沈陽(yáng)地區(qū)孕晚期婦女?dāng)y帶B群鏈球菌不同血清型的調(diào)查研究

高爽，孫曉娟，柳中洋，叢桂敏，阮強(qiáng)

B 群鏈球菌（group B streptococcus，GBS）又稱無乳鏈球菌，GBS感染易導(dǎo)致早產(chǎn)、胎膜早破、胎兒生長(zhǎng)受限等一系列母嬰不良結(jié)局，是孕產(chǎn)婦和新生兒最常見的感染致病菌，有研究報(bào)道稱GBS是發(fā)展中國(guó)家新生兒死亡的主要原因[1-3]。由于妊娠期婦女免疫功能相對(duì)較低，孕婦GBS攜帶率較高，美國(guó)和北歐等國(guó)家孕婦GBS攜帶率約為15%～35%[4]，國(guó)內(nèi)孕婦GBS攜帶率約為2.4%～10.1%。GBS表達(dá)的多糖莢膜是很重要的一個(gè)毒力因子，也是疫苗研發(fā)的一個(gè)關(guān)鍵目標(biāo)。根據(jù)GBS細(xì)胞壁上特異性莢膜多糖的化學(xué)組成不同分為10種不同的血清型，即Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅸ[5]，其中Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型致病力較強(qiáng)。也有研究發(fā)現(xiàn)存在部分不同于任何已知血清型的非分型GBS菌株，統(tǒng)稱為血清型NT。而我國(guó)各個(gè)GBS血清型在孕婦GBS攜帶群體中分布的數(shù)據(jù)不足，對(duì)于不同血清型的耐藥差異更是鮮有報(bào)道。本課題組對(duì)沈陽(yáng)地區(qū)孕婦攜帶GBS群體進(jìn)行血清型調(diào)查分析，旨在了解沈陽(yáng)地區(qū)不同GBS血清型的流行情況及各型別間的耐藥差異，為臨床科學(xué)合理的診療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源選取2016年5月—2017年8月于沈陽(yáng)市婦嬰醫(yī)院（我院）產(chǎn)科就診的19 122例孕晚期婦女。因?yàn)镚BS在直腸和陰道均可定植，為避免漏檢，每位患者均采集陰道分泌物和直腸標(biāo)本，并經(jīng)細(xì)菌鑒定為GBS陽(yáng)性（其中有一個(gè)標(biāo)本為陽(yáng)性即診斷為GBS陽(yáng)性），以居住沈陽(yáng)地區(qū)3年以上的孕婦攜帶的GBS純培養(yǎng)菌株為標(biāo)本。

1.2 細(xì)菌鑒定標(biāo)本采集及分離培養(yǎng)嚴(yán)格遵循《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》，接種于5%哥倫比亞羊血瓊脂平板后置于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h。分別以2016年CLSI M00-S24和2017年CLSI M00-S27美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，采用迪爾公司DL96全自動(dòng)細(xì)菌分析儀進(jìn)行菌株鑒定與藥敏試驗(yàn)。

1.3 質(zhì)控質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（ATCC25922）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）和金黃色葡萄球菌（ATCC25923），均由中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供。

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成分別以GBS血清型Ⅰa（GeneBank accession No.AB028896.2）、 Ⅰ b （GeneBank accession No.AB050723.1）、Ⅱ （GeneBank accession No.AY375362.1）、Ⅲ（GeneBank accession No.AF163833.1）、Ⅳ（GeneBank accession No.AF355776.1）、Ⅴ（GeneBank accession No.AF349539.1）、Ⅵ（GeneBank accession No.AF337958.1）、Ⅶ（GeneBank accession No.AY376403.1）、Ⅷ（GeneBank accession No.AY375363.1）和Ⅸ（GeneBank accession No.EF157290.1）為參考株，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)用于GBS不同血清型篩選的特異性聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物。設(shè)計(jì)的引物見表1。引物由Invitrogen公司合成。

表1 本研究中的引物情況

1.5 GBS菌株基因組提取及PCR實(shí)驗(yàn)采用TaKaRa試劑盒（TaKaRa Minibest Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0），嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行GBS菌株基因組的提取，PCR所需試劑均購(gòu)自TaKaRa公司，以提取的GBS基因組為模板，美國(guó)PE公司的DNA Thermal Cycke480循環(huán)儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.6 GBS菌株基因測(cè)序應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳篩選出具有目的條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行基因測(cè)序，由Invitrogen公司完成。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的WHONET 8.4軟件進(jìn)行細(xì)菌耐藥率分析；應(yīng)用GeneBank軟件進(jìn)行基因序列分析；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析則采用SPSS 22.0軟件，定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，定性資料用株數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕晚期婦女GBS攜帶率19 122例孕晚期婦女的生殖道和直腸分泌物標(biāo)本共鑒定出GBS陽(yáng)性者572例，GBS攜帶率為3.0%。其中，篩選源自沈陽(yáng)地區(qū)的GBS純培養(yǎng)菌株共計(jì)251株，孕婦年齡為21～42 歲，平均（31.0±4.8）歲。

