miR-188對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響

朱新穎，郭 帥，戰(zhàn)曉燕，鐘登科，鄭江平，滑志民，李天順

(1.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201699；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070)

乳腺腫瘤在母犬中高發(fā)，且約50%的乳腺腫瘤為惡性腫瘤，犬乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的演變過程，與周圍環(huán)境中的種種致癌因素或機(jī)體內(nèi)部抗腫瘤能力降低等有關(guān)，其中促癌基因的激活、抑癌基因的失活及細(xì)胞凋亡的抑制在該過程中均發(fā)揮重要的作用[1-2]。盡管乳腺癌復(fù)雜分子機(jī)制的研究正在廣泛進(jìn)行中，但新療法的開發(fā)和精準(zhǔn)診斷及預(yù)后仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)[3]。犬乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的疾病，目前對(duì)其的治療策略尚存在較大局限，且隨著養(yǎng)犬?dāng)?shù)量的不斷提高，開發(fā)安全、高效的治療方法已成為獸醫(yī)臨床亟需解決的難題。分子治療藥物在寵物臨床中使用還相對(duì)較少，通過發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控分子來抑制癌細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能為犬乳腺癌的治療提供潛在的治療策略，進(jìn)而推進(jìn)開發(fā)新的、有效的犬乳腺癌治療藥物[4]。

微小RNA(miRNA)是內(nèi)源性非編碼RNA(ncRNA)，長(zhǎng)度約為22 nt，可作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑，并可以調(diào)節(jié)約30%的蛋白質(zhì)編碼基因[5]。miRNA在多種體液中的表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，是目前研究惡性腫瘤生物標(biāo)記物的熱點(diǎn)，miRNA與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在著密切關(guān)系，既可下調(diào)原癌基因的表達(dá)，又可上調(diào)抑癌基因的表達(dá)[6-7]。研究表明，miRNA通過與特異性靶基因的結(jié)合參與調(diào)控多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡、轉(zhuǎn)移等生物過程[8]。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是惡性腫瘤侵襲的重要指標(biāo)，晚期乳腺癌細(xì)胞的侵襲主要是因?yàn)榛|(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)活性升高或者表達(dá)量的升高，其中MMP-9可以破壞細(xì)胞外基質(zhì)，從而增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力，因此MMP-9也被認(rèn)為是評(píng)判癌細(xì)胞侵襲能力的標(biāo)志之一[9-10]。microRNA-188-5p(miR-188)的過表達(dá)與肝細(xì)胞癌、胃癌和前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[11-12]。miRNA作為促癌因子或腫瘤抑制因子取決于它所靶向的mRNA的功能。林建姣等[13]研究表明，miR-188通過靶向作用于鋅指蛋白91(ZFP91)可治療胃癌。本研究前期在BALB/c小鼠移植瘤模型中進(jìn)行了大量的預(yù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-188在小鼠乳腺癌移植瘤模型中表達(dá)量顯著下降，在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)擬研究miR-188在小鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1)增殖、遷移和凋亡過程中的調(diào)控作用，揭示miR-188對(duì)乳腺癌的生物學(xué)行為功能的影響，旨在為乳腺癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 4T1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院蘇州生命科學(xué)研究院。

1.1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)6～8周齡BALB/c小鼠購(gòu)自湖北省華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，平均體重為18～25 g。小鼠均飼養(yǎng)在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，光照條件為：12 h黑暗，12 h光照，相對(duì)恒定濕度為40%～60%，恒定溫度為26～28 ℃，自由飲食。所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理方案經(jīng)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物福利和使用機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院公布的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和使用指南。

