規(guī)?；i場仔豬源大腸桿菌分離培養(yǎng)及血清型鑒定

馬長賓，陳文武，崔　蕾，韓猛立，黃　新，鐘發(fā)剛

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第六師五家渠市畜牧獸醫(yī)工作站，新疆 五家渠 831300；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 831000）

規(guī)模化豬場仔豬源大腸桿菌分離培養(yǎng)及血清型鑒定

馬長賓1，陳文武1，崔蕾1，韓猛立2，黃新2，鐘發(fā)剛2

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第六師五家渠市畜牧獸醫(yī)工作站，新疆 五家渠 831300；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 831000）

豬源大腸桿菌易引起仔豬消化道傳染病，主要危害1月齡以內(nèi)的仔豬，常發(fā)生嚴(yán)重的腹瀉和敗血癥。常見的有仔豬黃痢、仔豬白痢、仔豬水腫病，具有流行面廣、發(fā)病率和死亡率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重制約養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。隨著大腸桿菌對常用抗生素抗藥性越來越嚴(yán)重，應(yīng)用疫苗預(yù)防和控制仔豬腹瀉疾病越來越重要，國內(nèi)外已開展了預(yù)防腸毒源性大腸桿菌（ETEC）腹瀉的各種類型疫苗研究，例如基因工程活菌苗［1-3］與多價(jià)滅活菌苗［4］等。但由于大腸桿菌血清型多，變異大，抗原復(fù)雜，制苗菌株的血清型很難與地方菌相一致，影響了菌苗的使用效果。國內(nèi)外研究資料表明，引起仔豬黃白痢的致病性大腸桿菌常見的O血清型有O4，O8，O9，O45，O101，O115，O138，O139，O147，O199，O157，此外還有O2，O3，O20，O44，O55，O141，O6等血清型。我國學(xué)者相繼報(bào)道了各省的流行血清型［5-10］。但是有關(guān)第六師五家渠市地區(qū)仔豬源大腸桿菌血清型方面的研究較少。鑒于此，對六師五家渠市規(guī)模豬場仔豬大腸桿菌病的血清型流行情況及其優(yōu)勢血清型分布情況進(jìn)行研究，以便為該病的防控提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1病料來源根據(jù)新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第六師、五家渠市養(yǎng)豬業(yè)分布的特點(diǎn)，2013年3月-2014年12月期間，分別在101團(tuán)、103團(tuán)、新湖農(nóng)場、芳草湖農(nóng)場等地，通過科學(xué)的選點(diǎn)，用滅菌棉拭子從直腸取樣，瀕死或死亡的仔豬直接取十二指腸內(nèi)容物或病變組織，先后共采集疑似仔豬黃白痢、仔豬水腫病料361份。

1.2培養(yǎng)基及試劑麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、革蘭染色液、微量生化鑒定管用于細(xì)菌的生化試驗(yàn)等，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3豬大腸桿菌O抗原定型血清診斷液用于細(xì)菌的血清型鑒定，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.4方法

1.4.1樣本采集直接采集新鮮腹瀉糞便或先用酒精棉球把仔豬肛門及周邊擦拭干凈，再用無菌棉拭子采集腹瀉仔豬的直腸及死亡豬的十二指腸內(nèi)容物，置于滅菌離心管中，編號，將裝有糞樣標(biāo)本的離心管立即置于4℃泡沫箱，48 h內(nèi)增菌。無菌采集死亡12 h內(nèi)仔豬的肝臟和心血等病料，48 h內(nèi)增菌。

1.4.2大腸桿菌的分離純化取肛拭子或病料樣品接種于營養(yǎng)肉湯溶液，37℃過夜培養(yǎng)，將增菌液用接種環(huán)在麥康凱平板“Z”字劃線，37℃培養(yǎng)18～24 h后觀察培養(yǎng)特性，然后從每個(gè)平板挑取至少5個(gè)磚紅色、圓形凸起的菌落，接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板，置37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察分離細(xì)菌生長的菌落特點(diǎn)，同時(shí)用該菌落涂片，革蘭染色、鏡檢，然后挑取典型菌落再接種于營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純菌增殖。

1.4.3生化試驗(yàn)按文獻(xiàn)報(bào)道方法［11-12］對所有分離株進(jìn)行10項(xiàng)生化指標(biāo)的測定。

1.4.4大腸桿菌“O”血清型鑒定參照文獻(xiàn)報(bào)道方法［12-13］，對分離培養(yǎng)和生化鑒定后的菌株進(jìn)行“O”血清型鑒定。

2　結(jié)果及分析

2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)及生化鑒定從101團(tuán)、103團(tuán)、新湖農(nóng)場、芳草湖農(nóng)場等7地區(qū)采集疑似初生仔豬腹瀉、斷奶仔豬腹瀉的病死仔豬病料361份，將病料接種于營養(yǎng)肉湯中，經(jīng)37℃，18～24 h培養(yǎng)，在營養(yǎng)肉湯中呈均勻一致的混濁，361份樣品均使?fàn)I養(yǎng)肉湯變渾濁；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌大多數(shù)呈表面光滑濕潤，邊緣整齊，稍凸起，紅色或磚紅色菌落；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌大多數(shù)呈黑褐色，帶有金屬光澤的菌落。經(jīng)伊紅美藍(lán)和麥康凱培養(yǎng)基純培養(yǎng)后獲得疑似大腸桿菌335株。經(jīng)葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、吲哚、M.R.、V-P試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用等10項(xiàng)生化試驗(yàn)鑒定，335株均能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖產(chǎn)酸，均不產(chǎn)生H2S，符合大腸桿菌的生化特性。

