致病性大腸桿菌攜帶原噬菌體的預(yù)測及耐藥性與毒力研究

祝希輝，龐喆羽，王志偉，裴蘭英，曹勝亮，薛希娟，李玉保

(1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，聊城 252059，2.山東信得科技股份有限公司，青島 266000)

大腸桿菌大量存在于環(huán)境中，可分為共生菌株和致病性菌株，致病性菌株又分為腸道致病性菌株和腸道外致病性菌株[1]。腸道致病性菌株可引起人和動(dòng)物的腸炎和腹瀉，某些血清型甚至?xí)?dǎo)致死亡[2]。腸道外致病性菌株可導(dǎo)致人或動(dòng)物的尿路感染、新生兒腦膜炎與敗血癥，以及禽的呼吸系統(tǒng)疾病，可引起禽的急性死亡[3]。

致病性大腸桿菌對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)對(duì)人類和公共衛(wèi)生安全構(gòu)成威脅。近年來，由于抗生素長期不科學(xué)使用，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥性快速攀升[4]。為有效控制細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，中國在飼料端禁用抗生素，在養(yǎng)殖端限用抗生素。因此，亟需尋找一種新型抗生素替代物用于大腸桿菌病的防治。噬菌體(bacteriophage)是能感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱[5]，可特異性殺滅細(xì)菌而不破壞機(jī)體的菌群平衡[6]，具有廣闊的應(yīng)用前景[7]。根據(jù)生活周期，噬菌體可分為烈性噬菌體和溫和性噬菌體。在短時(shí)間內(nèi)連續(xù)完成吸附、侵入、增殖、裝配和裂解釋放5個(gè)階段而實(shí)現(xiàn)其增殖的噬菌體稱為烈性噬菌體；溫和噬菌體侵入宿主菌后并不發(fā)生裂解，而是整合到細(xì)菌基因組中，整合到細(xì)菌基因組的噬菌體稱為原噬菌體(prophage)。研究證明，原噬菌體可通過水平轉(zhuǎn)移等方式影響細(xì)菌的耐藥性、毒力、生物膜形成及環(huán)境耐受力等特性，如霍亂弧菌的霍亂毒素(cholera toxin，CT)的編碼基因(ctxA和ctxB)位于原噬菌體CTXφ上，通過構(gòu)建霍亂弧菌CTXφ缺失突變株發(fā)現(xiàn)，原噬菌體CTXφ缺失使染色體上的調(diào)控基因aphA的轉(zhuǎn)錄水平降低，進(jìn)而影響到形成生物被膜的基因表達(dá)，使其喪失生物被膜形成能力[8]。劉云等[9]通過構(gòu)建原噬菌體缺失突變株發(fā)現(xiàn)，相較于野生株，缺失突變株的耐酸、耐堿、耐氧化應(yīng)激能力下降，表明原噬菌體提高了菌株的環(huán)境耐受性。此外，原噬菌體還可通過編碼細(xì)菌毒素和調(diào)控毒素的產(chǎn)生與釋放來調(diào)控細(xì)菌的毒力[10]。本試驗(yàn)對(duì)NCBI中公布的不同大腸桿菌序列進(jìn)行原噬菌體預(yù)測及分析，了解大腸桿菌攜帶原噬菌體及原噬菌體攜帶耐藥基因、毒力基因情況，以期為大腸桿菌噬菌體的基礎(chǔ)研究及噬菌體制劑研發(fā)提供一個(gè)新的視角與借鑒。

1 材料與方法

1.1 大腸桿菌全基因組來源

自NCBI中查詢大腸桿菌全基因組數(shù)據(jù)，最后訪問時(shí)間為2021年6月6號(hào)，本研究主要考慮致病性大腸桿菌攜帶原噬菌體情況，而NCBI中公布的大腸桿菌全基因組截至2021年6月6號(hào)有26 084株，考慮到工作量巨大及大腸桿菌人畜共患的特點(diǎn)，因此，試驗(yàn)隨機(jī)下載了2010-2021年公布的來自12個(gè)國家的112株致病性大腸桿菌進(jìn)行分析(表1)。由于NCBI中收錄的樣品地域性較強(qiáng)，美國的樣品占41.07%，中國的樣品占30.36%，而其他10個(gè)國家的數(shù)據(jù)占比相對(duì)較少(占28.57%)。

