穩(wěn)定表達IL-10的PK-15細胞的構建及其在PCV2增殖中的應用

張敬寒，李枝蘭，韓佃剛，何 帥，劉金華，呂念詞，鄒豐才，柴 俊，張以芳

(1.云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，昆明 650201；2.昆明海關技術中心，昆明 650051；3.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是一種二十面體對稱的小型非薄膜DNA病毒[1]。 它具有較強的致病性，可引起豬圓環(huán)病毒相關疫病(porcine circovirus associated disease,PCVAD)[2-3]。PCV2基因組通過滾圈復制機制進行復制，造成感染后機體的免疫抑制與持續(xù)性感染，這一特征為其防控帶來阻礙，且其機理尚不明確[4-5]。目前流行的基因型PCV2d是世界各地生豬生產系統(tǒng)面臨的一個挑戰(zhàn)，由于PCV2的優(yōu)勢基因型不斷發(fā)生轉變，導致了遺傳多樣性的產生[6]，為圓環(huán)病毒的防治帶來了困難，提高了疫苗的研發(fā)難度。

白細胞介素-10(IL-10)是調節(jié)性T細胞(Treg)發(fā)揮負調控作用的細胞因子和抗炎因子[7]，同時介導Th1和Th2免疫反應的負反饋調控[8]。當機體長期處于持續(xù)感染階段，病毒侵入機體會誘導免疫細胞產生高水平的IL-10，降低抗原呈遞能力，使T細胞活化效率降低，從而抑制抗病毒效應的免疫應答[9]。 研究發(fā)現(xiàn)，被PCV2感染的豬組織中IL-10上調，感染PCV2的外周血單核細胞(PBMC)和樹突狀細胞(DCs)也能過表達IL-10，但被誘導的IL-10高表達對PCV2感染機體的意義尚不明確[10-11]，用IL-10阻斷PCV2感染引起的主要通路，以及IL-10減弱促炎細胞因子和PCV2特異性抗體的產生，發(fā)現(xiàn)IL-10在PCV2感染和復制中起到了重要作用[12-13]。

目前，PK-15細胞通常用于PCV2的增殖，但病毒傳播極其緩慢，細胞對PCV2感染的敏感性較差，病毒滴度遠低于預期，通過添加外源性試劑或細胞因子來提高病毒滴度成本較高且效果不明顯，從而限制了疫苗的生產[14-15]。因此，篩選PCV2高感染性細胞系和提高PCV2病毒滴度具有重要意義。Yang等[16]研究報道，通過慢病毒轉染構建了穩(wěn)定表達豬IL-2的PK-15細胞系，顯著增強了PCV2的復制能力。據(jù)此，推測豬IL-10基因的過表達可以持續(xù)增加PCV2的體外增殖。本研究利用慢病毒表達系統(tǒng)構建表達豬IL-10的慢病毒，以慢病毒轉染的方式實現(xiàn)細胞內IL-10的過表達，并檢測過表達IL-10對PCV2在體外細胞內增殖的影響，以期為后續(xù)體內試驗的開展提供技術支持，為進一步揭示IL-10與PCV2感染的分子意義提供參考依據(jù)，為疫苗的研發(fā)和PCV2的防控提供解決思路。

1 材料與方法

1.1 材料

豬腎細胞(PK-15)、人胚胎腎上皮細胞(293T)及云南分離PCV2d毒株KM-2018(GenBank登錄號：MK405698)均由云南農業(yè)大學微生物實驗室分離保存；過表達的慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro、包裝質粒psPAX2和pMD2.G均購自湖南豐暉生物科技有限公司；胎牛血清、LB培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)液、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、2×EasyTaqSuperMix及無內毒素質粒提取試劑盒均購自北京全式金生物科技有限公司；抗PCV2的鼠單克隆抗體(一抗)和FITC標記的羊抗鼠IgG抗體均購自GeneTex公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、pMD19-T載體、限制性內切酶XbaⅠ和BamH Ⅰ、T4 DNA連接酶、嘌呤霉素、DNA病毒基因組提取試劑盒、細胞增殖-毒性檢測試劑盒(CCK-8)均購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA-Hieff TransTM脂質體核酸轉染試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 引物設計及合成

以β-actin為管家基因，根據(jù)GenBank中IL-10(登錄號：DQ058295、AB000514)和PCV2(登錄號：AF408635、FJ667592)基因序列設計引物，分別用于檢測IL-10、PCV2標準品的制備及PCV2的絕對定量，引物信息見表1。引物均由昆明擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.3 慢病毒表達載體的構建及包裝