1.1.3 主要試劑及儀器 RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購(gòu)自HyClone公司；SDS-PAGE試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；TRIzol?試劑購(gòu)自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自蘇州吉瑪基因股份有限公司；試驗(yàn)中所用抗體均購(gòu)自CST公司。熒光定量PCR儀(FDQ48A)購(gòu)自Applied Biosystems公司；冷凍離心機(jī)(MX-160)購(gòu)自TOMY公司；普通臺(tái)式離心機(jī)(HC-3018)購(gòu)自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡(CKX41)購(gòu)自O(shè)lympus公司；電子天平(AUY120)購(gòu)自SHIMADZU公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱(HERA CELL 150i)購(gòu)自Thermo公司；凝膠成像系統(tǒng)(Universal Hood Ⅱ)購(gòu)自Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀(CytoFLEX)購(gòu)自Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將4T1細(xì)胞解凍復(fù)蘇后，用含10% FBS和1%青-鏈霉素的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 腫瘤模型構(gòu)建及樣品采集 用生理鹽水將4T1細(xì)胞調(diào)至2×107/mL，分散接種至12只雌性BALB/c小鼠第4乳腺區(qū)皮下脂肪墊，1只小鼠的1個(gè)乳腺區(qū)接種100 μL，5～7 d乳腺部位長(zhǎng)出肉眼可見的腫瘤。每日觀察小鼠精神狀態(tài)、飲食、排泄、毛色及活動(dòng)狀態(tài)，每周測(cè)量2次腫瘤大小及小鼠體重。當(dāng)腫瘤直徑超過20 mm，體重減輕超過10%或者小鼠處于嚴(yán)重惡病質(zhì)狀態(tài)時(shí)，對(duì)小鼠進(jìn)行安樂死，并分離腫瘤組織及瘤旁組織，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中miR-188的序列(序列號(hào)：387183)，用Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)miR-188、miR-188模擬物(miR-188 mimics)、模擬物對(duì)照(mimics-NC)、miR-188抑制物(miR-188 inhibitor)和抑制物對(duì)照(inhibitor-NC)等的引物，具體信息見表1。引物均由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 以2×105/孔將4T1細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)60%時(shí)按照LipofectamineTM2000說明書混合miR-188 mimics、mimics-NC、inhibitor-NC、miR-188 inhibitor共4組轉(zhuǎn)染液，分別吸取100 μL混合液加入已準(zhǔn)備好的細(xì)胞中，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板使其混合均勻，轉(zhuǎn)染后4～6 h更換含10% FBS和1%青-鏈霉素的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基。以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)20 h。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用TRIzol?試劑從腫瘤和瘤旁組織及轉(zhuǎn)染miR-188 mimics、mimics-NC、miR-188 inhibitor、inhibitor-NC和對(duì)照組的細(xì)胞中提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，miR-188表達(dá)水平的檢測(cè)按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行，以U6為內(nèi)參。通過2-ΔΔCt分析，比較各組miR-188的表達(dá)情況。各組均設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.6 miR-188對(duì)細(xì)胞增殖的影響 以5×103/孔將4T1細(xì)胞接種在96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后按照1.2.4方法進(jìn)行mimics-NC、miR-188 mimics、inhibitor-NC、miR-188 inhibitor轉(zhuǎn)染。分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h棄去培養(yǎng)液，每孔加入含有10% CCK-8試劑的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育2 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)D450 nm值。以D450 nm值為縱坐標(biāo)、時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 miR-188對(duì)細(xì)胞遷移的影響 以2×105/孔將4T1細(xì)胞接種在6孔板中，培養(yǎng)24 h后按照1.2.4方法進(jìn)行mimics-NC、miR-188 mimics、inhibitor-NC、miR-188 inhibitor轉(zhuǎn)染。使用記號(hào)筆進(jìn)行標(biāo)記，用尺子每隔0.5 cm均勻劃出一條水平線，穿過孔，每孔至少過3條線。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到95%時(shí)，用200 μL的滅菌槍垂直劃線，PBS洗3次，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。于劃線后0和24 h分別拍照，用Image J v1.8.0軟件計(jì)算各組劃痕面積，并檢測(cè)MMP-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8 miR-188對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 將2×105/孔將4T1細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)按1.2.4方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)20 h。用不含EDTA的0.25%胰酶消化，4 ℃、3 000×g離心5 min收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次。按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)處理，處理結(jié)束的樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，使用Flowjo軟件對(duì)流式結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.9 Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 以2×105個(gè)/孔將4T1細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)按1.2.4方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)20 h。棄去培養(yǎng)液，PBS清洗3次，每孔加入300 μL RIPA裂解液(含PMSF)，收集細(xì)胞于離心管中，冰上裂解30 min，4 ℃離心收集細(xì)胞上清。通過BCA檢測(cè)試劑盒測(cè)定MMP-9、聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP1)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和Bcl-2-Associated X蛋白(Bax)的濃度。配制SDS-PAGE凝膠，每孔上樣等量的變性蛋白，電泳分離蛋白條帶，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，低溫轉(zhuǎn)膜1.5～2 h。將膜置于5%脫脂牛奶中， 室溫孵育2 h， 用0.1% TBST溶液漂洗3次，每次5～10 min，加一抗MMP-9(1∶1 000)、PARP1(1∶2 000)、Caspase-3(1∶2 000)、Bax(1∶2 000)、Bcl-2(1∶2 000) 4 ℃孵育過夜。用0.1% TBST溶液漂洗3次，每次5～10 min。二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，0.1% TBST漂洗3次，每次10 min，用ECL試劑進(jìn)行顯色，使用Image J v1.8.0軟件分析蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)差異分析,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 miR-188在小鼠乳腺癌移植瘤模型中的表達(dá)水平