表1 大腸桿菌分離年份與地區(qū)

1.2 原噬菌體預(yù)測

PHASTER(http:∥phaster.ca/)用于快速識(shí)別和注釋細(xì)菌基因組和質(zhì)粒中的噬菌體序列，功能較全，且采用近幾年最新的識(shí)別和處理數(shù)據(jù)策略，是一種實(shí)用的前噬菌體在線預(yù)測工具[11]。將獲得的不同地域不同時(shí)間的大腸桿菌全基因序列統(tǒng)一整理為FASTA文件，使用原噬菌體在線預(yù)測工具PHASTER預(yù)測大腸桿菌基因組中的原噬菌體序列，PHASTER根據(jù)細(xì)菌中CDS的數(shù)量及含有的噬菌體序列進(jìn)行打分，預(yù)測結(jié)果分為完整型噬菌體(>90分)、疑似型噬菌體(90～70分)、缺陷型噬菌體(<70分)3種。下載網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果，獲得所測菌株中預(yù)測的原噬菌體數(shù)量、在染色體上的具體位置、GC含量等信息，留存并用于分析。

1.3 原噬菌體分類

PHASTER網(wǎng)站對(duì)每一個(gè)原噬菌體給出了相似性最高的噬菌體，將其作為一種噬菌體類型，統(tǒng)計(jì)所有完整性原噬菌體所對(duì)應(yīng)的最相似噬菌體數(shù)目，可對(duì)原噬菌體進(jìn)行初步分類，同時(shí)在NCBI中查詢每個(gè)最相似噬菌體所屬的種屬，對(duì)原噬菌體的種屬分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 原噬菌體攜帶抗生素耐藥基因預(yù)測

將從NCBI中下載并命名整理好的大腸桿菌FASTA格式文件，輸入到抗生素耐藥基因(antibiotic resistance genes，ARGs)數(shù)據(jù)庫[12](https:∥card.mcmaster.ca)，預(yù)測大腸桿菌完整型原噬菌體所攜帶的耐藥基因、耐藥基因家族、耐藥表型、耐藥機(jī)制并加以分析。

1.5 原噬菌體攜帶毒力基因預(yù)測

將從NCBI中下載并命名整理好的大腸桿菌FASTA格式文件，輸入到毒力因子數(shù)據(jù)庫[13](http:∥www.mgc.ac.cn/VFs/main.html)中，預(yù)測大腸桿菌完整型原噬菌體中攜帶的毒力基因數(shù)目及毒力基因家族分布情況。

2 結(jié) 果

2.1 原噬菌體預(yù)測情況

2.1.1 112株大腸桿菌的原噬菌體預(yù)測情況 預(yù)測結(jié)果顯示，112株大腸桿菌攜帶完整型原噬菌體1 024個(gè)，疑似型原噬菌體287個(gè)，缺陷型原噬菌體505個(gè)(圖1)。每株大腸桿菌平均攜帶完整型原噬菌體9.1個(gè)，疑似型原噬菌體2.6個(gè)，缺陷型原噬菌體4.5個(gè)(圖2)。

