納米銀對豬鏈球菌體外抗菌活性及其生物膜形成的影響

劉寶玲，李春玲，蔣智勇，楊冬霞，張昆麗，楚品品，勾紅潮，蔡汝健

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學觀測實驗站，廣州 510640；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院動物科技學院，廣州 510225)

豬鏈球菌(Streptococcussuis，S.suis)是一種重要的人獸共患病病原菌，呈世界性流行，對養(yǎng)豬行業(yè)和公共衛(wèi)生安全造成重大的威脅。近年來，豬鏈球菌的耐藥性日漸嚴重甚至出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，給臨床治療帶來了巨大困難。豬鏈球菌具有生物膜形成能力，可引起急慢性感染。生物膜是豬鏈球菌重要的生理保護屏障之一，它能夠通過阻礙藥物滲透而抑制殺菌作用，并且增強細菌對抗生素的耐藥性[1-2]。張麗蓉等[3]將形成生物膜的鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌與游離菌對消毒劑的抗性進行對比研究，發(fā)現(xiàn)游離菌均比形成生物膜的細菌的抗菌性要低，即這三類菌形成生物膜后耐藥性均增強。形成生物膜的細菌的耐藥性遠高于浮游態(tài)細菌，能夠抵抗百倍以上正常藥物劑量，從而給臨床治療帶來了極大挑戰(zhàn)。

納米銀(silver nanoparticles，AgNPs)是近年來新研發(fā)的抗菌材料，具有獨特的抗菌性能，在一些細菌上表現(xiàn)出明顯的抗菌、抗生物膜形成的效果。目前，AgNPs被認為是抗生素潛在的替代品，在解決細菌耐藥性問題上有很大的潛力[4]。據(jù)報道，AgNPs能有效對抗多重耐藥沙門氏菌，并且在體內(nèi)外均無不良影響[5]；Estevez等[6]研究表明，AgNPs粒子對大腸桿菌和白色念珠菌都有抗菌效果，并且對其產(chǎn)生的生物膜具有清除作用，尤其是能使白色念珠菌生物膜的形成量減少80%。Liao等[7]報道了AgNPs對多重耐藥的銅綠假單胞菌具有高度殺菌作用。Yuan等[8]檢測AgNPs對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌多重耐藥菌株的影響，發(fā)現(xiàn)AgNPs可以誘導細菌細胞死亡。

研究AgNPs對多重耐藥豬鏈球菌的抗菌活性及其生物膜形成影響，對解決豬鏈球菌的耐藥問題具有重要意義。因此，本研究以臨床分離的多重耐藥豬鏈球菌為試驗菌，探究AgNPs對其活性及生物膜形成的影響，以期為開發(fā)防治豬鏈球菌病的新型藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 5株豬鏈球菌分離株均由廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所豬病研究室分離鑒定和保存，其耐藥情況如表1所示。

表1 各菌株的耐藥情況

1.1.2 主要試劑及儀器 AgNPs原液(棕色水溶液，濃度：30 000 μg/mL，粒徑大?。?～7 nm，密度：1.01 g/cm3，pH：8)購自廣東順德正善川生物科技有限公司；大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)購自廣東環(huán)凱微生物技術(shù)有限公司；結(jié)晶紫溶液購自雷根生物技術(shù)有限公司。酶標儀(Bio Tek Epoch 2)購自伯騰儀器有限公司；恒溫箱(PYX-DHS500)購自上海躍進醫(yī)療器械廠；恒溫振蕩培養(yǎng)箱(ZWYR-2101C)購自上海智城分析儀器制造有限公司；紫外分光光度計(SPECORD 200 PLUS)購買自耶拿分析儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng) 取凍存的菌株解凍后接種于TSA瓊脂平板中，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，挑取單個菌落接種于TSB培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)8 h，采用平板計數(shù)法測定細菌濃度，并將菌液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 AgNPs對豬鏈球菌最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測定 參考Swolana等[9]方法并做一些調(diào)整，采用微量肉湯稀釋法，將AgNPs用TSB倍比稀釋，依次加入96孔板中，每孔100 μL，參考于文會等[10]方法，將1.2.1中的菌液濃度調(diào)整到1.0×106CFU/mL，每孔加入100 μL，使菌液的終濃度為5.0×105CFU/mL。每個板上均設置陽性對照及陰性對照。放入培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h，以肉眼觀察，無菌體生長的最低濃度孔即為AgNPs對豬鏈球菌的MIC。從MIC終點孔到第1孔中分別吸取50 μL菌接種于TSB平板上，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，接種平板中未見菌體生長的最低藥物濃度為AgNPs對豬鏈球菌的MBC。

1.2.3 AgNPs對豬鏈球菌抑制率的影響 將豬鏈球菌接種于含TSB的96孔板中，加入不同濃度的AgNPs溶液，使菌液的終濃度為1.0×106CFU/mL，試驗組將100 μg/mL AgNPs進行2倍倍比稀釋至0.098 μg/mL，對照組不加AgNPs，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后用紫外分光光度計測定D600 nm值，并根據(jù)公式計算抑制率[5]。

