miR-145a-3p通過靶向ATG14調(diào)控布魯氏菌誘導(dǎo)的RAW264.7自噬

王月麗，邵志然,易繼海，王 勇，王 震，陳創(chuàng)夫

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832000；2.人獸共患傳染性疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心,石河子 832000；3.新疆職業(yè)大學(xué)，烏魯木齊 830013)

布魯氏菌病是一種由布魯氏菌(Brucella)引起的以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征的人獸共患病，對人類健康和養(yǎng)殖業(yè)造成極大的威脅[1]。細胞自噬是細胞的一種程序性死亡，以維持自身環(huán)境的穩(wěn)定及細胞器的更新，主要是胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白通過參與自噬調(diào)節(jié)通路發(fā)揮作用。自噬可以自發(fā)的清除感染細胞的病原體，如結(jié)核分枝桿菌，其在感染巨噬細胞后能寄居其中，可以通過阻止自身酸化進入休眠狀態(tài)而躲避細胞的清除作用[2-3]。有研究證明，布魯氏菌能夠通過與早期內(nèi)吞、晚期內(nèi)吞及自噬溶酶的作用形成酸化的布魯氏菌自噬小體，轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)獲得復(fù)制性，并在四型分泌系統(tǒng)(T4SS)分泌系統(tǒng)的作用下形成具有自噬樣結(jié)構(gòu)的自噬泡，具有溶酶體的功能，影響細菌傳遞和胞內(nèi)感染周期[4]。有研究表明，布魯氏菌能夠引起細胞自噬，并影響布魯氏菌的胞內(nèi)寄生[5]。布魯氏菌激活自噬后，T4SS可幫助布魯氏菌逃避自噬溶酶體的降解，避免機體對其的清除從而促進胞內(nèi)存活[4]。自噬相關(guān)蛋白14(ATG14)能夠促進自噬泡的形成，還可以形成Beclin1-ATG14-PI3KⅢ螯合物誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[6]。布魯氏菌引起的自噬現(xiàn)象是否與自噬相關(guān)蛋白ATG14有關(guān)尚未見報道，需要進一步研究。

miRNA是一類具有調(diào)控功能的非編碼RNA，可以與信使RNA(mRNA)的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合，具有調(diào)控細胞生長、發(fā)育、分化、增殖和死亡的功能[7]。在腫瘤中可以作為一個抑癌基因發(fā)揮作用[8]。miRNA對自噬的調(diào)控作用機制復(fù)雜，涉及多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[9]。miR-155可以靶向調(diào)節(jié)腦中豐富的ras同系物(Rheb)基因，miR-125a可以靶向紫外線抵抗相關(guān)基因(UVRAG)來調(diào)控結(jié)核分枝桿菌感染所誘導(dǎo)的細胞自噬影響其在胞內(nèi)的存活時間[10]。miR-30b通過下調(diào)靶基因肌球蛋白樣Bcl-2結(jié)合蛋白(BECN1)和ATG12抑制幽門螺桿菌誘導(dǎo)的細胞自噬，導(dǎo)致其在胞內(nèi)的大量復(fù)制[11]。miR-29b在牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)中作用于ATG14抑制感染細胞的自噬，減少病毒在胞內(nèi)的復(fù)制存活率。miR-375在肝癌細胞中通過靶向ATG7而抑制細胞自噬[12]。隨著miRNA與自噬研究的深入，也使得miRNA成為自噬研究的新方向。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR155通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路，影響阿霉素誘導(dǎo)的骨肉瘤MG63細胞自噬。但miRNA在布魯氏菌自噬通路中的作用報道較為鮮見，miR-145a-3p是否對ATG14具有調(diào)節(jié)作用目前還不清楚。因此，本試驗通過研究miR-145a-3p對布魯氏菌誘導(dǎo)的細胞自噬的調(diào)控作用以及對布魯氏菌胞內(nèi)生存的影響，從miRNA調(diào)控細胞自噬的角度分析布魯氏菌的生存機制，以期為研究布魯氏菌造成機體持續(xù)性感染的機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細胞和質(zhì)粒 羊種布魯氏菌疫苗株M5、小鼠巨噬細胞(RAW264.7)、293T細胞、雙熒光素酶報告質(zhì)粒PmirGLO、自噬熒光小鼠巨噬細胞(GFP-RFP-RAW264.7)均由新疆建設(shè)兵團動物疫病防控重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 DMEM細胞培養(yǎng)液和胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；SYBR Green Master Mix試劑盒購自Roche公司；PLB裂解液購自Promega公司；RNA提取試劑盒和cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；RIPA裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗ATG14一抗購自Proteintech公司；山羊抗兔IgG(H+L)二抗購自Bioworld公司；限制性內(nèi)切酶SacⅠ和KpnⅠ均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 miR-145a-3p模擬物和抑制劑合成 參照miRBase數(shù)據(jù)庫中miR-145a-3p序列(登錄號：MIMAT0003828)，由上海吉瑪生物公司合成miR-145a-3p mimics、miR-145a-3p inhibitor和NC mimics。

