流行性感冒病毒感染的實驗室診斷技術(shù)應(yīng)用進展

成軍 王寧寧 劉夢如 戴玉柱

流行性感冒（簡稱流感）病毒是流感的病原體，該病毒為單股負鏈RNA 病毒，歸屬于正粘病毒科。根據(jù)其核蛋白（nucleoprotein，NP）和基質(zhì)蛋白（matrix protein，M）的抗原性不同，可分為甲、乙、丙、?。ɑ駻、B、C、D）4 型[1]。此外，甲型流感病毒又根據(jù)表面的血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）的不同分為不同亞型[2]。HA 分為18 種亞型，NA 分為11 種亞型。兩種抗原亞型之間組合形成了具有不同抗原特性和致病性的甲型流感病毒亞型；乙型流感病毒無亞型之分，隨著HA 持續(xù)不斷進化，逐漸形成Victoria 系和Yamagata 系[3]。目前，在人群中流行的主要有甲型流感病毒（H1N1、H2N2、H3N2 亞型）和乙型流感病毒中的Victoria 系[4]，其中H1N1 和H3N2 是引起季節(jié)性甲型流感的主要亞型，而其他甲型流感亞型的自然宿主要是鳥類和動物，其中H5、H7、H9 亞型對家禽影響最大。

2009 年3 月在墨西哥和美國先后爆發(fā)了大規(guī)模流感，后經(jīng)證實是一種新型甲型H1N1 流感病毒，是由歐洲豬流感病毒（提供NA 和M 基因）和北美三源基因重配的豬流感病毒（提供PB2、PB1、PA、HA、NP和NS 基因片段）通過基因重配的產(chǎn)物[5]。據(jù)WHO 統(tǒng)計，此次流感大流行蔓延到214 個國家和地區(qū)，導(dǎo)致近20 萬人死亡[6]。至今，全世界每年約有5%成人和20%兒童感染甲型或乙型流感[7]，對世界公共衛(wèi)生安全造成了一定意義的威脅。接種流感疫苗是預(yù)防流感的有效手段，但是現(xiàn)有疫苗無法對所有正在出現(xiàn)變異的單一流感病毒亞型提供保護，并且疫苗接種保護率也有待考證。所以，在流感流行季節(jié)、疫情暴發(fā)和存在流感高危因素時，流感病毒的早期診斷是刻不容緩的事。流感病毒的診斷具有一定的挑戰(zhàn)性，因為其臨床表現(xiàn)與鼻病毒、副流感病毒、腺病毒和新型冠狀病毒有相似之處[8]，所以，“早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早診斷、早治療”是預(yù)防和控制流感傳播的有效方法。及時快速的檢測方法也有助于患者在感染后進展為更嚴重之前進行早期對癥治療。本文就流感病毒感染實驗室診斷技術(shù)應(yīng)用進展作一述評，為其早期診斷提供參考。

1 病毒培養(yǎng)

狗腎傳代細胞（Madin-Darby canine kidney，MDCK）是流感病毒的敏感細胞[9]，且細胞代謝特性穩(wěn)定，適合大規(guī)模培養(yǎng)流感病毒，因此目前常用MDCK 細胞分離培養(yǎng)流感病毒[10-12]。使用流感病毒樣本感染已建立的細胞系，觀察細胞病變作用，并通過特異性抗體染色、血凝抑制試驗（hemagglutination inhibition test，HI）和免疫熒光顯微鏡進行確定[13]。HI 不僅可以用于鑒定待檢病毒的型別及亞型，也常用于檢測同型別病毒的抗原變異情況[14]?；诓《九囵B(yǎng)的免疫熒光法用于鑒定病毒具有快速、特異的優(yōu)點，細胞內(nèi)的病毒可被熒光素標(biāo)記的特異性抗體著色，在熒光顯微鏡下可見斑點狀黃綠色熒光，根據(jù)所用抗體的特異性判斷為何種病毒感染[15]。整個病毒培養(yǎng)過程耗時長，操作周期長，對實驗人員和環(huán)境要求高，因此難以快速檢測病毒，也不適用于大量樣本的檢測篩查。不過，病毒培養(yǎng)卻能夠獲取病毒株，這對于研究病毒基因特性、抗原性、疫苗研發(fā)以及耐藥性方面非常具有意義。