在4T1小鼠移植瘤模型中分離出腫瘤和瘤旁組織，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-188的表達(dá)水平,結(jié)果顯示，相對(duì)于瘤旁組織，miR-188在腫瘤組織中表達(dá)量顯著降低(P<0.05，圖1)。

2.2 miR-188轉(zhuǎn)染對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與空白對(duì)照相比，mimics-NC與inhibitor-NC組均無顯著差異(P>0.05)，說明mimics-NC與inhibitor-NC對(duì)miR-188的表達(dá)無影響，可作為對(duì)照進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)的分析。與mimics-NC組相比，miR-188 mimics組miR-188的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05);與inhibitor-NC組相比，miR-188 inhibitor組miR-188的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(圖2A)(P<0.05)。細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明，與mimics-NC組相比，miR-188 mimics組4T1細(xì)胞的增殖速率顯著降低；與inhibitor-NC組相比，miR-188 inhibitor組4T1細(xì)胞的增殖速率顯著增加(P<0.05,圖2B)。

2.3 miR-188對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響

由圖3可知，與mimics-NC組相比，miR-188 mimics組4T1細(xì)胞的遷移速率顯著降低(P<0.05)；與inhibitor-NC組相比,miR-188 inhibitor組 4T1細(xì)胞的遷移速率顯著提高(P<0.05)；Western blotting結(jié)果顯示，與mimics-NC組相比，miR-188 mimics組MMP-9蛋白的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，進(jìn)一步表明miR-188具有抑制4T1細(xì)胞遷移的能力。

2.4 miR-188對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

由圖4可知，與mimics-NC組相比,miR-188 mimics組4T1細(xì)胞的凋亡率顯著降低(P<0.05);與inhibitor-NC組相比,miR-188 inhibitor組4T1細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。

2.5 miR-188對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

由圖5可知，與mimics-NC組相比，miR-188 mimics組4T1細(xì)胞PARP1、Caspase-3和Bax促凋亡蛋白的表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)， 抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與inhibitor-NC組相比，miR-188 inhibitor組Caspase-3和Bax促凋亡蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

*，差異顯著(P<0.05)；無標(biāo)記，差異不顯著(P>0.05)。下同*,Significant difference (P <0.05);No marker,No significant difference (P>0.05).The same as below圖1 miR-188在乳腺癌組織中的表達(dá)情況Fig.1 The expression of miR-188 in breast cancer tissues

圖2 各組4T1細(xì)胞miR-188的相對(duì)表達(dá)水平(A)及增殖情況(B)Fig.2 The relative expression level of miR-188 (A) and proliferation (B) of 4T1 cells in each group

A、B，各組4T1細(xì)胞遷移情況及遷移率統(tǒng)計(jì)；C，Western blotting檢測(cè)MMP-9蛋白表達(dá)；D,MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量A and B，Cell migration and migration rate statistics of 4T1 cells in each group;C，Western blotting was used to detect the expression of MMP-9 protein；D,The relative expression of MMP-9 protein圖3 各組4T1細(xì)胞遷移及遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.3 Cell migration and expression of migration related proteins of 4T1 cells in each group

A，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組4T1細(xì)胞凋亡；B，凋亡率A，F(xiàn)low cytometry was used to detect apoptosis of 4T1 cells in each group;B,Apoptosis rate圖4 各組4T1細(xì)胞凋亡情況Fig.4 Apoptosis of 4T1 cells in each group