1.2.2 miR-145a-3p轉(zhuǎn)染對布魯氏菌誘導(dǎo)的RAW264.7自噬的影響 將GFP-RFP-RAW264.7復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)。待細胞長至60%～70%匯合時，加入2 mL不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。 將miR-145a-3p mimics、miR-145a-3p inhibitor、NC mimics稀釋至20 nmol/L后靜置5 min，取2.5 μL加入到6 μL Lipofectamine 2000中吹打混勻，靜置25 min；取50 μL混合物加至細胞中，搖晃混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)7 h。用感染復(fù)數(shù)為100∶1的布魯氏菌侵染小鼠巨噬細胞RAW264.7 24 h后，PBS清洗2遍，取1 mL 4%多聚甲醛溶液固定細胞30 min，PBS清洗2遍后在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組細胞自噬情況。

1.2.3 自噬相關(guān)miR-145a-3p靶蛋白預(yù)測 利用miRBase((https:∥www.mirbase.org/)和 TargetScan(http:∥www.targetscan.org/ vert_71/)生物信息學(xué)預(yù)測軟件對細胞自噬通路中miR-145a-3p進行靶蛋白預(yù)測。

1.2.4 PmirGLO-ATG14-3′UTR和PmirGLO-ATG14-3′UTR-mutation重組質(zhì)粒構(gòu)建 以RAW264.7的基因組為模板，擴增目的基因ATG14-3′UTR和ATG14-3′UTR-mutation。PCR反應(yīng)體系25 μL：cDNA 2 μL，上、下游引物各0.4 μL，2×TaqMaster Mix 12.5 μL，ddH2O 9.7 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸20 s；72 ℃延伸10 min，共40個循環(huán)。擴增結(jié)束后進行0.5%瓊脂糖凝膠電泳，然后使用內(nèi)切酶SacⅠ和KpnⅠ對回收產(chǎn)物及雙熒光素酶報告質(zhì)粒PmirGLO進行酶切，并回收酶切產(chǎn)物；將ATG14-3′UTR/3′UTR-mutation與PmirGLO在16 ℃水浴中連接，然后將10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100 μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，加入1 mL LB培養(yǎng)液，37 ℃搖床180 r/min搖菌60 min。收集搖好的菌液，涂布于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)板上，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，挑單菌落進行菌液PCR鑒定。 提取鑒定成功的質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和KpnⅠ進行雙酶切鑒定。

1.2.5 miR-145a-3p與ATG14的靶向關(guān)系驗證 用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析鑒定miR-145a-3p與ATG14的靶向調(diào)控關(guān)系。 將50 ng雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒PmirGLO-ATG14-3′UTR與0.25 μL miR-145a-3p mimics、miR-145a-3p inhibitor和NC mimics分別混合后，轉(zhuǎn)染293T細胞48 h，加20 μL的PLB裂解液，裂解細胞15 min，然后加入100 μL熒光素酶底物LARⅡ，使用Biotek酶標儀避光檢測螢火蟲熒光素酶活性；檢測完畢后加入100 μL海腎熒光素酶Stop&GLO，檢測海腎熒光素酶的活性，并按照公式計算相對熒光活性。