2 免疫學(xué)檢測

免疫學(xué)檢測主要是通過抗原檢測患者標(biāo)本中的病原體抗體或通過抗體檢測患者標(biāo)本中病原體的抗原。常用的免疫學(xué)檢測方法如HI、中和試驗（neutralization test，NT）、免疫熒光法（immunofluorescence，IF）、免疫膠體金技術(shù)（immune colloidal gold technique，ICG）和ELISA 等，與其他技術(shù)相比，免疫學(xué)檢測具有簡單、快捷、成本低廉的優(yōu)點，但是不適用于早期感染，且無法量化病毒和出現(xiàn)假陽性率等缺點。近年來，免疫學(xué)方法不斷發(fā)展，如基于納米酶的免疫學(xué)檢驗備受關(guān)注，使免疫學(xué)檢查中的不足得到了一定程度的優(yōu)化。

2.1 HI HI 是確定人和其他動物模型自然感染和接種疫苗后血清中是否存在特異性流感病毒HA 抗體的最常用方法[16-17]。該試驗是基于血凝反應(yīng)的原理，通過觀察病毒與紅細胞之間的相互作用來評估抗體對病毒的中和抑制效果。通過比較添加不同濃度待測樣品后的血凝情況，可以確定待測樣品中的抗體滴度，即最低有效稀釋度?？贵w滴度越高，說明抗體對病毒的中和抑制效果越強。但是HI 的重復(fù)性較低，有時會與其他病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。HI 測定的標(biāo)準化可提高該方法的可重復(fù)性[18]。在一項研究中，使用HI 和補體結(jié)合試驗（complement fixation，CF）對120 例患者進行了當(dāng)前流感毒株檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HI 比CF 更敏感，但特異度較低[19]。CF 由于靈敏度較低已被HI、NT 所取代。

2.2 NT NT 可用于檢測病毒、細菌、毒素和其他生物分子的抗原性質(zhì)，也可以用于疫苗和藥物的研發(fā)?；驹硎腔诓《咎禺愋钥贵w能夠中和病毒的特性。NT 常用于檢測季節(jié)性或禽流感毒株的抗體效價。NT測定法較HI 測定法更為靈敏，NT 測定法中病毒中和抗體的特異性高，持續(xù)時間久，以往受顯性或隱性感染后，血中可長期存在中和抗體，所以適用于流行病學(xué)調(diào)查或人群免疫水平研究，但因試驗方法繁雜，且需要在認證的BSL2+和BSL3+實驗室中使用其感染性病毒，所以在常規(guī)診斷中的應(yīng)用受到限制[13]。

2.3 IF IF 包括直接免疫熒光技術(shù)、間接免疫熒光技術(shù)、時間分辨熒光免疫分析法和補體法。IF 用于檢測臨床標(biāo)本中病毒抗原，具有快捷、特異的優(yōu)勢。檢測原理是細胞或組織中的抗原或抗體，與標(biāo)記了相應(yīng)熒光素抗體或抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，之后肉眼在顯微鏡下進行觀察，標(biāo)本中的抗原或抗體可通過因激發(fā)光照射發(fā)出的熒光而被定量檢測。免疫熒光技術(shù)靈敏度高、特異性強、觀察直觀，相對于病毒培養(yǎng)，大大縮短了試驗時長。但其依賴特異性高、穩(wěn)定性好的抗體，并進行熒光標(biāo)記，這可能大大增加了試劑的成本和操作的復(fù)雜性。

2.4 ICG ICG 是繼免疫熒光技術(shù)、放射同位素示蹤技術(shù)和酶標(biāo)記三大技術(shù)之后，以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)[20]，具有操作簡單、快捷直觀、靈敏度高等優(yōu)點，是目前最廣泛的免疫學(xué)檢測技術(shù)之一。其中應(yīng)用最多的是膠體金免疫層析法（gold immunochromatography assay，GICA）。GICA 基本原理是將特異性抗原或抗體以條帶狀固定于膜上，并采用膠體金標(biāo)記試劑吸附在結(jié)合墊上，樣品在層析作用下向前移動，當(dāng)樣品中存在相應(yīng)的特異性病毒抗原時，可與結(jié)合墊處金標(biāo)抗體相結(jié)合，并聚集于檢測帶上，大量積聚后可肉眼觀察到顯色結(jié)果。王璽榮等[21]建立了一種基于量子點熒光免疫層析技術(shù)的高準確率快速檢測甲型/乙型流感病毒的方法，該方法不僅能夠通過簡單的步驟進行結(jié)果定性，而且還可以通過一個低成本儀器定量檢測病毒濃度。但是仍需要檢測儀器觀察定量結(jié)果，導(dǎo)致該方法在諸如欠發(fā)達地區(qū)、家庭自測等場景的應(yīng)用局限性。另外，GICA 的靈敏度和特異度受抗體或抗原的影響較大，需要高質(zhì)量的抗體或抗原來提高其準確性。

