(shù)值，依次類推至最高劑量組（第n組）。計(jì)算得出正式試驗(yàn)各組給藥劑量分別為50、66、87、115、152、200 mg/kg。

取健康ICR 小鼠80 只，體質(zhì)量為18 ～ 22 g，隨機(jī)分為空白組，尾靜脈注射溶媒組，淫羊藿苷A 組（50 mg/kg，iv），淫羊藿苷B 組（66 mg/kg，iv），淫羊藿苷C 組（87 mg/kg，iv），淫羊藿苷D 組（115 mg/kg，iv），淫羊藿苷E 組（152 mg/kg，iv），淫羊藿苷F 組（200 mg/kg，iv），每組10 只，雌雄各半。將淫羊藿苷溶于5%的二甲基亞砜，再依次加入40%聚乙二醇、5%聚山梨酯-80 和50%生理鹽水，采用最大給藥體積0.5 mL/20 g。給藥前，動(dòng)物禁食12 h，給藥后，觀察14 d。

2.4 觀察指標(biāo)

給藥后立即觀察動(dòng)物的毒性反應(yīng)情況，包括外觀體征、行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、食欲、大小便及顏色、皮毛、膚色、呼吸以及鼻、眼、口腔、生殖器等有無異常分泌物。

記錄每組動(dòng)物死亡數(shù)量，按照孫氏改良寇氏法[14]計(jì)算淫羊藿苷靜脈給藥LD50，并對(duì)死亡動(dòng)物進(jìn)行解剖，觀察小鼠的心、肝、脾、肺、腎等重要臟器的大小、形狀、色狀、色澤、質(zhì)地，稱取臟器重量，計(jì)算臟器系數(shù)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 淫羊藿苷灌胃給藥急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 灌胃給藥對(duì)小鼠死亡率的影響 小鼠灌胃給予淫羊藿苷，采用最大給藥量法，觀察到給藥后正常組小鼠與淫羊藿苷灌胃給藥組小鼠活動(dòng)正常，未出現(xiàn)痙攣、豎毛、震顫、呼吸抑制等中毒癥狀，且14 d內(nèi)動(dòng)物活動(dòng)正常，均未出現(xiàn)死亡。

3.1.2 灌胃給藥對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響 淫羊藿苷灌胃給藥后，各組小鼠的體質(zhì)量變化，見圖1。與正常組相比較，淫羊藿苷灌胃給藥后14 d 內(nèi)，小鼠飲食飲水活動(dòng)正常，體質(zhì)量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），說明淫羊藿苷灌胃給藥對(duì)小鼠體質(zhì)量增長無影響。

圖1 給藥后動(dòng)物體質(zhì)量變化圖Fig.1 Change of animal body mass after administration

3.1.3 灌胃給藥對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響 采用最大給藥量法灌胃給予小鼠淫羊藿苷，14 d 后處死小鼠并進(jìn)行解剖，觀察正常組小鼠與灌胃給藥組小鼠的心、肝、脾、肺、腎等重要臟器大小、形狀、色狀、色澤、質(zhì)地等均無明顯改變。各組小鼠的各臟器系數(shù)見表1，與正常組相比，小鼠的心、肝、脾、肺、腎的臟器系數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。說明淫羊藿苷灌胃給藥無急性毒性作用。

表1 淫羊藿苷最大給藥量法灌胃給藥對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響（± s，n = 10）Tab.1 Effect of intragastric administration of icariin by maximum dose method on organ coefficient in mouse（± s，n = 10）

表1 淫羊藿苷最大給藥量法灌胃給藥對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響（± s，n = 10）Tab.1 Effect of intragastric administration of icariin by maximum dose method on organ coefficient in mouse（± s，n = 10）

臟器系數(shù)/%組別 t P正常組 淫羊藿苷灌胃組心 0.48 ± 0.07 0.44 ± 0.04 1.407 0.176肝 4.42 ± 0.38 4.40 ± 0.68 0.082 0.935脾 0.34 ± 0.08 0.35 ± 0.09 -0.474 0.641肺 0.67 ± 0.09 0.70 ± 0.08 -0.819 0.423腎 0.74 ± 0.11 0.74 ± 0.15 -0.141 0.889