相對熒光活性=

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測ATG14的mRNA水平 培養(yǎng)RAW264.7至60%匯合時，分別將miR-145a-3p mimics、miR-145a-3p inhibitor和NC mimics與Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染后7 h后添加布魯氏菌侵染細胞，設(shè)置添加PBS作為對照組，24 h后收集細胞備用。加入1 mL Trizol裂解細胞5 min后，利用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計miR-145a-3p靶基因位點ATG14-3′UTR和突變體ATG14-3′UTR-mutation(GenBank登錄號：NM_001192099)、ATG14(GenBank登錄號：NC_000080.6)與GAPDH(GenBank登錄號：NC_000072.6)的引物，具體信息見表1，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以GAPDH為內(nèi)參基因進行實時熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系10 μL：上、下游引物(0.2 μmol/L)各0.2 μL，SYBR Green Master Mix 5 μL，cDNA模板1 μL，Nuclease-free Water 3.6 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，退火(溫度見表1) 30 s，共45個循環(huán)。

表1 引物信息

1.2.7 Western blotting檢測ATG14的蛋白水平 細胞處理同1.2.6。加入RIPA非變形蛋白裂解液及0.1 mol/L PMSF蛋白酶抑制劑，冰上放置10 min；收集裂解的樣品。4 ℃、12 000 r/min離心5 min，吸取上清，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白的濃度；加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮樣10 min；待樣品冷卻后加至15% SDS-PAGE凝膠孔中，100 V電泳4 h；電泳結(jié)束后切下膠條進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完成后，將膜清洗干凈加入5 mL脫脂奶粉封閉12 h，TBST緩沖液洗膜3 次。加兔抗ATG14(1∶2 000)、兔抗β-actin(1∶10 000)，孵育2 h；TBST清洗3次，加入山羊抗兔IgG(H+L)(1∶5 000)孵育2 h，TBST洗膜3次。使用超敏ECL發(fā)光試劑盒顯色后，用ImageJ 1.48軟件進行灰度值分析。

1.2.8 miR-145a-3p對布魯氏菌胞內(nèi)生存的影響 miR-145a-3p mimics、miR-145a-3p inhibitor 和 NC mimics轉(zhuǎn)染RAW264.7方法同1.2.6，轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞，用0.3%的Triton X-100裂解細胞5 min，然后分別稀釋10、100、1 000和10 000倍，吸取100 μL稀釋液置于布魯氏菌固體培養(yǎng)基上，用涂布器涂布均勻。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)2～3 d，進行菌落計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計分析

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果按照2-△△Ct方法計算。用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，結(jié)果用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 miR-145a-3p對布魯氏菌誘導(dǎo)的RAW264.7自噬的影響

用miR-145a-3p mimics、miR-145a-3p inhibitor、NC mimics轉(zhuǎn)染GFP-RFP-RAW264.7后進行布魯氏菌侵染，結(jié)果表明，與NC mimics組相比，miR-145a-3p mimics組細胞自噬程度極顯著增加(P<0.01)，miR-145a-3p inhibitor組細胞自噬程度極顯著降低(圖1)。

2.2 miR-145a-3p靶蛋白在線預(yù)測結(jié)果

miRBase (https:∥www.mirbase.org/)和TargetScan (http:∥www.targetscan.org/ vert_71/)生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果顯示，miR-145a-3p的miRNA識別位點存在于自噬相關(guān)蛋白ATG14的3′UTR區(qū)域，說明miR-145a-3p的靶蛋白為ATG14(圖2)。

①A，細胞自噬熒光圖；B，細胞自噬比例統(tǒng)計圖。②與NC mimics組相比，*,差異顯著(P<0.05);**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。下同①A，Autophagy fluorescence diagram;B，Statistical chart of autophagy proportion.②Compared with NC mimics group，*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01);No *,No significant difference (P>0.05).The same as below圖1 各組細胞自噬情況Fig.1 Autophagy in each group

圖2 miR-145a-3p的靶蛋白預(yù)測Fig.2 Target protein prediction of miR-145a-3p

2.3 PmirGLO-ATG14-3′UTR和PmirGLO-ATG14-3′UTR-mutation重組質(zhì)粒的構(gòu)建

0.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，有7 350、84和84 bp 3條目的條帶(圖3)，分別為PmiRGLO載體、ATG14-3′UTR 和ATG14-3′UTR-mutation，與預(yù)期的結(jié)果相符。

