衢州市單中心兒童肺炎鏈球菌感染流行及血清型分布特征研究

楊云飛 邱玉萍 程穎 李夢萍 朱揚(yáng)帆 王燕飛 劉林 陸軍

肺炎鏈球菌是社區(qū)獲得性感染的重要病原體，也是引起兒童細(xì)菌性肺炎、鼻竇炎、菌血癥的主要病原體。肺炎鏈球菌有90 多個血清型，在全球范圍內(nèi)，6～11 種血清型可引起70%以上5 歲以下兒童的侵襲性肺炎鏈球菌病（invasive pneumococcal disease，IPD）[1]，不同地區(qū)兒童攜帶或感染肺炎鏈球菌的血清型也有所不同[2]。肺炎鏈球菌多糖結(jié)合疫苗（polysaccharide conjugate vaccine，PCV）能夠有效刺激小兒免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生足夠的保護(hù)性抗體，并具有免疫記憶[3]。了解衢州地區(qū)兒童感染肺炎鏈球菌的臨床特征和血清型，將有助于指導(dǎo)推廣疫苗和臨床用藥。本研究收集衢州市人民醫(yī)院引起兒童感染的107 株肺炎鏈球菌，對其進(jìn)行血清型鑒定，為疫苗推廣及肺炎鏈球菌疾病（pneumococal disease，PD）的防治提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 菌株來源分離及鑒定 收集2020 年1 月至2022年6 月衢州市人民醫(yī)院16 歲以下肺炎鏈球菌感染患兒的樣本痰液和膿液等標(biāo)本接種于哥倫比亞血瓊脂平板置35 ℃含5% CO2的孵育箱中培養(yǎng)24～48 h；血液標(biāo)本經(jīng)BACTEC FX 全自動血培養(yǎng)儀（美國BD 公司）肉湯增菌陽性報警后接種于哥倫比亞血瓊脂平板置35 ℃含5% CO2的孵育箱中培養(yǎng)24～48 h。觀察中間凹陷的單個菌落，涂片革蘭染色，鏡檢可見革蘭陽性球菌，呈矛尖狀，尖端朝外，寬端相對，成雙排列，無芽孢，有莢膜，疑為肺炎鏈球菌的菌株，隨后進(jìn)行奧普托欣敏感試驗，37 ℃5% CO2孵育18～24 h 觀察結(jié)果，抑菌圈＞14 mm 為敏感，初步判斷其為肺炎鏈球菌。利用基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜儀（德國Bruker 公司）對其進(jìn)行進(jìn)一步菌種鑒定，大腸埃希菌ATCC25922 為儀器的校準(zhǔn)株，綜合以上結(jié)果鑒定為肺炎鏈球菌共107 株（同一例患兒同一部位的重復(fù)菌株不予統(tǒng)計），保存于-80 ℃冰箱，等檢測前取出，37 ℃5% CO2孵育18 h 后進(jìn)行后續(xù)血清型鑒定實(shí)驗。本研究經(jīng)衢州市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過（批件號：衢州市人民醫(yī)院倫審2022研第059號）。

1.2 肺炎鏈球菌血清型分型鑒定 通過乳膠凝集試驗和莢膜腫脹試驗對待測肺炎鏈球菌進(jìn)行血清型分型鑒定。乳膠凝集試驗試劑和莢膜特異性抗血清SSI Diagnostica 購自丹麥研究所Statens Serum Institute。首先分別取5 μL 含有肺炎鏈球菌不同血清型抗原的乳膠懸液試劑到反應(yīng)板上，加入5 μL 過夜培養(yǎng)的菌液，混勻，5～10 s 內(nèi)觀察凝集反應(yīng)，根據(jù)凝集情況判斷陽性反應(yīng)，并通過血清型棋盤分組法判斷所測肺炎鏈球菌的血清型或組。而后通過乳膠凝集試驗確定待測肺炎鏈球菌的血清型或組后，將待檢細(xì)菌混懸液與血清和亞甲基藍(lán)混合等待5 min，在100 倍油鏡下觀察結(jié)果。如果莢膜顯著腫大，菌體周圍有一無色而較寬的環(huán)狀物時，判定為莢膜腫脹試驗陽性，隨后根據(jù)肺炎鏈球菌血清型抗原反應(yīng)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)判讀待測菌株的血清型及其亞型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Graphpad 9.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患兒的一般資料及臨床特征 107 例肺炎鏈球菌陽性患兒的一般資料見表1?；純褐心行哉急?1.4%；年齡2 個月～15 歲，其中≤1 歲患兒占比最高，為48.6%，其次是＞1～≤5 歲兒童占比41.1%，＞5 歲的肺炎鏈球菌陽性患兒僅占總數(shù)的10.3%。臨床診斷以呼吸道疾病為主，其中診斷為支氣管肺炎的患兒占68.2%，其次是支氣管炎和上呼吸道感染，分別占10.3%和8.4%。標(biāo)本來源以痰液標(biāo)本為主，共100 例（占93.5%），其余分別為血液標(biāo)本4 例（占3.7%），膿液標(biāo)本3 例（占2.8%）。

