血清6型鴨疫里默氏桿菌發(fā)酵工藝與攻毒模型的建立

崔松奇，饒瀟君，趙海明，田春利，閻燊，張文芳，張丹丹，李娥，劉洋，余海濤，劉興剛，孔敏，高月花，胡峰，黃兵，李玉峰

摘 要：本試驗(yàn)對(duì)不同地區(qū)分離的3株血清6型鴨疫里默氏桿菌，通過搖瓶試驗(yàn)篩選出血清6型鴨疫里默氏桿菌適宜的增菌液體培養(yǎng)基和細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，通過5L發(fā)酵罐各菌株生長(zhǎng)曲線的對(duì)比，篩選出適合工業(yè)化發(fā)酵的菌株以及發(fā)酵工藝參數(shù)，通過鴨疫里默氏桿菌疾病模型條件篩選確立了攻毒模型。結(jié)果顯示：WF201910株和TA201912株適宜的增菌液體培養(yǎng)基為商品化的RA培養(yǎng)基，LY202001株適宜的增菌液體培養(yǎng)基為商品化的TSB培養(yǎng)基，三個(gè)菌株適宜的細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基均為TSA培養(yǎng)基;5 L發(fā)酵罐發(fā)酵TA201912株在RA液體培養(yǎng)基最高菌數(shù)可以達(dá)到3.28×1010 CFU/mL，通過500 L發(fā)酵罐放大工藝驗(yàn)證，該工藝參數(shù)適合于規(guī)?；a(chǎn);4周齡雛鴨腿部肌肉注射鴨疫里默氏桿菌3 d后開始發(fā)病，發(fā)病與死亡高峰期為攻毒后3～6 d，臨床癥狀與病原學(xué)鑒定均符合血清6型鴨疫里默氏桿菌疾病。本試驗(yàn)為血清6型鴨疫里默氏桿菌滅活疫苗的研制打下了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鴨疫里默氏桿菌;血清型;發(fā)酵工藝;攻毒模型

中圖分類號(hào)：S858.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1673-1085（2022）01-0012-08

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的一種高致病性、接觸性傳染病，又稱鴨傳染性漿膜炎（infectious serocitis，IS），可引起雛鴨和雛鵝的肝周炎、纖維素心包炎和氣囊炎等，因死亡、消瘦、淘汰、胴體品質(zhì)下降、疾病治療等造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

鴨疫里默氏桿菌主要感染1～8周齡，尤其是2～3周齡的雛鴨，引起多發(fā)性、滲出性炎癥和全身性敗血癥[2]。臨床上主要表現(xiàn)為眼和鼻分泌物增多、喘氣、咳嗽、下痢、共濟(jì)失調(diào)和頭頸震顫，慢性經(jīng)過的病鴨主要表現(xiàn)為腦膜炎癥狀、頸斜、生長(zhǎng)緩慢或成僵鴨。剖解病變以纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征[3-5]。鴨疫里默氏桿菌病發(fā)病率可達(dá)90%以上，死亡率高達(dá)75%。該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病之一，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[3]。

通過對(duì)近3年200余株鴨疫里氏桿菌的分離鑒定，以及相關(guān)報(bào)道，目前鴨疫里默氏桿菌的流行血清型主要有血清1型、2型、6型、7型，占分離菌株的80%以上。目前商品化的鴨傳染性漿膜炎疫苗有1型、2型、4型、7型的、10型二價(jià)或三價(jià)疫苗以及與大腸桿菌的二聯(lián)滅活疫苗，由于鴨疫里默氏桿菌各血清型之間交叉保護(hù)效果不好，而且缺少商品化的血清6型鴨疫里默氏桿菌的相關(guān)疫苗，在國(guó)家禁抗、限抗的大背景下，血清6型鴨疫里默氏桿菌在部分養(yǎng)鴨地區(qū)成為了主要的流行菌株，給養(yǎng)殖戶造成了很大的損失，因此開展血清6型鴨疫里默氏桿菌的研究，開發(fā)出含有血清6型鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗迫在眉睫。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

190只25～30日齡肉鴨，由河北廊坊種鴨場(chǎng)提供。

1.2 菌株

血清6型鴨疫里默氏桿菌WF201910株、TA201912、LY202001株，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所提供。

1.3 培養(yǎng)基

TSA、TSB 培養(yǎng)基均由本試驗(yàn)室配制。

RA專用液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基購自洛陽宏順技術(shù)有限公司。

1.4 主要儀器

BIOTECH 型發(fā)酵罐（5 L），購自上海保興生物設(shè)備工程有限公司;500 L生產(chǎn)規(guī)模發(fā)酵罐，購自青島某設(shè)備科技有限公司;紫外可見分光光度計(jì)，購自尤尼柯儀器有限公司。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基篩選