2.2 GBS血清型鑒定GeneBank序列分析軟件對(duì)比分析GBS菌株發(fā)現(xiàn)，251株GBS血清型以Ⅰa為主，占44.22%（111/251）；其次為Ⅴ型、Ⅲ型和NT型，依次占 38.65%（97/251）、13.94%（35/251）和3.19%（8/251）。

8株NT血清型GBS菌株通過序列分析比較發(fā)現(xiàn)，血清型NT和Ⅴ具有高度同源性，僅有一個(gè)堿基位點(diǎn)存在差異。見圖1。

圖1 血清型V和NT序列比較

2.3 不同血清型GBS菌株耐藥情況及比較Ⅰa、Ⅲ、Ⅴ和NT 4個(gè)血清型的GBS菌株對(duì)氨芐西林、青霉素、萬(wàn)古霉素、利奈唑胺和美羅培南均敏感，尚未檢測(cè)出耐藥株；對(duì)紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星和四環(huán)素的耐藥率較高。結(jié)果顯示，紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星和四環(huán)素對(duì)4個(gè)血清型GBS菌株耐藥率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。血清型Ⅰa、Ⅲ、Ⅴ對(duì)紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星和四環(huán)素4種藥物的耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即同一血清型對(duì)這4種藥物的耐藥率有顯著差異，而血清型NT對(duì)不同藥物的耐藥率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同血清型的GBS菌株對(duì)常用抗生素的耐藥情況[株數(shù)（%）]

2.4 攜帶不同血清型GBS菌株患者胎膜早破發(fā)生率的比較攜帶Ⅰa、Ⅲ、Ⅴ和NT 4個(gè)不同血清型GBS菌株的孕晚期婦女胎膜早破的發(fā)生率分別為23.42%（26/111）、34.28%（12/35）、10.31%（10/97）和25.00%（2/8），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.128，P=0.011)。

3 討論

3.1 GBS攜帶率的地域分布研究表明GBS在女性生殖道和直腸的攜帶率為15%～35%[4]，但10%～30%的孕婦可能會(huì)出現(xiàn)無癥狀的GBS陰道、直腸定植，且會(huì)因種族和地域的差異而不同[6]。Kwatra等[7]的研究結(jié)果顯示，非洲地區(qū)人群GBS攜帶率最高，為18.1%～26.7%；其次為美國(guó)（16.7%～22.7%）、歐洲地區(qū)（16.1%～22.0%）。2010年，美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心（CDC）制定了《圍生期GBS預(yù)防指南》，提出所有35～37孕周婦女應(yīng)進(jìn)行GBS篩查，陽(yáng)性患者需預(yù)防性治療，以減少新生兒GBS的感染風(fēng)險(xiǎn)[8]。在中國(guó)，雖然有關(guān)于GBS定植與感染耐藥性的相關(guān)報(bào)道，但尚缺乏多中心、大樣本的研究數(shù)據(jù)。目前，常規(guī)的孕檢項(xiàng)目也未包括妊娠期婦女GBS篩查。有關(guān)GBS感染的文獻(xiàn)報(bào)道的攜帶率差異較大。本研究發(fā)現(xiàn)沈陽(yáng)地區(qū)GBS攜帶率僅為3.0%，而北京地區(qū)的妊娠婦女GBS攜帶率為3.4%～17.6%[9-10]，上海地區(qū)為3.7%[11]，廣州地區(qū)為9.1%～19.1%[12]，江蘇地區(qū)為4.1%～11.0%[13-16]，浙江地區(qū)為6.9%[14]。表明GBS攜帶率地域差異明顯，也可能由于各研究中所使用的GBS篩查方法及樣本量的不同導(dǎo)致。