表1 肺炎鏈球菌陽性患兒臨床特征

2.2 肺炎鏈球菌血清型分布情況 107 株肺炎鏈球菌菌株除2 株不能明確分型外，共鑒定出21 種血清型，排名前5 位的血清型為19F（31 株，占29.0%），其次為6B（16 株，占15.0%）、14（9 株，占8.4%）、19A（8 株，占7.5%），3（5 株，占4.7%），見圖1。7 價PCV（PCV7）、PCV13 和PCV20 的血清型覆蓋率分別為56.1%（60/107）、71.0%（76/107）、78.5%（84/107）。PCV13 疫苗包含的4、9V、18C、1、5 和7F 血清型未有發(fā)現(xiàn)。另外，有21 株（19.6%）肺炎鏈球菌屬于非疫苗血清型，其中血清型15A 分離出4 株，占比最大；另外還有6C、16F、23A、7C、13、20、34、10B、15C、35B 等型別。肺炎鏈球菌的各血清型在3 組不同年齡患兒中（≤1 歲、＞1～≤5歲和＞5 歲），PCV7 的血清型覆蓋率分別為53.8%、61.4%和45.5%，PCV13 的血清型覆蓋率分別為71.2%、68.2%和81.8%，PCV20 的血清型覆蓋率分別為78.8%、75.0%和90.9%。非疫苗血清型在3 組不同年齡患兒分離菌株的占比分別為17.3%、25.0%和9.1%。

圖1 肺炎鏈球菌血清型分布情況圖（A：PCV7、PCV13 和PCV20 覆蓋血清型肺炎鏈球菌在不同年齡組患兒中的分離情況；B：非疫苗血清型肺炎鏈球菌血清型分布情況；C：PCV 及非疫苗血清型菌株分離率，PCV13 增加和PCV20 增加分別代表這兩種疫苗相較PCV7 增加的覆蓋血清型所占比例）

2.3 不同疾病患兒肺炎鏈球菌血清型分布情況 107株肺炎鏈球菌分離自13 種臨床疾病患兒，其中占比最高為支氣管肺炎（68.2%，73/107），其次為支氣管炎（10.3%，11/107），然后是上呼吸道感染（8.4%，9/107），見圖2。肺炎患兒分離菌株中居前5 的血清型為19F、6B、14、19A 和15A，而引起支氣管炎和上呼吸道感染主要是19F、6B 和14。其中分離自上呼吸道感染患兒的菌株中有4 株肺炎鏈球菌從血液標(biāo)本中獲得，血清型分別為6B 和14 各2 株。由于本研究收集的所有肺炎鏈球菌中引起兒童支氣管肺炎的占比最大，因此，為評估PCV 對該類疾病的保護(hù)力，對PCV7、PCV13 和PCV20 覆蓋血清型肺炎鏈球菌引起支氣管肺炎和非該類疫苗覆蓋血清型肺炎鏈球菌引起支氣管肺炎病例數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，PCV7 覆蓋血清型與非PCV7 血清型差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.564，P=0.453）；但PCV13 覆蓋血清型與非PCV13 血清型和PCV20 覆蓋血清型與非PCV20 血清型引起肺炎病例數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.957、9.974，P=0.008、0.002）。