①A，Western blotting檢測(cè)各組4T1細(xì)胞PARP1、Caspase-3、Bax和Bcl-2的表達(dá)水平；B，PARP1、Caspase-3、Bax和Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量。②與對(duì)照組(inhibitor-NC/mimics-NC)相比，*，差異顯著(P<0.05)；無*，差異不顯著(P>0.05)①A，Western blotting was used to analyze the expression levels of PARP1,Caspase-3,Bax and Bcl-2 of 4T1 cell in each group;B,The relative expression levels of PARP1,Caspase-3,Bax and Bcl-2.②Compared with control group (inhibitor-NC/mimics-NC),*,Significant difference (P<0.05)；No *,No significant difference (P>0.05)圖5 各組4T1細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.5 The expression of apoptosis related proteins of 4T1 cells in each group

3 討 論

近年來，伴侶動(dòng)物已成為人類家庭成員的重要一員，寵物犬的數(shù)量逐年增加，腫瘤性疾病暴露的風(fēng)險(xiǎn)也在加大。傳統(tǒng)的治療方案(如放化療和手術(shù)摘除等)對(duì)患者本身傷害很大，且有一定的局限性[14]，新型的分子治療方法受到越來越多的青睞。相關(guān)研究證實(shí)，一半以上的miRNA基因的調(diào)控區(qū)域都與癌癥相關(guān)，在多種類型腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[15]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-188在犬乳腺腫瘤中的表達(dá)量顯著降低，說明其可能與乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，miR-188可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖和遷移，在乳腺腫瘤的治療中，miR-188可通過靶向白介素6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物(IL6ST)發(fā)揮其抗乳腺腫瘤作用[16]，也可通過PI3K/Akt/MMP-2/9信號(hào)通路抑制瘢痕瘤的增殖和侵襲[17]。此外，Zhao等[18]研究報(bào)道，miR-188在抑制肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用，且miR-188可以通過靶向鋅指蛋白91(ZFP91)抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲[13]。miR-188過表達(dá)或抑制與乳腺癌的治療密切相關(guān)，本研究與Wang等[19]研究結(jié)果相似，miR-188可顯著抑制乳腺腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

凋亡是細(xì)胞為了適應(yīng)外界刺激發(fā)生的程序性的死亡，當(dāng)基因受到不同因素的影響而異常表達(dá)時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞生長(zhǎng)失控而引發(fā)腫瘤。許多原癌基因和抑癌基因都是通過控制細(xì)胞凋亡而誘導(dǎo)或抑制腫瘤的發(fā)生。這些基因調(diào)控的紊亂造成細(xì)胞生長(zhǎng)的失控，正常凋亡程序受阻而形成細(xì)胞的惡變和無限增殖。因此，有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡對(duì)腫瘤的治療有重要意義。在乳腺腫瘤方面，miRNA對(duì)犬腫瘤細(xì)胞凋亡具有一定的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a調(diào)節(jié)可能有助于與肥大細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系共培養(yǎng)的犬成纖維細(xì)胞的激活，通過促進(jìn)犬肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡而促進(jìn)犬成纖維細(xì)胞的增殖[20]。此外，眾多miRNA在犬乳腺腫瘤中發(fā)揮重要的作用。如miR-15a、miR-16在犬管狀乳頭狀癌中表達(dá)顯著下調(diào)，而miR-181b、miR-21、miR-29b、let-7f在犬管狀乳頭狀癌中表達(dá)顯著上調(diào)，其通過促進(jìn)或抑制犬乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡而調(diào)節(jié)乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展[21]。目前，miR-188在犬乳腺腫瘤中的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。研究表明，miR-188可通過抑制人10號(hào)染色體缺失的磷酸酶(PTEN)的表達(dá)促進(jìn)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而緩解慢性髓細(xì)胞白血病的發(fā)病進(jìn)程[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-188的過表達(dá)顯著提高了PARP1、Caspase-3和Bax促凋亡蛋白的表達(dá)，抑制抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，說明miR-188可顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。

miRNA具有多種生物學(xué)活性，并且參與生命機(jī)體多種功能的調(diào)節(jié)過程，其主要通過靶向mRNA發(fā)揮其生物學(xué)活性，可作為下一步重點(diǎn)探究的內(nèi)容，且miR-188還有眾多已知預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，在犬乳腺癌的治療中還需進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

miR-188可顯著抑制4T1細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)PARP1、Caspase-3和Bax促凋亡蛋白的表達(dá)，抑制抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而抑制乳腺癌的發(fā)展進(jìn)程，可為未來乳腺癌相關(guān)治療藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。