取冷凍保存的血清6型鴨疫里默氏桿菌WF201910株、TA201912、LY202001株，每株細(xì)菌分別接種于TSB與RA專用液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，TSB活化的細(xì)菌劃線于TSA固體平板，RA專用液體培養(yǎng)基活化的細(xì)菌劃線于RA專用固體平板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。挑選凸起、邊緣整齊、奶油狀、透明、光滑菌落，TSA平板培養(yǎng)的菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中，RA專用固體平板培養(yǎng)的菌落接種于RA專用液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h。TSB培養(yǎng)的細(xì)菌按照5%的比例接種于TSB搖瓶中，RA專用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落按照5%的比例接種于RA專用液體培養(yǎng)基搖瓶中，37 ℃搖床上培養(yǎng)，每1 h對(duì)每個(gè)搖瓶取樣1次，進(jìn)行OD值的測(cè)定和活菌計(jì)數(shù)。

2.2 菌株篩選

將發(fā)酵至OD值（600 nm）達(dá)到1.3～1.5的WF201910株和TA201912株血清6型鴨疫里默氏桿菌制備的二級(jí)菌種，按照5%的比例接種于RA專用液體培養(yǎng)基5 L發(fā)酵罐中，將發(fā)酵至OD值（600 nm）達(dá)到1.3～1.5的LY202001株血清6型鴨疫里默氏桿菌制備的二級(jí)菌種按照5%的比例接種于TSB培養(yǎng)基5 L發(fā)酵罐中。調(diào)節(jié)溶氧為30%～50%，初始轉(zhuǎn)速為200 RPM，每0.5 h取樣1次，進(jìn)行OD值的測(cè)定和活菌計(jì)數(shù)。

2.3 規(guī)?；l(fā)酵罐工藝驗(yàn)證

取適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)達(dá)到最高菌數(shù)的篩選菌株，按照5 L發(fā)酵罐摸索的發(fā)酵參數(shù)與收獲終點(diǎn)判定標(biāo)準(zhǔn)，開展500 L發(fā)酵罐工藝驗(yàn)證。將發(fā)酵至二級(jí)菌種OD值（600 nm）達(dá)到1.3～1.5，按照5%的比例接種至500 L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)體積為350 L，發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量使溶氧維持在30%～50%，每1 h取樣一次進(jìn)行OD值測(cè)定、活菌計(jì)數(shù)與純粹檢驗(yàn)。

2.4攻毒模型的建立

2.4.1 菌種存活率 各菌株活化后接種于TSB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)18 h，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)和OD值（600 nm）的測(cè)定，2～8 ℃保存，24 h后再次進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，確定每個(gè)菌株2～8 ℃保存24 h細(xì)菌的存活率。

2.4.2 預(yù)估菌數(shù) 正式培養(yǎng)各菌株，確保各菌株收獲的OD值（600 nm）與存活率試驗(yàn)收獲的OD值（600 nm）相同，然后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，待24 h后細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)后，計(jì)算各菌株的預(yù)估菌數(shù)。預(yù)估菌數(shù)=計(jì)數(shù)結(jié)果×各菌株存活率

2.4.3 稀釋度 按照預(yù)估菌數(shù)把各型菌株稀釋為2×1010 CFU/mL、2×109CFU/mL 、2×108 CFU/mL、2×107 CFU/mL 、2×106 CFU/mL、2×105 CFU/mL 6個(gè)稀釋度。

2.4.4 攻毒試驗(yàn) 取25～30日齡血清6型鴨疫里默氏桿菌抗原抗體雙陰性的易感鴨180只，每個(gè)菌株每個(gè)稀釋度腿部肌肉攻毒0.5 mL，同時(shí)10只不接種作為空白對(duì)照，在攻毒動(dòng)物房隔離器內(nèi)隔離飼養(yǎng)。攻毒后每天觀察試驗(yàn)動(dòng)物的精神狀態(tài)、采食情況、發(fā)病情況，連續(xù)觀察7日，期間死亡的試驗(yàn)動(dòng)物及時(shí)進(jìn)行解剖，第8天所有試驗(yàn)動(dòng)物無論發(fā)病與否全部解剖，觀察病理變化情況，同時(shí)進(jìn)行病原分離和生化鑒定。攻毒7日，以10只易感鴨8只發(fā)病的最小劑量作為該菌株的發(fā)病劑量。攻毒分組和攻毒劑量情況見表1。