對慢病毒表達質粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro和合成的質粒菌液pUC57-IL-10分別用XbaⅠ和BamH Ⅰ進行雙酶切。經0.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶切產物膠回收后與目的基因IL-10進行連接轉化，菌液進行PCR擴增。PCR擴增體系25 μL：2×EasyTaqSuperMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，菌液1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。按照無內毒素質粒提取試劑盒說明書對菌液提取質粒，重組質粒pCDH-CMV-IL-10用限制性內切酶XbaⅠ和BamH Ⅰ進行雙酶切，酶切產物用0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，酶切鑒定正確的陽性克隆送至昆明擎科生物有限公司測序。將測序正確的質粒進行核酸濃度測定，進行轉染。提前一天將293T細胞按照1×105/孔鋪于6孔板(不含抗生素)，當細胞密度達到95%時，使用DNA-Hieff TransTM脂質體核酸轉染試劑盒將重組質粒pCDH-CMV-IL-10與包裝質粒psPAX2和pMD2.G共轉染293T細胞，分別于24、48和72 h在普通顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，在熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況；并分別收集共轉染48和72 h的慢病毒液上清，合并后用0.45 μm過濾器過濾，用于感染PK-15細胞。

1.4 穩(wěn)定表達細胞系篩選

慢病毒包裝后，將PK-15細胞鋪于24孔板中，24 h后按梯度加入(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5及5.0 μg/mL)嘌呤霉素。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，經10 d左右殺死全部細胞的最小濃度為篩選穩(wěn)轉細胞的濃度。在最后一次收集病毒液上清的同時復蘇PK-15細胞，在PK-15細胞匯合度達到60%左右時，于不同細胞孔中分別加入2 mL pCDH-CMV-IL-10的重組慢病毒液和包裝的慢病毒液，對照組為不加病毒液的PK-15細胞。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，換為完全培養(yǎng)基；48 h后觀察細胞的熒光表達情況，同時換為含嘌呤霉素的培養(yǎng)基，直到對照組細胞全部死亡；將加入pCDH-CMV-IL-10和pCDH-CMV-GFP的慢病毒液組的細胞重新傳代，擴大培養(yǎng)，得到的細胞命名為PK-15-IL-10和PK-15-pCDH。 將PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15細胞分別鋪于6孔板，培養(yǎng)24 h后，待細胞匯合度到60%左右接種PCV2，分別于6、12、24及48 h收樣，提取細胞總RNA和病毒DNA，病毒DNA進行PCR擴增后用0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，再利用實時熒光定量PCR和Western blotting檢測PCV2感染后IL-10的表達水平。

1.5 實時熒光定量PCR擴增

經PCR鑒定成功的PCV2陽性質粒按照1∶10進行梯度稀釋，建立PCV2實時熒光定量PCR檢測的標準曲線。通過標準曲線和Ct值，計算樣品PCV2的拷貝數(shù)。PCR反應體系20 μL：TB Green Premix ExTaqⅡ(2×) 10.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.4 μL，cDNA 2.0 μL，加雙蒸水補足體系。PCR反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。使用SPSS 23.0軟件中單因素方差分析法分析不同時間段內IL-10的表達水平和PCV2的復制情況，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，P<0.01表示差異極顯著，用GraphPad Prism 6作圖。

1.6 Western blotting檢測

用蛋白裂解液裂解細胞，離心取上清，即蛋白樣，用BCA方法測定并計算蛋白濃度。制備15%分離膠與5%濃縮膠，上樣電泳后轉膜并進行抗體孵育，轉印后的膜用膜封閉液封閉30 min。單克隆抗體按1∶200稀釋，按一定比例加入封有膜的雜交袋中，4 ℃過夜孵育。將一抗按1∶3 000稀釋，清洗5次；二抗按1∶4 000稀釋，室溫下?lián)u床孵育2 h，清洗5次后用ECL化學發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測蛋白條帶。

1.7 細胞增殖試驗

按CCK-8說明書進行細胞增殖試驗，在96孔板中培養(yǎng)PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15 3組細胞，分別于24、48及72 h往不同的孔中加入10 μL CCK-8溶液；不同時間段的每組細胞均設置重復和空白對照，培養(yǎng)3 h后，使用酶標儀測定450 nm處的吸光值；根據(jù)不同時間點的吸光值，繪制增殖曲線。