2.1.2 完整型原噬菌體分類情況 PHASTER統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，1 024個(gè)完整型原噬菌體共有63種噬菌體類型，其中BP4795(登錄號(hào)：NC_004813.1)類型的占比最高，達(dá)到19.24%(197/1 024)，其次是DE3(登錄號(hào)：NC_042057.1)，占比11.72%(120/1 024)，LAMBDA(登錄號(hào)：NC_001416.1)、MEP460(登錄號(hào)：NC_019716.1)、P88(登錄號(hào)：NC_026014.1)、CDTL(登錄號(hào)：NC_009514.1)分別占比8.89%(91/1 024)、6.74%(69/1 024)、6.15%(63/1 024)和5.47%(56/1 024)。另外還有12種噬菌體類型占比在1%～5%(對(duì)應(yīng)的完整型前噬菌體數(shù)目占總完整型原噬菌體數(shù)目的比例)，30種噬菌體類型占比在1%以下，16種噬菌體類型僅有1個(gè)完整型原噬菌體對(duì)應(yīng)。占比超過5%的噬菌體類型除P88 外均為長尾噬菌體科，在占比5%以下的噬菌體類型中長尾噬菌體占比最高。因此本研究中的完整型前噬菌體所對(duì)應(yīng)的噬菌體類型大多是長尾噬菌體科，而短尾與肌尾噬菌體科相對(duì)較少，具體分布見表2。

圖1 112株大腸桿菌原噬菌體預(yù)測數(shù)目統(tǒng)計(jì)Fig.1 Statistics of predicted number of prophage of 112 strains of E. coli

圖2 平均每株大腸桿菌攜帶原噬菌體數(shù)目Fig.2 Average number of prophage per strain of E. coli

表2 完整型原噬菌體類型分布

2.2 原噬菌體的基因組分析

大腸桿菌原噬菌體基因組大小為3.1～152.6 kb，具體分布見表3，其中80 kb以內(nèi)的原噬菌體占97.03%(1 762/1 816)。大腸桿菌攜帶原噬菌體的GC含量在38%～57%之間(表4)，其中完整型原噬菌體基因組較大，且差別也較大，大小在5.6～152.6 kb，基因組大小在20～80 kb之間的占比88.97%(911/1 024)，基因組GC含量在44%～52%之間的占比93.07%(953/1 024)；疑似型原噬菌體基因組較小，在3.6～63.8 kb之間，40 kb以內(nèi)占比91.29%(262/287)，GC含量在44%～52%之間占比82.58%(237/287)；缺陷型原噬菌體基因組最小，在3.1～47.7 kb之間，大部分在40 kb以內(nèi)，占比98.61%(498/505)，GC含量在44%～52%之間，占比84.56%(427/505)。大腸桿菌原噬菌體占細(xì)菌全基因組的比例在0.05%～3.01%之間，其中大部分處于0.1%～1.2%之間(圖3)。

表3 不同類型大腸桿菌原噬菌體基因組大小分布

表4 不同類型大腸桿菌原噬菌體GC含量分布

圖3 原噬菌體基因占細(xì)菌基因組的比例Fig.3 Percentage of prophage in bacterial genome

2.3 大腸桿菌原噬菌體攜帶AGRs的預(yù)測統(tǒng)計(jì)

通過CARD耐藥基因數(shù)據(jù)庫對(duì)大腸桿菌原噬菌體進(jìn)行檢測，探討AGRs在大腸桿菌原噬菌體中的分布情況，結(jié)果表明，1 024個(gè)完整型原噬菌體中攜帶1個(gè)或多個(gè)AGRs的有65個(gè)，攜帶率為6.35%，65個(gè)完整型原噬菌體共攜帶耐藥基因253個(gè)，其中以大環(huán)內(nèi)酯類(13.83%)、香豆素類(8.70%)、頭孢菌素類(8.30%)、四環(huán)素類(7.11%)、利福霉素(6.72%)、氨基糖苷類(6.32%)為主，具體分布情況見圖4。

253個(gè)耐藥基因分別來自11個(gè)抗生素耐藥基因家族，其中以耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化(resistance-nodulation-cell division，RND)家族、小多重耐藥(small multidrug resistance，SMR)家族、β-內(nèi)酰胺滲透性(general bacterial porin with reduced permeability to beta-lactams)家族、主要協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族 (major facilitator superfamily，MFS)為主，具體分布情況見圖5。