3 結(jié)果

3.1 培養(yǎng)基篩選

各菌株培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)結(jié)果見表2、表3。

由表2、表3可知，各菌株使用RA專用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)和TSB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示3個(gè)菌株生長(zhǎng)曲線均出現(xiàn)了TSA平板計(jì)數(shù)結(jié)果顯著高于RA平板細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果，說明血型6型鴨疫里默氏桿菌更適合于在TSA平板上生長(zhǎng);同時(shí)對(duì)比同一菌株在不同液體培養(yǎng)基的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線可以看出，WF201910株和TA201912株適宜的增菌液體培養(yǎng)基為商品化的RA培養(yǎng)基，LY202001株適宜的增菌液體培養(yǎng)基為商品化的TSB培養(yǎng)基。各菌株使用適宜培養(yǎng)基5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果見表4。

由表4可以看出，菌株WF201910株在RA液體培養(yǎng)基最高菌數(shù)可以達(dá)到2.32×1010 CFU/mL，TA201912株在RA液體培養(yǎng)基最高菌數(shù)為3.28×1010 CFU/mL，LY202001株在TSB培養(yǎng)基最高菌數(shù)可以達(dá)到1.95×1010 CFU/mL，表明TA201912株更適合于規(guī)?；a(chǎn)。

3.2 規(guī)模化500 L發(fā)酵罐參數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見表5。

由表5可以看出，TA201912株按照5 L發(fā)酵罐的工藝參數(shù)進(jìn)行500 L擴(kuò)大生產(chǎn)，最高菌數(shù)可以達(dá)到3×1010 CFU/mL以上，說明5 L發(fā)酵罐的工藝參數(shù)可以用于規(guī)?；a(chǎn)。

3.3 攻毒模型試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 不同菌株攻毒效果比較 3個(gè)菌株不同攻毒劑量攻毒結(jié)果分別見表6、表7、表8。

由表6、表7、表8不同菌株攻毒效果可以看出，WF201910株按照1×1010 CFU進(jìn)行攻毒，發(fā)病率可達(dá)90%;TA201912株按照1×109 CFU進(jìn)行攻毒，發(fā)病率可達(dá)90%;LY202001株按照1×109 CFU進(jìn)行攻毒，發(fā)病率可達(dá)100%，均符合發(fā)病標(biāo)準(zhǔn)。

3.3.2 各菌株發(fā)病試驗(yàn)動(dòng)物臨床癥狀 各菌株攻毒后發(fā)病鴨均出現(xiàn)不同程度的精神不振、行動(dòng)蹣跚、眼鼻有分泌物流出、排綠色或黃綠色稀薄糞便等的臨床癥狀。

3.3.3 各菌株發(fā)病試驗(yàn)動(dòng)物剖檢病理變化 取3個(gè)菌株攻毒后瀕死鴨解剖，均可見到不同程度的肝周炎，猶如偽膜覆蓋在肝臟表面，或薄或厚，纖維素性漿膜炎，心包膜炎，氣囊渾濁。不同菌株攻毒后試驗(yàn)動(dòng)物的剖解病變分別見圖1。

3.3.4 各菌株發(fā)病試驗(yàn)動(dòng)物病原分離與鑒定

3.3.4.1 細(xì)菌形態(tài) 無菌操作取發(fā)病鴨肝臟進(jìn)行涂片，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢可見革蘭氏陰性小桿菌;瑞氏染色兩端濃染。

無菌操作取各菌株攻毒發(fā)病鴨肝臟組織涂抹接種到TSA（含5%新生牛血清）和麥康凱瓊脂平板，37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，在TSA平板上均可見呈凸起、邊緣整齊、光滑型菌落;在麥康凱瓊脂平板上均不生長(zhǎng)。

3.3.4.2 生化鑒定 取各分離菌株開展生化鑒定試驗(yàn)，結(jié)果顯示葡萄糖、乳糖、麥芽糖、山梨醇發(fā)酵試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)均為陰性，明膠穿刺試驗(yàn)呈陽性。各分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果見表9。

3.3.4.3 血清型鑒定 取潔凈載玻片，用記號(hào)筆在載玻片反面劃分3個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域分別滴加經(jīng)TSA平板分離的細(xì)菌液0.01 mL、陰性血清對(duì)照和血清6型陽性對(duì)照菌株。然后每個(gè)區(qū)域分別加入等量的血清6型陽性血清（凝集價(jià)不低于1：8），各分離菌株玻板凝集試驗(yàn)結(jié)果見表10。