1.8 間接免疫熒光試驗(IFA)

將PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15細胞分別鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞密度達到80%時，每孔細胞感染100 μL已稀釋的病毒液，每一稀釋度做8個重復，陰性對照孔只加培養(yǎng)基，3組細胞均做同樣的處理；37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h，PBS洗滌后用4%多聚甲醛固定細胞15 min，用10%脫脂奶粉封閉2 h，加抗PCV2的鼠單克隆抗體，置4 ℃孵育過夜；洗滌后加入羊抗鼠的IgG抗體，室溫避光孵育1 h；再次洗滌后用含DAPI的封片劑封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)紅色熒光的細胞孔數(shù)并記錄，病毒滴度以TCID50/0.1 mL表示，參照Karber方法計算。

2 結 果

2.1 IL-10基因PCR擴增結果

對pUC57-IL-10質粒進行PCR擴增，得到546 bp的清晰條帶(圖1)，與預期片段長度相符；用限制性內切酶XbaⅠ和BamH Ⅰ進行雙酶切鑒定，得到兩條分別約為2 700和546 bp的清晰條帶(圖2)，與預期片段大小一致。

M，DL15000 DNA Marker；1，陰性對照；2，pUC57-IL-10質粒PCR擴增產物M，DL15000 DNA Marker；1，Negative control；2，PCR amplification product of pUC57-IL-10 plasmid圖1 pUC57-IL-10質粒PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification result of pUC57-IL-10

圖2 pUC57-IL-10雙酶切鑒定Fig.2 Double enzyme digestion identification of pUC57-IL-10

2.2 重組質粒pCDH-CMV-IL-10的構建

酶切后的pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro表達質粒和豬IL-10基因的膠回收產物用T4 DNA連接酶連接、轉化，對菌液進行PCR鑒定，結果顯示，在546 bp處有與預期大小相符的條帶(圖3)；提取質粒雙酶切，電泳得到兩條(約8 100和546 bp)與預期大小相符的條帶(圖4)。

2.3 慢病毒包裝結果

將重組質粒pCDH-CMV-IL-10與包裝質粒psPAX2和pMD2.G共轉染293T細胞，分別于24、48和72 h在普通顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，在熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況，結果顯示，24 h時已經有熒光出現(xiàn)；48 h時細胞狀態(tài)最好，熒光最強；72 h時熒光有減弱的趨勢(圖5)。 pCDH-CMV-IL-10和pCDH-CMV-GFP組間熒光亮度無差異，說明病毒載體在293T細胞中表達。

2.4 慢病毒液感染PK-15細胞結果

分別收集共轉染48和72 h的慢病毒液上清，合并后用0.45 μm過濾器過濾，感染PK-15細胞后發(fā)現(xiàn)pCDH-CMV-IL-10組(PK-15-IL-10)的熒光最強，pCDH-CMV-GFP組(PK-15-pCDH)和正常的PK-15間熒光亮度無差異(圖6)。

2.5 PK-15穩(wěn)轉細胞的篩選及鑒定結果

2.5.1 PK-15穩(wěn)轉細胞的篩選 篩選得到嘌呤霉素濃度為2.5 μg/mL。 pCDH-CMV-IL-10的重組慢病毒液感染PK-15后，有綠色熒光蛋白表達，將培養(yǎng)基換為含2.5 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h更換一次，待對照組的細胞全部死亡時，收取試驗組的細胞于普通培養(yǎng)基中傳代擴大培養(yǎng)，得到穩(wěn)轉的細胞株，仍有綠色熒光表達(圖7)。

M，DL1000 DNA Marker；1，菌液PCR擴增產物；2，陰性對照M，DL1000 DNA Marker；1，PCR amplification product of bacterial solution；2，Negative control圖3 菌液PCR擴增結果Fig.3 PCR amplification result of bacterial solution

圖4 pCDH-CMV-IL-10雙酶切鑒定Fig.4 Double enzyme digestion identification of pCDH-CMV-IL-10

圖5 慢病毒包裝后不同時間293T細胞狀態(tài)與GFP表達情況(200×)Fig.5 293T cell status and GFP expression at different time after lentivirus packaging (200×)

圖6 慢病毒液感染PK-15細胞后GFP表達情況(100×)Fig.6 GFP expression in PK-15 cells infected with lentivirus supernatant (100×)