2.4 miR-145a-3p對ATG14的靶向調(diào)控作用

由圖4可知，與NC minics組相比，ATG14-3′UTR組miR-145a-3p mimics混合轉(zhuǎn)染后雙熒光素酶的相對熒光活性極顯著降低(P<0.01);與miR-145a-3p mimics組相比,miR-145a-3p inhibitor組極顯著升高(P<0.01)。 而ATG14- 3′UTR-mutation組各轉(zhuǎn)染間差異不顯著(P>0.05)。 表明 miR-145a-3p直接調(diào)控ATG14的表達，二者具有直接靶向關(guān)系。

2.5 miR-145a-3p對ATG14轉(zhuǎn)錄水平的影響

由圖5可知，與NC mimics組相比，未感染布魯氏菌時，miR-145a-3p mimics組ATG14 mRNA水平極顯著降低(P<0.01)，miR-145a-3p inhibitor組ATG14 mRNA水平極顯著上調(diào)(P<0.01)；布魯氏菌感染后，miR-145a-3p mimics組ATG14 mRNA水平極顯著提高(P<0.01)。 與NC mimics+Bru組相比，miR-145a-3p mimics+Bru組ATG14 mRNA水平顯著提高(P<0.05)。

2.6 miR-145a-3p對ATG14蛋白表達的影響

由圖6可知，與NC mimics組相比，miR-145a-3p mimics組ATG14蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05),miR-145a-3p inhibitor組ATG14蛋白的表達增加，但差異不顯著(P<0.05)。布魯氏菌感染后，miR-145a-3p mimics則促進ATG14蛋白的表達。說明布魯氏菌感染有助于miR-145a-3p正向調(diào)控ATG14的表達。

2.7 miR-145a-3p對布魯氏菌胞內(nèi)生存的影響

與NC mimics組相比，轉(zhuǎn)染miR-145a-3p mimics組布魯氏菌胞內(nèi)存活數(shù)顯著降低(P<0.05),miR-145a-3p inhibitor組布魯氏菌的胞內(nèi)存活數(shù)增加，但差異不顯著(P>0.05)(圖7)。

①A，PmiRGLO-ATG14-3′UTR重組質(zhì)粒；B；PmiRGLO-ATG14-3′UTR-mutation重組質(zhì)粒。②1，PmiRGLO-ATG14-3′UTR；2，PmiRGLO-ATG14-3′UTR重組質(zhì)粒SacⅠ和KpnⅠ雙酶切；M，DL12000 DNA Marker；3，PmiRGLO-ATG14-3′UTR-mutation；4，PmiRGLO-ATG14-3′UTR-mutation重組質(zhì)粒SacⅠ和KpnⅠ雙酶切①A,PmiRGLO-ATG14-3′UTR recombinant plasmid;B,PmiRGLO-ATG14-3′UTR-mutation recombinant plasmid.②1,PmiRGLO-ATG14-3′UTR;2,Double digestion of PmiRGLO-ATG14-3′UTR recombinant plasmid by SacⅠ and KpnⅠ;M,DL12000 DNA Marker;3，PmiRGLO-ATG14-3′UTR-mutation;4,Double digestion of PmiRGLO-ATG14-3′UTR-mutation recombinant plasmid by SacⅠ and KpnⅠ圖3 重組雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant double luciferase reporter gene plasmids by double digestion

圖4 miR-145a-3p靶向ATG14雙熒光素酶相對熒光活性Fig.4 Relative fluorescence activity of double luciferase of miR-145a-3p targeting ATG14

Bru,布魯氏菌Bru,Brucella圖5 各組ATG14相對表達量Fig.5 Relative expression of ATG14 in each group

1～3，NC mimics、miR-145a-3p mimics和miR-145a-3p inhibitor組；4～6，NC mimics+Bru、miR-145a-3p mimics+Bru和miR-145a-3p inhibitor+Bru組1-3, NC mimics, miR-145a-3p mimics and miR-145a-3p inhibitor groups, respectively; 4-6, NC mimics+Bru, miR-145a-3p mimics+Bru and miR-145a-3p inhibitor+Bru groups, respectively圖6 各組ATG14蛋白的表達水平Fig.6 Level of ATG14 protein in each group

圖7 各組布魯氏菌胞內(nèi)存活數(shù)Fig.7 Intracellular survival number of Brucella in each group