由表10可以看出，各分離菌株均與血清6型陽性血清發(fā)生了凝集，證明攻毒后試驗(yàn)鴨發(fā)病的原因是鴨疫里默氏桿菌導(dǎo)致的。

4 討論

4.1 菌株適宜培養(yǎng)基的篩選

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，同樣是血清6型的鴨疫里默氏桿菌，不同菌株適宜的培養(yǎng)基類型不同，WF201910株和TA201912株適宜的增菌液體培養(yǎng)基為商品化的RA培養(yǎng)基，LY202001株適宜的增菌液體培養(yǎng)基為商品化的TSB培養(yǎng)基。但是從細(xì)菌計(jì)數(shù)情況來看，3株細(xì)菌在RA專用固體培養(yǎng)增值的效果都不如TSA平板的增值效果，而且在RA專用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落生長(zhǎng)速度慢，菌落數(shù)量少，所以在接下來的5 L發(fā)酵罐小試與中試試驗(yàn)中均使用TSA平板進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

4.2 適宜于規(guī)?；a(chǎn)的血型6型鴨疫里默氏桿菌篩選

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，各菌株以相同OD值的二級(jí)菌種按照5%接菌量在5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，WF201910株和TA201912株在RA液體培養(yǎng)基最高菌數(shù)分別達(dá)到2.32×1010 CFU/mL、3.28×1010 CFU/mL，LY202001株在TSB培養(yǎng)基最高菌數(shù)可以達(dá)到1.95×1010 CFU/mL，結(jié)果顯示TA201912株在RA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)是3種菌株中最適合于規(guī)模化生產(chǎn)，可以做為血型6型鴨疫里默氏桿菌規(guī)模化生產(chǎn)的后備菌株。

4.3 攻毒模型建立

不同地區(qū)的3株血清6型鴨疫里默氏桿菌分離株在毒力方面有所差異，LY202001株毒力最強(qiáng)，以109 CFU/羽劑量進(jìn)行攻毒可使100%的動(dòng)物發(fā)病，且死亡率高達(dá)60%;TA201912株毒力次之，以109 CFU/羽劑量進(jìn)行攻毒可使90%的動(dòng)物發(fā)病;WF201910株毒力最弱，以1010 CFU/羽劑量進(jìn)行攻毒可使90%的動(dòng)物發(fā)病。從發(fā)病情況來看，3株菌株攻毒后基本上是3 d后開始發(fā)病，發(fā)病與死亡的高峰期在攻毒后3～6 d。通過臨床癥狀、病理學(xué)檢查及病原學(xué)鑒定，結(jié)果顯示3株菌株符合該病模型的復(fù)制要求，均可作為血清6型鴨疫里默氏桿菌的攻毒用后備菌株。

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Establishment of Fermentation Technology and Infected Model of Riemerella anatipestifer Serotype 6

CUI Songqi1，RAO Xiaojun1，ZHAO Haiming1，TIAN Chunli1，YAN Shen1，ZHANG Wenfang1，

ZHANG Danan1，LI E1，LIU Yang1，YU Haitao1，LIU Xinggang1，KONG Min1，GAO Yuehua2，

HU Feng2，HUANG Bing2，LI Yufeng2

（1.Haowei Biotechnology Co. ， Ltd. ，Tianjing? 301700，China;

2.Institute of Poultry Science， Shandong Academy of Agricultural Science， Key Laboratory of Poultry Diseases Diagnosis and Immunology， Jinan? 250100， China）

Abstract： In this experiment， 3 strains serotype 6 of Riemerella anatipestifer （RA） from different geographical locations were isolated. We selected the liquid culture medium and bacterial counting medium by the test of shaking flask， and got the technical parameter through the contrast test of the growth curve of the strains by 5 L fermentation tank of industrial propagation. Disease model were slected through the infected model. The results show that， the optimum fermentation liquid culture medium of WF201910 strains and TA201912 strains were commercial RA culture medium， and the optimum fermentation liquid culture medium of LY202001 strains were commercial TSB culture medium. While bacterial counting culture medium of TSA were suited for all the three strains. Through 5 L fermentation tank the number of TA201912 strains viable bacteria reached a peak 3.28×1010 CFU/mL by using commercial RA culture medium， which technical parameter were also suited by using 500 L fermentation tank in the fermentation process. We administered the RA to 4-week old duckling by muscular injection in the leg， which clinical signs appeared after 3 days， and the peak of morbidity and mortality reached at 3～6 days. Clinical signs and etiological identification were corresponding to the disease caused serotype 6 of RA. This experiment provided preliminary guidance for the inactivated vaccine of serotype 6 of RA.

Keywords：? Riemerella anatipestis; Serotype; Fermentation Technology; Infected Model