3.2 GBS血清型的地域分布目前文獻(xiàn)中有關(guān)各地區(qū)GBS血清型的調(diào)查更加缺乏。本研究對(duì)沈陽(yáng)地區(qū)251株GBS純培養(yǎng)菌株采用PCR方法進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果顯示沈陽(yáng)地區(qū)GBS感染的血清型以Ⅰa（44.22%）和Ⅴ（38.65%）為主，其次為Ⅲ（13.94%）。雖然傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法仍為GBS檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在檢驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)、敏感度低的缺點(diǎn)，使得GBS篩選的陽(yáng)性率降低。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)GBS，但也存在假陽(yáng)性的問題。2010年《圍生期GBS預(yù)防指南》也明確指出PCR可以用于GBS的篩查工作，相關(guān)文獻(xiàn)也證實(shí)PCR對(duì)于篩查GBS具有準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)[10,17]。本研究中為避免PCR檢測(cè)方法存在假陽(yáng)性的問題，PCR擴(kuò)增的所有片段都進(jìn)行基因測(cè)序分析。Ippolito等[18]對(duì)全世界多個(gè)國(guó)家和地區(qū)妊娠期婦女GBS血清型的大規(guī)模數(shù)據(jù)分析顯示，不同地區(qū)GBS血清型的差異較大，亞洲人種以Ⅲ型最多，可達(dá)29.83%，其次是Ⅴ（17.49%）、Ⅰb（14.07%）、Ⅰa（11.24%），尚缺乏中國(guó)的相關(guān)數(shù)據(jù)。研究結(jié)果還顯示緬甸和印度人群GBS的血清型均以Ⅰa型為主，其次是Ⅲ型和Ⅴ型；泰國(guó)GBS血清型以Ⅴ型為主，其次是Ⅰa型和Ⅲ型，均表明亞洲地區(qū)的血清型分布存在明顯的地域差異。Johri等[19]的研究表明中國(guó)妊娠期婦女GBS感染主要以Ⅰa（18%）、Ⅱ（36%）和Ⅲ（26%）為主。上海的一項(xiàng)多中心研究結(jié)果則表明該地區(qū)妊娠期婦女GBS感染以Ⅲ、Ⅴ和Ⅰa型為主，達(dá)79.7%[20]。本研究中遼寧地區(qū)GBS血清型分布的研究結(jié)果與其研究結(jié)果較一致，但以血清型Ⅰa為主，表明GBS血清型的分布存在明顯的地域差異。有必要對(duì)我國(guó)其他地區(qū)進(jìn)行大規(guī)模的GBS血清型分布調(diào)查，以明確不同地區(qū)GBS血清型的分布差異，對(duì)于GBS疫苗的研發(fā)及防治具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)一種新的血清型，與血清型Ⅴ同源性最高，僅存在1個(gè)堿基位點(diǎn)的差異，暫命名為血清型NT。Slotved等[21]也曾發(fā)現(xiàn)1個(gè)與血清型Ⅴ同源性較高的新型GBS，有6個(gè)堿基位點(diǎn)的差異，命名為血清型Ⅸ。

3.3 GBS不同血清型的耐藥差異分析本研究對(duì)GBS不同血清型的菌株進(jìn)行耐藥性差異分析。結(jié)果顯示，GBSⅠa、Ⅴ、Ⅲ和NT 4個(gè)血清型對(duì)青霉素、氨芐西林、美羅培南、利奈唑胺和萬(wàn)古霉素敏感率均為100%。因?yàn)榍嗝顾睾桶逼S西林具有不良反應(yīng)小、對(duì)母嬰危害程度低的特點(diǎn)，所以目前仍可將其作為孕產(chǎn)婦及新生兒GBS治療的首選藥物[22]。研究還發(fā)現(xiàn)這4個(gè)血清型對(duì)紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星和四環(huán)素具有一定的耐藥性，但4個(gè)血清型之間的耐藥性無明顯差異。而血清型Ⅰa、Ⅲ、Ⅴ分別對(duì)紅霉素、左氧氟沙星、克林霉素和四環(huán)素之間的耐藥率有顯著差異。Church等[23]研究發(fā)現(xiàn)28%的GBS感染患者預(yù)防性使用抗菌藥物是無效的。本研究發(fā)現(xiàn)的耐藥差異可能解釋了為什么預(yù)防應(yīng)用抗菌藥物對(duì)于某些GBS感染無效，而這勢(shì)必會(huì)增加圍生期的感染發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

3.4 攜帶不同GBS血清型的孕晚期婦女胎膜早破的差異性分析本研究還發(fā)現(xiàn)攜帶不同血清型的孕晚期婦女胎膜早破的發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以攜帶血清型Ⅲ的發(fā)生率最高，為34.28%，其次為NT（25.00%）、Ⅰa（23.42%）和Ⅴ（10.31%）。唾液酸是莢膜多糖的共有結(jié)構(gòu)，是GBS一個(gè)重要的毒力因子，不同GBS血清型唾液酸的含量不同，毒力也不同[3]。其中以血清型Ⅲ唾液酸的含量最高，因此毒力也最強(qiáng)，這可能是血清型Ⅲ導(dǎo)致胎膜早破高發(fā)生率的重要原因。胎膜早破一方面會(huì)使胎膜對(duì)羊膜腔的屏障作用消失，增加絨毛膜羊膜炎和孕婦產(chǎn)褥感染的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；另一方面可引起早產(chǎn)、胎兒窘迫等不良結(jié)局的發(fā)生。陰道、直腸等處的GBS可上行感染胎膜，引起胎膜局部張力下降，導(dǎo)致胎膜早破的發(fā)生。GBS對(duì)絨毛膜的穿透力和吸附力均較強(qiáng)，容易導(dǎo)致絨毛膜羊膜炎的發(fā)生[24]。10種GBS血清型以Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型致病力最強(qiáng)。本研究中以攜帶血清型Ⅲ孕晚期婦女胎膜早破的發(fā)生率最高，也再次證明血清型Ⅲ的毒力較強(qiáng)。

綜上所述，應(yīng)當(dāng)重視孕晚期婦女GBS的篩查工作，進(jìn)而了解GBS不同血清型的臨床特點(diǎn)和耐藥情況，采取恰當(dāng)?shù)拇胧?，因型施治，為GBS感染的預(yù)防、篩查和科學(xué)診療提供依據(jù)；了解不同地區(qū)GBS血清型的分布情況，對(duì)于GBS疫苗的研發(fā)工作具有重要意義。