65個(gè)完整型原噬菌體耐藥機(jī)制主要顯示出5種模式，包括抗生素外排、抗生素滲透性降低、抗生素滅活、靶點(diǎn)代替、靶點(diǎn)改變，其中以抗生素外排為主(93.80%)，具體分布情況見圖6。

2.4 原噬菌體攜帶毒力基因預(yù)測

將1 024個(gè)完整型原噬菌體的基因序列提交到VFDB毒力因子數(shù)據(jù)庫中，了解大腸桿菌原噬菌體中攜帶的毒力因子情況，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，1 024個(gè)完整型原噬菌體中，攜帶1個(gè)或多個(gè)毒力基因的共438個(gè)，攜帶率高達(dá)42.78%，438個(gè)含有毒力基因的完整型原噬菌體共攜帶毒力基因1 274個(gè)，平均每個(gè)攜帶2.9個(gè)毒力基因，這1 274個(gè)毒力基因分別來自9個(gè)不同毒力因子家族(圖7)，包括NLE家族(793/1 274)、毒素相關(guān)家族(253/1 274)、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)家族(148/1 274)、黏附相關(guān)家族(33/1 274)、自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)家族(20/1 274)、分泌相關(guān)家族(10/1 274)、鐵/錳運(yùn)輸相關(guān)家族(12/1 274)、LEE家族(2/1 274)及沙門氏菌應(yīng)激蛋白相關(guān)家族(3/1 274)。

圖4 完整型原噬菌體耐藥表型分布Fig.4 Distribution of drug resistance phenotypes among intact prophage

圖5 完整型原噬菌體攜帶耐藥基因家族分布Fig.5 Distribution of drug resistance gene family carried by intact prophage

圖6 完整型原噬菌體攜帶耐藥基因耐藥機(jī)制分布Fig.6 Distribution of drug resistance mechanism of drug resistance gene carried by intact prophage

圖7 原噬菌體攜帶毒力基因家族分布Fig.7 Distribution of virulence gene family carried by prophage

3 討 論

通過數(shù)據(jù)分析，112株大腸桿菌攜帶原噬菌體數(shù)目高達(dá)1 816個(gè)，平均每株大腸桿菌僅完整型原噬菌體就可攜帶9.1個(gè)，表明大腸桿菌普遍攜帶原噬菌體。對(duì)大腸桿菌原噬菌體的分析表明，大腸桿菌原噬菌體可攜帶耐藥基因與毒力基因，完整型原噬菌體耐藥基因攜帶率為6.35%，毒力基因攜帶率為42.78%。目前在多種細(xì)菌的原噬菌體中發(fā)現(xiàn)了抗生素耐藥基因，如在大腸桿菌和沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)了P1-like噬菌體攜帶blaSHV-2和blaCTX-M-27β-內(nèi)酰胺酶基因[14-15]；在豬源大腸桿菌和人源臨床肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)P7-like噬菌體攜帶多黏菌素耐藥基因MCR-1[16-17]；在西班牙某醫(yī)院分離到的多個(gè)腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因blaCTX-M-10與原噬菌體存在偶聯(lián)關(guān)系[18]。 原噬菌體攜帶耐藥基因可能會(huì)增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥性，使其更容易適應(yīng)環(huán)境[19]。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，完整型原噬菌體攜帶大量毒力基因，提示原噬菌體可能會(huì)影響細(xì)菌的毒力。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶毒力基因的溫和性噬菌體侵入宿主細(xì)菌后成為原噬菌體，原噬菌體中的毒力基因被表達(dá)使菌株產(chǎn)毒，因此病原菌就依賴原噬菌體編碼的基因產(chǎn)生更多毒素[10]。大多數(shù)情況下，原噬菌體整合的位置在非編碼RNA，但少數(shù)溫和性噬菌體整合到細(xì)菌編碼蛋白質(zhì)的基因中，從而破壞了該蛋白質(zhì)的功能，如果這個(gè)蛋白質(zhì)是毒力因子，那么細(xì)菌的毒力則會(huì)下降，因此，原噬菌體對(duì)于細(xì)菌的毒力不僅僅是增強(qiáng)，少數(shù)情況也會(huì)降低[20]。同一種原噬菌體對(duì)一種細(xì)菌中的不同菌株毒力的影響效果不同，有的使其毒力增強(qiáng)，而有的則使其毒力減弱。研究發(fā)現(xiàn)，原噬菌體BTP1上的bstA基因編碼一個(gè)功能尚未知的蛋白，其在不同血清型的同種細(xì)菌上表現(xiàn)出增強(qiáng)或減弱毒力兩種不同的效果，這些現(xiàn)象體現(xiàn)出原噬菌體對(duì)細(xì)菌毒力影響的復(fù)雜性[21-23]。