圖7 PK-15穩(wěn)轉細胞GFP表達情況(100×)Fig.7 GFP expression in PK-15 stable cells (100×)

2.5.2 PK-15穩(wěn)轉細胞的鑒定結果 利用pCDH-CMV-IL-10的慢病毒液感染PK-15細胞，經PCR擴增后得到546 bp的目的條帶(圖8)。采用實時熒光定量PCR檢測慢病毒液感染PK-15細胞48 h后PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15細胞系中IL-10基因mRNA的表達水平，結果顯示，PK-15-IL-10細胞系中IL-10基因表達水平極顯著升高(P<0.01，圖9)，約為對照組PK-15-pCDH和PK-15細胞中的600倍。分別收集PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15細胞，提取細胞總蛋白進行Western blotting試驗，結果顯示，IL-10在pCDH-IL-10細胞株中的表達量明顯多于對照組PK-15-pCDH和PK-15中的表達量(圖10)。連續(xù)傳代3次后，使用CCK-8進行細胞增殖試驗，發(fā)現(xiàn)PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15細胞之間差異不顯著(P>0.05，圖11)。 說明豬IL-10基因在細胞中過表達對細胞活力無明顯影響。

M，DL2000 DNA Marker；P，陽性對照；N，陰性對照；1，PK-15-IL-10；2，PK-15-pCDH；3，PK-15M，DL2000 DNA Marker；P,Positive control;N,Negative control;1，PK-15-IL-10；2，PK-15-pCDH；3，PK-15圖8 IL-10基因的PCR擴增Fig.8 PCR amplification of IL-10 gene

與PK-15和PK-15-pCDH相比，**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。圖11、12、16同Compared with PK-15 and PK-15-pCDH，**，Extremely significant difference (P<0.01);No *，No significant difference (P>0.05).The same as fig.11,fig.12 and fig.16圖9 IL-10基因mRNA的表達情況Fig.9 Expression of IL-10 gene mRNA

圖10 IL-10蛋白的表達情況Fig.10 Expression of IL-10 protein

圖11 PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15細胞增殖試驗結果Fig.11 Proliferation results of PK-15-IL-10，PK-15-pCDH and PK-15 cells

2.6 IL-10對PCV2復制的影響

2.6.1 實時熒光定量PCR檢測感染PCV2后IL-10基因的表達量 由圖12可知，在穩(wěn)轉細胞系PK-15-IL-10中，隨著時間的增加IL-10基因的表達水平都有顯著升高，在12～48 h，穩(wěn)轉細胞系PK-15-IL-10中IL-10基因的表達水平均極顯著高于對照組PK-15-pCDH和PK-15細胞系(P<0.01)。

圖12 PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15感染PCV2后不同時間IL-10基因的表達水平Fig.12 Expression of IL-10 gene of PK-15-IL-10，PK-15-pCDH and PK-15 at different time after PCV2 infection

2.6.2 實時熒光定量PCR檢測PCV2的拷貝數(shù) 采用PCV2實時熒光定量引物檢測感染PCV2后不同時間內PCV2的復制情況，結果顯示，PK-15-IL-10細胞中的PCV2含量極顯著高于PK-15細胞(P<0.01，圖13)。為了評估PCV2在細胞內增殖是否可以持續(xù)增加，將病毒稀釋連續(xù)傳3代，結果顯示，PK-15-IL-10細胞中的PCV2極顯著高于PK-15細胞(P<0.01，圖14)。說明PCV2在過表達IL-10的細胞系中病毒復制量顯著增加。

2.6.3 間接免疫熒光檢測結果 將接種PCV2 48 h的細胞進行間接免疫熒光檢測，結果顯示，在PK-15-IL-10、PK-15細胞中均可看到熒光，與PK-15細胞相比，PK-15-IL-10細胞中熒光更強(圖15)。

與PK-15相比，**,差異極顯著(P<0.01)。圖14、17同Compared with PK-15,**,Extremely significant difference (P<0.01).The same as fig.14 and fig.17圖13 PCV2拷貝數(shù)Fig.13 PCV2 copy number

圖14 PCV2基因組的拷貝數(shù)Fig.14 Copy number of the PCV2 genome

圖15 免疫熒光試驗檢測PCV2對PK-15細胞的感染結果(100×)Fig.15 Immunofluorescence assay to detect the infection of PCV2 on PK-15 cells (100×)