2.5 ELISA ELISA 因靈敏度高、操作簡單、特異性強等特點成為目前發(fā)展速度最快和應(yīng)用范圍最廣泛的免疫學(xué)技術(shù)，其基本原理是采用酶蛋白分子來標(biāo)記抗體或抗體分子形成酶標(biāo)抗體，酶標(biāo)抗體與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體進行特異性結(jié)合，用洗滌法將液相中游離成分洗出。滴入底物溶液，通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)存在，從而推斷待測抗體或抗原的量。廈門大學(xué)在2009 年甲型H1N1pdm0 9 流感大流行期間進行了一項新的基于夾心ELISA 的診斷研究，采用特異性單克隆抗體和辣根過氧化物酶連接兔抗HA 多克隆抗體，該方法具有較高的靈敏度[22]。鄧濤等[23]建立的NA 雙抗體夾心ELISA 定量檢測法具有良好的準確度、重復(fù)性、中間精密度和耐用性，可用于流感疫苗的檢測及生產(chǎn)過程中對NA 含量的質(zhì)量控制。但需要注意的是，ELISA 有時也會出現(xiàn)交叉反應(yīng)，這就可能導(dǎo)致假陽性或者假陰性的結(jié)果，需要進一步確認和鑒定。

2.6 納米酶免疫學(xué)技術(shù) 2007 年，閻錫蘊團隊發(fā)現(xiàn)了納米粒子具有辣根過氧化物酶的催化活性，能夠在溫和的生理條件下，催化酶的底物并遵循酶促反應(yīng)動力學(xué)將其轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，并在2015 年成功研制了用于埃博拉病毒快速檢測的“納米酶試紙”[24]，該試紙條充分利用了磁納米材料的催化活性、磁性和顯色反應(yīng)，其測試靈敏度比常規(guī)試紙條高100 倍。納米酶作為2022年度化學(xué)領(lǐng)域十大新興技術(shù)之一，在免疫學(xué)、生物學(xué)、疾病監(jiān)測等領(lǐng)域顯示出了巨大的應(yīng)用潛力。該方法的基本原理就是將納米酶與檢測目標(biāo)相關(guān)的抗體或其他生物分子進行結(jié)合，使納米酶獲得特異性識別能力，之后與目標(biāo)抗原結(jié)合時，會催化產(chǎn)生可檢測的信號，以此作為病毒檢測的結(jié)果。采用模擬天然酶的催化位點或為反應(yīng)提供多價元素，現(xiàn)已成為天然酶的替代品。劉鍵等[25]建立了磁珠納米酶催化免疫層析試紙條用于檢測H7N9 亞型禽流感病毒，該方法的靈敏度比膠體金法可提高1～2 個數(shù)量級，與目前常用的核酸檢測方法相比，檢測時間大大縮短，適用于即時檢測（point of care test，POCT）。但是目前納米酶的種類較少，且納米酶的質(zhì)量和性能參差不齊，所以方法的可靠性和標(biāo)準化還有待進一步研究和提升。

3 分子生物學(xué)試驗

隨著核酸擴增PCR 的發(fā)展，其在病毒檢測方面得到了廣泛的應(yīng)用[26]。PCR 檢測基于病毒的特異性DNA或RNA 序列，用于檢測流感病毒感染的分子生物學(xué)方法主要包括實時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR（real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、連接酶鏈反應(yīng)（ligase chain reaction，LCR）和基于核酸序列的擴增等。與基于抗原的免疫學(xué)檢測法相比，能夠更早的監(jiān)測到病毒，且PCR 檢測更加靈敏。其中real-time RT-PCR 不僅能夠有效解決PCR 造成的污染，同時能夠?qū)崿F(xiàn)自動化檢測，特異度較高，目前已經(jīng)成為臨床監(jiān)測流感病毒的“金標(biāo)準”[27]。近年來，PCR 技術(shù)不斷創(chuàng)新，微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）[28]的發(fā)展進一步提高了病毒檢測的準確度，并且同時具有良好的抗干擾能力，表現(xiàn)出了較高的應(yīng)用價值和發(fā)展前景，但是由于其設(shè)備和耗材昂貴，ddPCR 的普及及應(yīng)用具有一定的限制。