圖2 兒童分離肺炎鏈球菌不同血清型與疾病相關(guān)分布圖

3 討論

肺炎鏈球菌是引起幼兒各種感染性疾病最常見的病原菌，同時也是人體鼻咽部常見的定植菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力減弱的時候，肺炎鏈球菌便可能入侵機(jī)體引發(fā)感染，比如中耳炎、上呼吸道感染、肺炎和腦膜炎。據(jù)WHO 估計，每年約有70～100 萬兒童死于PD，其中大多數(shù)為發(fā)展中國家兒童，包括中國[4-5]。PD 已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，然而自從PCV 問世以來，PD 在全民接種該疫苗的國家得到了有效控制，因此，2008年P(guān)D 被WHO 列為需“極高度優(yōu)先”使用疫苗預(yù)防的疾病[6]。2021 年約翰霍普金斯大學(xué)彭博公共衛(wèi)生學(xué)院統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，雖然目前中國兒童存活率已大大提高，但每年因PD 死亡的兒童人數(shù)仍有數(shù)千人[7]，而接種PCV 作為預(yù)防PD 的最佳干預(yù)措施在中國并未進(jìn)入國家計劃疫苗清單，自費(fèi)接種費(fèi)用較高，疫苗覆蓋率不高。PCV 主要針對一些高毒力的流行血清型設(shè)計，因此評估肺炎鏈球菌血清型分布以及PCV 對我國兒童PD 的保護(hù)力將有益于推動肺炎鏈球菌疫苗接種和指導(dǎo)我國疫苗的研發(fā)。另外，我國各地區(qū)流行肺炎鏈球菌血清型有很大差異，且衢州地區(qū)目前無對應(yīng)的肺炎鏈球菌分布和PD 監(jiān)測數(shù)據(jù)，故本研究首次對衢州地區(qū)兒童患者分離肺炎鏈球菌血清型和相關(guān)PD 流行情況進(jìn)行了全面分析，以期指導(dǎo)該地區(qū)的疫苗接種策略和促進(jìn)PD 防控。

本研究發(fā)現(xiàn)，在過去2 年中，本中心引起16 歲以下兒童感染性疾病的主要流行肺炎鏈球菌血清型為19F、6B、14、19A 和3。Lyu 等[8]研究報道2006—2016 年中國肺炎鏈球菌的主要流行血清型為19F、19A、23F、14 和6B。同時，同一時段的一項Meta 研究表明中國兒童肺炎鏈球菌血清型以19F、19A、14、6B 和23F 為主[9]。這與本研究結(jié)果略有不同，區(qū)別在血清型19A作為PCV13 新增覆蓋血清型在本中心流行排名中并非前3，這可能與近年來PCV13 的接種情況與過去10年相比有所提高相關(guān)，更說明長期監(jiān)測肺炎鏈球菌血清型流行情況的必要性。另外，一項2020 年以前的研究發(fā)現(xiàn)引起兒童IPD 的肺炎鏈球菌血清型主要為19A、19F、14、23F 和6B[10]。雖然在本研究中僅有4 株肺炎鏈球菌來自血液標(biāo)本，但它們的血清型仍然為6B和14，說明引起衢州市兒童IPD 的主要血清型與全國流行趨勢一致。值得注意的是，血清型3 在本研究中排在血清型的前5，這與其他地區(qū)的研究結(jié)果不同[11]，作為另一個在PCV13 中新增的重要致病血清型，其疫苗應(yīng)答效果不如19A，該結(jié)果也與其他相關(guān)報道一致[12]，提示需要在未來的PD 防控和疫苗設(shè)計中對該血清型有進(jìn)一步針對性的措施。