3.2 淫羊藿苷靜脈給藥急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 淫羊藿苷靜脈給藥急性毒性預(yù)試驗(yàn) 不同劑量給藥組出現(xiàn)不同數(shù)量的動(dòng)物毒性反應(yīng)，中毒癥狀相似，表現(xiàn)為痙攣、豎毛、震顫、呼吸抑制等。各組小鼠死亡數(shù)及死亡率的試驗(yàn)結(jié)果，見表2，可以初步確定50 mg/kg 為淫羊藿苷靜脈給藥LD0，200 mg/kg為淫羊藿苷靜脈給藥LD100。

表2 各組小鼠死亡數(shù)及死亡率Tab.2 Death number and mortality of mouse in each group

3.2.2 淫羊藿苷靜脈給藥急性毒性正式試驗(yàn)

（1）靜脈給藥對(duì)小鼠死亡率的影響 淫羊藿苷靜脈給藥后各組小鼠的死亡數(shù)及死亡率見表3，尾靜脈給藥小鼠溶媒對(duì)照組未出現(xiàn)死亡，而給藥組小鼠隨著給藥劑量增加，小鼠的死亡率逐漸增高，中毒的潛伏期逐漸縮短，中毒癥狀相似，出現(xiàn)痙攣、豎毛、震顫、呼吸抑制等。

表3 各組小鼠死亡數(shù)及死亡率Tab.3 Death number and mortality of mouse in each group

（2）孫氏改良寇氏法計(jì)算淫羊藿苷靜脈給藥LD50此法是根據(jù)劑量對(duì)數(shù)與死亡率呈“S”型曲線所包涵的面積推導(dǎo)出死亡率為50%的劑量。當(dāng)最小劑量組的死亡率為0%，最大劑量組的死亡率為100%時(shí)，計(jì) 算 公 式 為LD50= lg-1[Xm–i（∑P– 0.5）]，L D50的95%可信限計(jì)算公式為lg-1（lgLD50± 1.96 ×Sx50），其中

i為組間距[11]（相鄰兩組對(duì)數(shù)劑量的差值），Xm為最大劑量的對(duì)數(shù)，p為各組動(dòng)物的死亡率（以小數(shù)表示），q為各組劑量存活率，n是各組動(dòng)物數(shù)，Sx50是log（LD50）的標(biāo)準(zhǔn)誤差。計(jì)算得出LD50為97 mg/kg，95%可信區(qū)間范圍為83.80 ～ 112.28 mg/kg。

（3）靜脈給藥對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響 各組死亡小鼠即刻解剖，其余存活小鼠常規(guī)飼養(yǎng)14 d 后處死解剖。解剖后立即肉眼觀察各組小鼠的心、肝、脾、肺、腎的大小以及形狀、色狀、色澤、質(zhì)地等。觀察發(fā)現(xiàn)，各組小鼠的重要臟器的外觀大小、顏色、質(zhì)地等均正常，未發(fā)現(xiàn)有明顯的臟器病變。各組小鼠的臟器系數(shù)分析結(jié)果見表4，小鼠各組間的臟器系數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。

表4 淫羊藿苷靜脈給藥對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響（± s，n = 10）Tab.4 Effect of intravenous administration of Icariin on organ coefficient in mouse （± s，n = 10）

表4 淫羊藿苷靜脈給藥對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響（± s，n = 10）Tab.4 Effect of intravenous administration of Icariin on organ coefficient in mouse （± s，n = 10）

臟器系數(shù)/%組別 F P正常組 溶媒組 ICA-A 組 ICA-B 組 ICA-C 組 ICA-D 組 ICA-E 組 ICA-F 組心 0.56 ± 0.06 0.53 ± 0.07 0.59 ± 0.11 0.57 ± 0.06 0.54 ± 0.08 0.54 ± 0.08 0.55 ± 0.08 0.53 ± 0.06 0.718 0.657肝 4.40 ± 0.23 4.47 ± 0.31 4.93 ± 0.51 4.65 ± 0.50 5.14 ± 0.36 4.97 ± 0.76 4.95 ± 1.15 5.32 ± 1.16 2.065 0.058脾 0.52 ± 0.10 0.54 ± 0.14 0.66 ± 0.28 0.51 ± 0.08 0.56 ± 0.15 0.53 ± 0.13 0.50 ± 0.06 0.50 ± 0.17 1.244 0.290肺 0.76 ± 0.05 0.75 ± 0.07 0.94 ± 0.54 0.80 ± 0.14 0.79 ± 0.08 0.81 ± 0.07 0.84 ± 0.12 0.87 ± 0.09 0.904 0.508腎 0.76 ± 0.13 0.75 ± 0.15 0.73 ± 0.12 0.73 ± 0.14 0.74 ± 0.08 0.78 ± 0.12 0.75 ± 0.11 0.77 ± 0.15 0.205 0.983