3.1 real-time RT-PCR real-time RT-PCR 是使用特異性引物進行檢測并分型流感病毒亞型。該方法包括從樣本中提取病毒RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA 轉(zhuǎn)錄成互補的DNA，并對產(chǎn)物進行熒光擴增檢測，通過熒光強度觀察產(chǎn)物量的變化，從而建立熒光擴增曲線圖[29]。多重real-time RT-PCR 方法中通過多條特異性引物，可以在一個反應(yīng)中進行檢測多種流感病毒亞型。該方法敏感、快速、特異性強，能直接檢測臨床標(biāo)本，該技術(shù)的靈敏度在所有傳統(tǒng)檢測方法中較高。另一方面，也有研究指出該檢測方法實驗過程耗時長，例如Shigemoto 等[30]用多重?zé)晒鈘eal-time RT-PCR 方法檢測諾如病毒，需要6 h 時長；采用核酸擴增技術(shù)，準確檢出H7 亞型禽流感病毒通常需要4～6 h。另外，該方法診斷費用較高、設(shè)備昂貴，需要特殊的實驗室條件是其弊端所在。

3.2 LAMP LAMP 測定法常用于流感病毒、嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndromes，SARS）、鼻病毒、腺病毒等多種病毒的檢測。通常使用DNA 聚合酶或RNA 逆轉(zhuǎn)錄酶和兩套引物來識別目的DNA 上的6 個不同位點[31]，采用光度法擴增目的基因的敏感性一般與real-time RT-PCR 檢測相似。一種特定的逆轉(zhuǎn)錄入LAMP（reverse transcription LAMP，RT-LAMP）方法被開發(fā)出來用于流感病毒的特異性評估和分型[32]，其特異度為93.8%。LAMP 測定法在等溫條件下進行，不需要復(fù)雜的溫度循環(huán)步驟，因此可在短時間內(nèi)完成擴增反應(yīng)。但是相比普通PCR 技術(shù)，LAMP 技術(shù)在引物設(shè)計上更為復(fù)雜，需要設(shè)計多個特異性引物來擴增目標(biāo)序列，這增加了技術(shù)上的挑戰(zhàn)和實驗的復(fù)雜性。所需的試劑盒和設(shè)備成本較高，這限制了其在某些資源有限環(huán)境中的應(yīng)用。

3.3 ddPCR ddPCR 是基于傳統(tǒng)PCR 方法的改進。根據(jù)DNA 有限稀釋法和松泊分布[33]來測定目標(biāo)核酸分子的濃度。ddPCR 中的病毒核酸分子被稀釋成單個分子進行獨立平行PCR 擴增，擴增后對各PCR 反應(yīng)的熒光信號進行分析，從而達到對核酸分子進行絕對定量的目的。ddPCR 中核酸分子單獨反應(yīng)，避免了交叉污染，使其結(jié)果更加準確、特異。該方法用于檢測流感病毒已經(jīng)得到了較好的證實[34-36]，有研究開發(fā)了一種六重ddPCR，可在單一反應(yīng)混合物中檢測甲型流感（H1、H3 和M）和乙型流感（YamagataHA、VictoriaHA 和M）片段[37]。有研究已經(jīng)證明，與RT-PCR 相比，ddRTPCR 可以更敏感更可靠的估計甲型H7N9 流感病毒載量[38]。甲型H1N1 流感病毒的一些突變可能改變神經(jīng)氨酸酶抑制劑奧司他韋的反應(yīng)，有研究使用ddPCR 方法對這些突變進行量化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ddPCR 在量化H1N1 病毒耐藥菌株方面的靈敏度比qPCR 高30 倍，準確度比qPCR 高10 倍[39]。