抑制率(%)=

1.2.4 AgNPs對豬鏈球菌生長速率的影響 將1.2.1中的菌液接種到TSB培養(yǎng)基中，每個菌株分別加入終濃度為1/2MIC、MIC、2MIC的AgNPs溶液，陰性對照不加AgNPs，置于37 ℃培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，0～6 h每1 h取樣，之后每2 h取樣，取樣至12 h，用紫外分光光度計測定D600 nm值，按照公式計算菌株的生長速率[11]并繪制曲線。

式中，C0和C1分別代表初始和最終吸光度；t0和t1分別表示初始和結(jié)束時間。

1.2.5 豬鏈球菌生物膜形成能力測定 參考Stepanovic等[12]方法及判定標準測定5個菌株生物膜的形成能力。在含有180 μL TSB的96孔板中，接種20 μL 1.2.1中的菌液，陰性對照只加200 μL TSB不加菌液，每個待測菌株設置3個孔，陰性對照6個孔，將培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進行結(jié)晶紫染色。棄掉培養(yǎng)基，每孔加入300 μL的PBS清洗3次，倒置排水，然后加入150 μL甲醇固定20 min后棄液，倒置干燥，隨后加入150 μL結(jié)晶紫溶液染色15 min，吸出液體后洗滌至沒有污漬，干燥后加入150 μL乙酸(33%)洗脫30 min以上，用紫外分光光度計測定D570 nm值。

根據(jù)生物膜形成的判定標準[12]計算臨界值(DC)。DC=陰性對照的平均D570 nm+3×陰性對照標準差，以各菌株的D570 nm-DC判定是否形成生物膜，正值表示形成生物膜。

1.2.6 AgNPs對豬鏈球菌生物膜形成的影響 根據(jù)1.2.5所述檢測生物膜的方法略做調(diào)整測定豬鏈球菌在AgNPs的作用下生物膜的形成能力。各待測菌液分別加入AgNPs溶液，使AgNPs終濃度分別為50、25、12.5和6.25 μg/mL，對照組為不加AgNPs的菌液，另外設置加AgNPs的空白培養(yǎng)基為空白對照，于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后進行結(jié)晶紫染色，操作如1.2.5所述，用紫外分光光度計測定各孔D570 nm值，根據(jù)吸光度結(jié)果分析AgNPs對豬鏈球菌生物膜的形成的影響。形成率按以下公式計算：

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8.0進行單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 AgNPs對豬鏈球菌的MIC和MBC

通過微量肉湯稀釋法測定了AgNPs對S1018、S894、S786、S815和S844 5株豬鏈球菌的MIC分別為12.5、25.0、25.0、25.0和25.0 μg/mL，MBC分別為12.5、25.0、25.0、25.0和25.0 μg/mL(表2)。AgNPs對不同分離株的MBC/MIC比率顯示抑菌和殺菌作用不同，AgNPs對5株菌的MBC/MIC值均為1，表明AgNPs是豬鏈球菌的一種殺菌劑，對豬鏈球菌有強烈的殺菌作用。

表2 AgNPs對5株豬鏈球菌的MIC和MBC值

2.2 AgNPs對豬鏈球菌的抑制效果

由圖1可知，25～100 μg/mL AgNPs對5株菌的抑制率均達到96.60%以上，最高可達到99.70%，12.5 μg/mL AgNPs對S1018的抑制率仍有98.40%，菌株S894和S786對各濃度AgNPs均保持相對較高的敏感性。0.098 μg/mL AgNPs對菌株S894和S786抑制率分別為59.32%和35.18%。

2.3 AgNPs對豬鏈球菌生長速率的影響

由圖2可知，與陰性對照組相比，不同濃度AgNPs對不同菌株的生長速率均有影響，各菌株在1/2MIC、1MIC和2MIC AgNPs濃度下細菌生長明顯受到抑制。

2.4 豬鏈球菌生物膜的形成能力

經(jīng)測定并計算，臨界值DC=0.13，各菌株的平均D570 nm值均>DC，S1018菌株的D570 nm值顯著高于DC值(P<0.05)，S894、S786、S844、S815菌株的D570 nm值顯著高于DC值(P<0.01)(圖3)，因此5個菌株均具有生物膜形成能力，形成能力大小順序為：S786>S815>S894>S844>S1018。

2.5 AgNPs對豬鏈球菌生物膜形成的影響

由圖4可知，在50、25、12.5和6.25 μg/mL AgNPs的作用下，5株豬鏈球菌生物膜的形成率均存在不同程度的降低，其中，AgNPs對菌株S786、S844和S815的生物膜形成率的下降呈現(xiàn)劑量依賴性。5個菌株中，菌株S786的生物膜形成率在各濃度組均為最低，形成率最低為54.42%，即抑制率最高為45.58%。菌株S1018的生物膜形成率在各濃度組均為最高，形成率最高為82.02%，即抑制率最低為17.98%，5個菌株中各濃度組與0 μg/mL AgNPs組相比，均差異極顯著(P<0.01)。