2.6.4 病毒滴度及生長曲線測定 PCV2感染PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15細胞后，用Karber法計算所得病毒滴度分別為1×107.5、1×104.5和1×104.65TCID50/0.1 mL,且PK-15-IL-10細胞中病毒滴度極顯著高于PK-15-pCDH和PK-15細胞(P<0.01，圖16)。生長曲線顯示，PCV2在PK-15-IL-10細胞中的TCID50在感染后48 h極顯著高于PK-15細胞(P<0.01，圖17)。

圖16 PCV2病毒滴度比較Fig.16 Virus titer comparison of PCV2

圖17 PCV2生長曲線圖Fig.17 Growth cruve of PCV2

3 討 論

PCV2是公認的對豬場威脅最廣泛的病原體之一，市場上有各種商業(yè)疫苗和診斷試劑，但疫苗的開發(fā)和生產需要高產量的PCV2[17]。目前，PK-15細胞普遍用于PCV2的增殖，由于PCV2的DNA復制依賴于細胞核中細胞分裂的S期和G2/M期，其合成依賴于細胞S期表達的細胞酶，病毒DNA不能自己穿透核膜，這減慢了PK-15細胞的增殖，而且體外培養(yǎng)得到的PCV2病毒滴度相對較低，從而限制了疫苗的生產[14]。因此，篩選PCV2高感染性細胞系和提高PCV2病毒滴度具有重要意義。Sachdeva等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在細胞培養(yǎng)中添加氨基葡萄糖、細胞因子(IL-2、IFN-α、IFN-γ)、熱休克蛋白90或Tween-20等，可使含有病毒抗原的細胞數(shù)量增加50倍,并篩選出穩(wěn)定的PK-15細胞系。Ma等用[19]豬IL-2基因轉染PK-15細胞建立了PCV2在體外的高增殖細胞系；Sachdeva等[18]利用慢病毒載體通過轉導將基因轉入有絲分裂細胞和非有絲分裂細胞，實現(xiàn)在細胞中高效、安全、持久表達目的基因。因此，本研究中選用了慢病毒過表達載體。

PCV2通過感染豬肺泡巨噬細胞(PAMs)進入豬體內后，能通過不斷地在細胞內復制實現(xiàn)持續(xù)性感染，在感染后易引發(fā)與其他細菌或病毒病的混合性感染，造成這一現(xiàn)象的機制尚不明確[20]。PCV2感染后期IL-10基因的表達量增加，處于亞臨床PCV2感染的豬，瞬時的IL-10反應與感染的病毒量相關[21-22]。利用PCV2體外誘導表達IL-10可減少IFN-γ的分泌量，說明使用PCV2誘導IL-10的產生可改變抗原刺激反應[23]。本研究通過構建過表達IL-10慢病毒載體，篩選出過表達IL-10的穩(wěn)轉PK-15細胞系，并研究該細胞系體外復制PCV2的作用，為多種細胞試驗及動物試驗的簡便性與安全性等研究提供了參考。結果表明，IL-10的高表達促進了PCV2在PK-15細胞中的復制，這一發(fā)現(xiàn)或許可用于擴增高滴度病毒細胞系的構建，為臨床上免疫抑制的防控提供科學依據(jù)。IL-10作為PCV2感染后誘導機體分泌增加的免疫抑制細胞因子，是多種病毒逃逸人類免疫系統(tǒng)的靶點[24]，它與病毒持續(xù)感染和清除密切相關，推測其可能直接介導PCV2免疫抑制發(fā)生，是促進機體發(fā)生混合感染的重要原因，IL-10的高表達對病毒增殖的促進作用也可能是導致混合感染的重要原因[25]，這有利于臨床防控，但可能存在更復雜的機制，具體仍需進一步研究。綜上所述，IL-10的高表達促進了PCV2的復制，在PCV2免疫抑制中具有重要意義，篩選出的穩(wěn)定表達豬IL-10的PK-15-IL-10細胞更容易感染PCV2，是一類很有潛力的疫苗生產細胞系。

4 結 論

本研究成功構建了pCDH-CMV-IL-10的慢病毒表達載體，并建立穩(wěn)定過表達IL-10的PK-15細胞系。通過實時熒光定量PCR、Western blotting、IFA等方法鑒定分析發(fā)現(xiàn)，過表達IL-10可以促進PCV2在PK-15細胞中的復制。試驗篩選得到的PK-15-IL-10細胞系，是一類很有潛力的疫苗生產細胞系。