4 生物傳感器檢測方法

生物傳感器具有操作簡單、靈敏度高和反應(yīng)時間短等優(yōu)點，這均是得益于電極制造和生物識別元件的設(shè)計。生物傳感器基于與互補片段的親和力可以感知DNA、RNA、蛋白質(zhì)、酶、抗原、抗體等任何生物物體[40]。一個基本的生物傳感器包括生物分析物、傳感器、放大器和處理器。將樣本中的生物成分與已經(jīng)預(yù)先附著在電極表面的受體結(jié)合時，以電流、熱量和氣體的形式產(chǎn)生信號，然后由傳感器轉(zhuǎn)換為可讀的形式。根據(jù)生物傳感器所使用的信號讀取方式不同可以分為電化學(xué)生物傳感器、半導(dǎo)體生物傳感器、光學(xué)生物傳感器、壓力晶體生物傳感器、測熱性生物傳感器等，其中用于呼吸道病毒檢測的電化學(xué)生物傳感器的研究已是發(fā)展最快的科學(xué)領(lǐng)域之一，主要包括基于核酸型、免疫型和其他親和型生物傳感器[41]。另一方面，生物傳感器在反復(fù)使用之后，由于基質(zhì)效應(yīng)的存在，其穩(wěn)定性和準確性會受到影響。此外，生物傳感器的靈敏度取決于所使用生物識別元素的特性，如果生物分子濃度較低，常導(dǎo)致檢測結(jié)果的靈敏度不夠高，這就可能會導(dǎo)致產(chǎn)生假陰性或者假陽性的結(jié)果。

4.1 基于核酸型生物傳感器 以核酸為識別元件的電化學(xué)生物感受器一般采用DNA 或RNA，其序列通常固定在傳感器界面，它通過核酸的特異性序列識別和結(jié)合，實現(xiàn)與待測物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，形成電極信號，信號轉(zhuǎn)換器將其轉(zhuǎn)化為可測量的信號輸出。Bhardwaj 等[42]通過5 輪適配體篩選出了一種針對甲型流感病毒HA蛋白莖區(qū)的ssDNA 適配體，同時，該適配體可以識別mini-HA 蛋白和整個H1N1 病毒?；诤怂嵝蜕飩鞲衅髋c基于免疫型傳感器相比，核酸體積更小、成本相對低、更穩(wěn)定、易于生產(chǎn)且免疫原性較低，在開發(fā)具有高特異性的新型電化學(xué)生物傳感器方面具有相當(dāng)大的潛力[43]。

4.2 基于免疫型傳感器 抗體是基于免疫型傳感器的生物識別原件，可以識別和結(jié)合靶標(biāo)（抗原）。抗體因具有高特異度、高親和力和高靈敏度，目前已經(jīng)成為商業(yè)化和實驗室生物分析檢測的主要選擇，并在檢測病毒、蛋白質(zhì)和癌細胞方面顯示出了極高的應(yīng)用價值[44]。由于抗原抗體反應(yīng)具有特異性，所以免疫型傳感器成為檢測呼吸道病毒最常用的檢測工具之一。抗體可以通過天然或重組、單克隆或多克隆等方法獲得，但是其成本相對較高、不穩(wěn)定、合成復(fù)雜，且不適用于小分子、藥物和金屬離子的檢測[45]。

4.3 基于親和型生物傳感器 除核酸、抗體外，還有許多其他類型的生物識別原件，如胎兒蛋白A、多肽和聚糖等。其中胎兒蛋白A 可以通過NA 蛋白與不同的流感病毒結(jié)合，因此可以作為低成本、高選擇性的流感病毒檢測中的生物識別元件。例如，Anik 等[46]開發(fā)了一種基于石墨烯-金混合納米復(fù)合材料的電化學(xué)生物傳感器，用于識別甲型流感。

5 總結(jié)與展望

流感的早期診斷有助于及時發(fā)現(xiàn)感染病因，可在第一時間內(nèi)采取有效措施，防止病原傳播和阻止疫情擴散。傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)方法結(jié)果客觀、準確，但是耗時長、操作繁瑣，對于檢測流感病毒來說已經(jīng)逐漸被淘汰，但是在基礎(chǔ)研究方面依然具有一定的意義。免疫學(xué)、分子生物學(xué)和生物傳感器檢測由于近年來的快速發(fā)展，在靈敏度、準確度和降低成本等方面均進行了優(yōu)化和改善，其各領(lǐng)域新興技術(shù)不斷與POCT 技術(shù)相結(jié)合，特別是與分子生物學(xué)和納米材料等技術(shù)的結(jié)合，大大縮短了檢測時間和檢測成本，但真正實現(xiàn)高靈敏度的POCT 檢測流感病毒仍是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一大挑戰(zhàn)。希望在未來檢測流感病毒技術(shù)領(lǐng)域中，可以實現(xiàn)快速、靈敏、便捷的POCT 技術(shù)。將眾多方法的研究性和實用性真正有效的融為一體，為疾病的預(yù)防和控制打下堅實的基礎(chǔ)。

（本文由浙江省醫(yī)學(xué)會推薦）