2.2血清型鑒定及分布情況分析

2.2.1大腸桿菌0抗原血清型鑒定結(jié)果335株仔豬源大腸桿菌血清型鑒定結(jié)果見表1，可以看出，335株仔豬源大腸桿菌鑒定出血清型的有258株，占鑒定菌株的76.8%（258/355），72株未能定型，占鑒定菌株的21.4%（72/355），自凝6株，占鑒定菌株的1.8%（6/355）。

2.2.2第六師五家渠市不同地區(qū)大腸桿菌O抗原血清型的分布從表2可以看出，各個(gè)地區(qū)仔豬源大腸桿菌“O”抗原血清型的種類較多，但基本都有主要的優(yōu)勢血清型，如101團(tuán)、103團(tuán)、新湖農(nóng)場、芳草湖農(nóng)場等7個(gè)地區(qū)的優(yōu)勢血清型有的相同，有的不相同。相同來源的菌株有相同血清型分布，也有不同血清型分布，而不同來源的菌株也有部分具有相同血清型。

表2　不同地區(qū)大腸桿菌O抗原血清型的分布

3　討論

3.1從第六師、五家渠市7個(gè)地區(qū)的規(guī)模豬場或?qū)I(yè)養(yǎng)殖戶采集的361份病料，分離仔豬源大腸桿菌335株，有258株鑒定為“O”血清型，共包括17種血清型。這與許多人對不同地區(qū)仔豬源大腸桿菌存在多種血清型的報(bào)道一致［5-10］。在本次調(diào)查中，流行的主要血清型為O14（35株）、O65（31株）、O157（28株）、O24（26株）O138（20株）、O44（19株）、O78（18株）、O9（17株），共194株，占定型菌株的75.1%。同時(shí)這些血清型來源的地區(qū)也較多，證實(shí)O14、O65、O157、O24、O138為優(yōu)勢血清型，代表了目前第六師五家渠市仔豬源大腸桿菌流行的主要血清型。

3.2仔豬源大腸桿菌的血清型復(fù)雜，地區(qū)分布廣泛，而且差異較大。對335株第六師五家渠市仔豬源大腸桿菌進(jìn)行O血清型定型，定型258株，未能定型72株。定型菌株包括了17種血清型，分別為O8、O9、O20、O65、O101、O138、O14、O24、O78、O147、O4、O157、O35、O44、O27、O18、O6，占分 離菌 株的77.01%。各地區(qū)血清型分布差異大，且都有幾種血清型存在，101團(tuán)以O(shè)14為優(yōu)勢血清型，占101團(tuán)分離菌株的11.8%，占101團(tuán)定型菌株16.9%；103團(tuán)以O(shè)24為優(yōu)勢血清型，占103團(tuán)分離菌株的22.2%，占103團(tuán)定型菌株的26.7%；新湖農(nóng)場和芳草湖農(nóng)場以O(shè)65為優(yōu)勢血清型，占兩地分離菌株的15.6%，占兩地定型菌株的19.2%；共青團(tuán)農(nóng)場以O(shè)138為優(yōu)勢血清型，占共青團(tuán)農(nóng)場分離菌株的16.7%，占101團(tuán)定型菌株的18.1%；奇臺農(nóng)場和五家渠市以O(shè)157為優(yōu)勢血清型，占兩地分離菌株的15.1%，占兩地定型菌株的19.1%。有關(guān)仔豬源大腸桿菌血清型鑒定國內(nèi)外報(bào)道較多，各地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型所占的比例相差比較大，該病的防治帶來困難，該病預(yù)防時(shí)，所用疫苗的血清型一定要與當(dāng)?shù)亓餍芯晗辔呛?，否則只能導(dǎo)致免疫效果不良或失敗，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

3.3本試驗(yàn)所調(diào)查的仔豬腹瀉大腸桿菌共有17種O抗原血清型，其中5種為優(yōu)勢血清型。不僅第六師、五家渠市流行的血清型與其他省市有較大差別，而且第六師、五家渠市不同地區(qū)豬場間亦有不同，同一地區(qū)豬場可存在多個(gè)血清型，不同地區(qū)可流行同一種優(yōu)勢血清型。由此可見，第六師、五家渠市仔豬腹瀉大腸桿菌血清型十分復(fù)雜，這與豬場不斷從外地引進(jìn)種豬更新豬群，以及這些菌株的變異性和更迭性等有密切關(guān)系。而且，各豬場不同時(shí)期流行的血清型也不盡相同。因此，必須定期對豬場的大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定或藥敏試驗(yàn)，選用針對性較強(qiáng)的菌苗或敏感藥物，才能收到較好的防治效果。

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S852.61+2

B

0529-6005（2016）09-0043-03

2015-06-16

2013年新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)六師五家渠市科技計(jì)劃和重大科技專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（1317號）

馬長賓（1982-），男，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物疾病的防控工作，E-mai：cbinma@163.com