本研究中107 株肺炎鏈球菌分離自2 個月～15 歲的兒童，52 株分離自1 歲以下患兒，占48.6%；96 株分離自5 歲以下患兒，占89.7%。這與WHO 和中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會相關(guān)專家共識符合，提示年齡＜2 歲兒童為肺炎鏈球菌感染的易感人群，其感染PD 的可能性遠(yuǎn)高于其他年齡段人群[13-14]。針對該易感人群，PCV 的保護(hù)就顯得尤為重要，本研究表明，衢州地區(qū)PCV7 在2歲以下患兒中的血清型覆蓋率為53.8%，而PCV13 則可以覆蓋71.2%的2 歲以下患兒中分離到的致病性肺炎鏈球菌血清型，PCV20 的覆蓋率更達(dá)到了78.8%。現(xiàn)階段衢州地區(qū)可供自費(fèi)接種的是PCV13，根據(jù)以上結(jié)果，相比2015 年以前的PCV7，說明PCV13 可以大大提高對該地區(qū)PD 易感兒童的保護(hù)。雖然PCV20 相比PCV13 僅有不到10%的血清型覆蓋率提高，但PCV20新增血清型15B 在本研究中也導(dǎo)致3 例肺炎，因此在未來進(jìn)一步推廣PCV20 的接種也是非常必要的。另外，值得注意的是非疫苗血清型引起PD 的比例并不低（19.6%），其中還有2 株為無莢膜型肺炎鏈球菌，因此研究非血清型依賴性肺炎鏈球菌疫苗仍然是目前全球PD 防控需要努力的方向。

本研究肺炎鏈球菌陽性患兒中的臨床診斷以呼吸道疾病為主，其中肺炎鏈球菌感染支氣管肺炎的患兒最多，占比68.2%，其次是支氣管炎和上呼吸道感染。針對該主要肺炎鏈球菌感染性疾病，筆者進(jìn)一步的分析表明，支氣管肺炎患兒中分離得到居前3 的血清型為19F、6B 和14，與其他地區(qū)肺炎鏈球菌導(dǎo)致兒童肺炎的優(yōu)勢血清型比較，如上海（19F、6A 和19A）[11，15]和北京（19F、19A 和23F），19F 均為最常見血清型。血清型6B 和14 在支氣管肺炎患兒中的流行與上述地區(qū)有所不同，但與一項浙江地區(qū)的研究結(jié)果類似[16]，說明引起肺炎的致病性肺炎鏈球菌血清型具有顯著的地域流行性。隨后，針對該研究中肺炎鏈球菌導(dǎo)致的主要感染性疾病支氣管肺炎，進(jìn)一步評估了不同PCV 對衢州地區(qū)兒童的保護(hù)情況。本研究結(jié)果表明，PCV7 的接種并不能顯著降低兒童肺炎鏈球菌肺炎的數(shù)量，但PCV13 和PCV20 能顯著提高對肺炎鏈球菌引起兒童支氣管肺炎的保護(hù)。該結(jié)果的報道在衢州地區(qū)尚屬首次，將為指導(dǎo)該地區(qū)肺炎鏈球菌疫苗接種提供理論依據(jù)。另需注意的是，本次血液標(biāo)本中分離得到的4 株肺炎鏈球菌均分離自上呼吸道感染患兒，有研究表明無病灶血流感染也有較高的病死率（7.8%）[17]，故對初診斷為上呼吸道感染未累積肺部形成病灶的患兒，血液標(biāo)本的檢測及持續(xù)關(guān)注也是極為重要的，可以避免IPD 的漏診和治療延誤。

綜上所述，本研究首次對衢州地區(qū)兒童感染PD分離菌株血清型分布及相關(guān)感染性疾病進(jìn)行了分析研究。結(jié)果表明，引起衢州地區(qū)兒童PD 的主要血清型為19F、6B、14、19A 和3，主要引起該地區(qū)兒童患支氣管肺炎。PCV13 和PCV20 對該地區(qū)兒童感染肺炎鏈球菌支氣管肺炎有顯著保護(hù)力，在未來免疫該疾病中應(yīng)積極推廣，非血清型依賴性肺炎鏈球菌疫苗的研發(fā)仍有重要價值。針對首診無肺炎癥狀的上呼吸道感染患者也應(yīng)提高重視，避免IPD 的漏診。本研究為全面了解衢州地區(qū)肺炎鏈球菌流行情況和有效防控PD提供了科學(xué)數(shù)據(jù)，更明確了建立PD 發(fā)病狀況的監(jiān)測系統(tǒng)，針對肺炎鏈球菌血清型分布和感染性疾病長期流行病學(xué)監(jiān)測的重要性。