另外，原噬菌體中還攜帶有一部分黏附相關(guān)基因，提示原噬菌體的存在可能與細(xì)菌黏附能力的高低相關(guān)。原噬菌體可以影響細(xì)菌的黏附能力，這與本試驗(yàn)預(yù)測到的原噬菌體中攜帶黏附相關(guān)毒力基因的發(fā)現(xiàn)相符，細(xì)菌感染的第一步是黏附到機(jī)體組織細(xì)胞表面，原噬菌體能夠增強(qiáng)宿主細(xì)菌對(duì)組織細(xì)胞的黏附性[10]。研究發(fā)現(xiàn)，缺失原噬菌體phiv142-3的大腸桿菌菌株的菌落變小，對(duì)DF-1細(xì)胞的黏附力降低，對(duì)血清殺傷作用的抵抗力明顯降低，在酸、堿和氧化應(yīng)激下的存活率分別降低95.6%、71.6%和99.6%[24]。原噬菌體編碼的蛋白還可以增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)宿主血小板和免疫球蛋白的黏附能力，以增強(qiáng)細(xì)菌的毒力[25-26]。值得注意的是，在本次數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌原噬菌體中含有沙門氏菌應(yīng)激蛋白相關(guān)基因，提示原噬菌體可能是毒力基因跨菌種傳播的一個(gè)途徑，相關(guān)研究還有待進(jìn)一步深入，但噬菌體及原噬菌體在同種細(xì)菌、不同種細(xì)菌甚至不同物種之間介導(dǎo)水平基因轉(zhuǎn)移的作用不可忽視[10,27-28]。

大腸桿菌攜帶原噬菌體及原噬菌體攜帶耐藥基因與毒力基因的現(xiàn)象提示，大腸桿菌原噬菌體可影響大腸桿菌自身的耐藥性、毒力及環(huán)境適應(yīng)性等一系列特性，改變大腸桿菌的變異頻率，這些影響多數(shù)是對(duì)人類有害的，如增強(qiáng)毒力、提高耐藥性等，為臨床防治大腸桿菌感染增加難度。也有部分研究表明，有些原噬菌體可以降低大腸桿菌對(duì)頭孢菌素和氟喹諾酮的敏感性，同時(shí)減少變異頻率[29]。另外在噬菌體生物制劑的研發(fā)時(shí)，要充分了解菌種和噬菌體的生物學(xué)信息，敲除其自身所攜帶的耐藥基因和毒力基因等，防止或減少細(xì)菌水平基因轉(zhuǎn)移和進(jìn)化，保證噬菌體產(chǎn)品的安全高效。

4 結(jié) 論

大腸桿菌普遍攜帶原噬菌體，但原噬菌體在大腸桿菌基因組中所占比例不高，在0.05%～3.01%之間，部分完整型原噬菌體攜帶耐藥基因，以大環(huán)內(nèi)酯類、香豆素類及頭孢菌素類耐藥表型為主，耐藥機(jī)制有5種，以抗生素外排為主。另外，42.28%的完整型原噬菌體攜帶毒力基因，分別來自9個(gè)毒力因子家族。