A～E，分別為菌株S1018、S894、S786、S844和S815。圖2、4同A-E,Strains of S1018,S894,S786,S844 and S815,respectively.The same as fig.2 and fig.4圖1 不同濃度AgNPs對豬鏈球菌的抑制率Fig.1 Inhibition rate of different concentrations of AgNPs on Streptococcus suis

圖2 不同AgNPs濃度組豬鏈球菌的生長速率曲線Fig.2 Growth rate curve of Streptococcus suis in different concentration AgNPs groups

與DC相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)Compared with DC,*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01)圖3 豬鏈球菌的生物膜形成能力Fig.3 The ability of biofilm formation of Streptococcus suis

與0 μg/mL AgNPs組相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)Compared with 0 μg/mL AgNPs group, *, Significant difference (P<0.05), **, Extremely significant difference (P<0.01)圖4 不同AgNPs濃度組豬鏈球菌生物膜的形成率Fig.4 Biofilm formation rate of Streptococcus suis in different concentration AgNPs groups

3 討 論

豬鏈球菌的耐藥情況國內(nèi)外均有報道，其日漸加重的耐藥性是對醫(yī)療衛(wèi)生和疾病防控重要的威脅，多重耐藥菌及生物膜感染已經(jīng)成為傳染病中日益突出的問題，致使臨床可用藥物的數(shù)量減少，甚至出現(xiàn)無藥可用的現(xiàn)象。因此，許多研究者都在尋找對抗病原的抗生素替代物，隨著AgNPs在醫(yī)學和生物技術(shù)各個領域的應用逐漸廣泛，AgNPs的抗菌效果也逐漸受到重視。許多研究表明，AgNPs對不同的病原體都具有明顯的抑菌作用，如沙門氏菌[5]、大腸桿菌[6]、銅綠假單胞菌[7]、硝化細菌[13]和金黃色葡萄球菌[14]等。

MBC/MIC表示藥物對細菌的抑菌和殺菌效果，當MBC/MIC≥32時，細菌對該藥物具有耐受性[15]。本研究結(jié)果顯示，AgNPs對5株多重耐藥豬鏈球菌的MBC/MIC均為1，表明AgNPs對它們均具有較強的殺滅作用。濃度在0.098～100 μg/mL之間的AgNPs對豬鏈球菌均具有抑制效果，濃度在25～100 μg/mL時對5株菌的抑制率可達到96.60%～99.70%，菌株S786、S894和S815在各濃度下都保持相對較高的敏感性，這可能是由于這3株菌的生物膜形成能力相對較好，AgNPs在生物膜中的積累所致，與Swolana等[9]研究結(jié)果相似。 除此之外，AgNPs能夠明顯降低豬鏈球菌的生長速率，減少細菌的繁殖，與于曉旭等[16]研究結(jié)果相似。

生物膜的形成可能會增強豬鏈球菌的毒性、耐藥性以及逆境中的生存能力，有效抑制生物膜的形成將有助于減小豬鏈球菌的生存能力和感染力。本試驗結(jié)果表明，選用的5株多重耐藥豬鏈球菌臨床分離株均可形成不同程度的生物膜；AgNPs對5株豬鏈球菌生物膜的形成均有抑制效果，在5個菌株中，AgNPs的4個測試濃度對菌株S786生物膜的形成抑制率均為最高，最高可達45.58%，對菌株S1018生物膜形成的抑制率均為最低，最低為17.98%，這可能與各菌株生物膜形成能力的差異以及各菌株對AgNPs的敏感性的差異有關(guān)，其具體機制需要進一步探討。AgNPs的抗菌抗生物膜形成的機制是復雜的，包括影響呼吸鏈、抑制相關(guān)基因的表達、抑制相關(guān)蛋白的表達、影響DNA的合成及阻止細菌的黏附等[17-20]。在后續(xù)的研究中，將基于AgNPs對豬鏈球菌生物膜的抑制效果，進一步研究AgNPs抗菌和抗生物膜形成的相關(guān)機制。

AgNPs的抗菌作用已經(jīng)得到廣泛的證實[21]，但AgNPs的生物安全性仍存在爭議，賈建博[22]研究表明AgNPs會在超重小鼠的肝臟積累并促進肝臟病變，但Farouk等[5]研究顯示AgNPs在小鼠體內(nèi)外均無不良影響。這可能與不同研究中所采用AgNPs的顆粒大小、形態(tài)、劑量以及試驗動物等各方面因素不同有關(guān)。本試驗結(jié)果表明，AgNPs對體外豬鏈球菌具有較好的抗菌活性，對豬鏈球菌生物膜的形成有抑制作用，后續(xù)將開展AgNPs的動物體內(nèi)毒性和抗菌活性方面的研究，以期為開發(fā)新型抗菌藥物提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，AgNPs對多重耐藥豬鏈球菌的抗菌活性好，25～100 μg/mL AgNPs對5株菌的抑制率可達96.60%～99.70%，6.25、12.5、25和50 μg/mL AgNPs對多重耐藥豬鏈球菌菌株生物膜形成抑制率最高為45.58%，最低為17.98%，本研究結(jié)果可為開發(fā)新型抗菌藥物奠定基礎。