4 討論

淫羊藿在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被稱作“仙靈脾”，《本草備要》也描述其“補(bǔ)命門，益精氣，堅(jiān)筋骨”，所以它具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效，可用于治療腎陽虛衰、陽痿遺精、風(fēng)濕痹痛、筋骨痿軟及肢體麻木[15]等癥。淫羊藿含有黃酮類、多糖、木脂素、生物堿等成分[16]，其中，黃酮類成分如淫羊藿苷是其主要活性成分[17]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷對(duì)免疫、骨代謝、神經(jīng)、心血管系統(tǒng)等相關(guān)疾病均具有一定的改善作用[18]。

目前，淫羊藿苷藥理學(xué)研究中采用灌胃給藥和注射給藥方式，因此，有必要對(duì)這兩種不同給藥方式的急性毒性試驗(yàn)進(jìn)行研究。《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》指出急性毒性試驗(yàn)指的是受試動(dòng)物1 次或24 h 內(nèi)多次染毒后觀察其毒性反應(yīng)的試驗(yàn)。給藥途徑不同，受試物的吸收速度、吸收率和暴露量會(huì)有所不同，因此需要采用不同給藥途徑進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)[11]，通過急性毒性試驗(yàn)計(jì)算LD50，為后續(xù)藥理學(xué)試驗(yàn)中劑量設(shè)計(jì)與分組提供參考。因此，本研究采用灌胃給藥及靜脈注射給藥兩種途徑探究淫羊藿苷對(duì)小鼠的急性毒性反應(yīng)，為其安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

前期關(guān)于淫羊藿苷小鼠急性毒性試驗(yàn)研究表明，小鼠灌胃給藥最大給藥量為28.8 g/kg，提示淫羊藿苷口服毒性小，臨床劑量下用藥安全[19]。本研究通過采用CMCC-Na 配制淫羊藿苷混懸液灌胃給藥后發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷對(duì)于小鼠的最大給藥量可達(dá)54 g/kg。淫羊藿苷采用最大給藥量法灌胃給藥后發(fā)現(xiàn)給藥組和空白對(duì)照組小鼠體質(zhì)量正常增長，一般情況觀察無明顯異常表現(xiàn)，未見組織器官發(fā)生病變，臟器系數(shù)無顯著性差異，動(dòng)物無死亡，表明淫羊藿苷在此劑量下灌胃給藥是安全可靠的。

淫羊藿苷靜脈給藥預(yù)試驗(yàn)結(jié)果初步確定給藥最大非致死劑量LD0為50 mg/kg，絕對(duì)致死劑量LD100為200 mg/kg。正式試驗(yàn)中利用孫氏改良寇氏法計(jì)算得出淫羊藿苷靜脈給藥LD50為97 mg/kg，這表明淫羊藿苷靜脈給藥存在一定的毒性。

5 結(jié)論

本研究開展了淫羊藿苷兩種給藥途徑的急性毒性試驗(yàn)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷最大給藥量法灌胃給藥無法測出LD50，而靜脈給藥的LD50值為97 mg/kg。該試驗(yàn)結(jié)果為淫羊藿苷的安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)，同時(shí)也為其后續(xù)的藥理學(xué)研究、機(jī)制研究等提供理論依據(jù)。但是本研究主要探討了淫羊藿苷兩種給藥方式的急性毒性試驗(yàn)比較，而淫羊藿苷可能還存在慢性毒性、亞慢性毒性、生殖毒性、發(fā)育毒性等，因此對(duì)于淫羊藿苷的安全性評(píng)價(jià)需要對(duì)以上各毒性研究結(jié)果進(jìn)行綜合考慮。