3 討 論

布魯氏菌能夠誘導(dǎo)細胞自噬，從而使菌體躲避機體的免疫殺傷，達到持續(xù)性感染的目的。布魯氏菌脂多糖(LPS)可以誘導(dǎo)miRNA的表達，F(xiàn)as-1、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素3受體(IL-3R)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)都參與細胞自噬途徑[14-16]，而這些基因都受miRNA的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p靶向于GTP酶激活蛋白14(Tbc1d14)，Tbc1d14與自噬激酶(ULK1)相互作用，同時上調(diào)介導(dǎo)RAW264.7自噬激活的miR-146b-5p[17]。另外，在布魯菌感染后，miR-1981在RAW264.7中的表達也會上調(diào)[18]。

miR-145是近年來發(fā)現(xiàn)一種新的miRNA分子，可以參與調(diào)控細胞侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖、分化、凋亡及自噬等過程。吳洪坤[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-145-3p靶向乙?；?(HDAC4)上調(diào)轉(zhuǎn)錄激活因子4(ATF4)的表達，進而影響凋亡和自噬相關(guān)基因的表達調(diào)控細胞凋亡與自噬。在凋亡和自噬通路中，可能分別是通過非p53依賴的p21上調(diào)、ULK1及溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白2(LAMP2)的上調(diào)來介導(dǎo)發(fā)揮調(diào)控作用。Morin等[20]等通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，miR-145a-3p與脂質(zhì)代謝、葡萄糖代謝和抗氧化反應(yīng)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-145a-3p與自噬相關(guān)蛋白ATG14具有直接靶向調(diào)控關(guān)系，并在布魯氏菌感染巨噬細胞時顯著促進ATG14的表達，但在布魯氏菌未感染時卻抑制ATG14的表達，這可能與布魯氏菌本身能夠誘導(dǎo)細胞自噬的特性有關(guān)，并只有在布魯氏菌的參與下miR-145a-3p才能夠超高水平表達，從而提高ATG14的表達水平，促進細胞自噬。目前已有研究證明，miRNA對病原菌的復(fù)制具有抑制或促進的作用。如在對結(jié)核分支桿菌的研究中，發(fā)現(xiàn)miR-155抑制其在胞內(nèi)的生長[21]，而miR-125a促進結(jié)核分枝桿菌在胞內(nèi)的復(fù)制存活[22]。miRNA-20a抑制卡介苗BCG對巨噬細胞的自噬水平，上調(diào)卡介苗BCG在巨噬細胞中的存活量[23]。在本試驗中，miR-145a-3p對布魯氏菌胞內(nèi)存活影響的研究發(fā)現(xiàn)，miR-145a-3p不利于布魯氏菌的胞內(nèi)復(fù)制，原因可能是在miR-145a-3p的參與下宿主細胞對布魯氏菌的殺傷力大于對布魯氏菌產(chǎn)生的保護力。

本研究結(jié)果顯示，在布魯氏菌感染條件下，miR-145a-3p通過靶向調(diào)控自噬相關(guān)蛋白ATG14的表達，促進細胞自噬，但不利于布魯氏菌在胞內(nèi)的存活。然而有報道稱，RAW264.7感染M5菌株時，miR-146b-5p通過調(diào)節(jié)Tbc1d14引起靶基因下游蛋白發(fā)生變化，抑制布魯氏菌誘導(dǎo)的細胞自噬，從而促進胞內(nèi)存活而引起機體的持續(xù)性感染[24]。 但本試驗結(jié)果與布魯氏菌誘導(dǎo)的細胞自噬利于布魯氏菌生存復(fù)制理論相違背，這可能是由于miR-145a-3p在對靶基因ATG14進行調(diào)節(jié)時，會對靶基因所在的自噬信號通路產(chǎn)生影響，引發(fā)信號通路產(chǎn)生連鎖反應(yīng)，進而對布魯氏菌在胞內(nèi)的生存數(shù)量產(chǎn)生影響。由此可見，細胞自噬是一把雙刃劍，其在布魯氏菌誘導(dǎo)的自噬過程中發(fā)揮著雙向的作用。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，miR-145a-3p通過靶向調(diào)控自噬相關(guān)蛋白ATG14的表達，促進細胞自噬，抑制布魯氏菌在胞內(nèi)的存活。該結(jié)果為進一步了解布魯氏菌的致病機制提供參考，miR-145a-3p有望成為今后開發(fā)預(yù)防布魯氏菌病方案的潛在靶點。