CRISPR/Cas9及其衍生編輯器在衰老研究中的應用進展

龔仕濤，王宇，陳宇庭

（中國科學院深圳先進技術研究院，合成生物學研究所，基因組工程與治療研究中心，廣東 深圳 518055）

衰老及其相關疾病是威脅人類健康的重要因素之一。如何減緩衰老和減少衰老引發(fā)的疾病，使身體保持長時間的健康態(tài)，成為大家密切關注的問題。通過生活方式的干預，包括增加鍛煉、減少高熱量食物的攝入，可以幫助個體保持健康。此外，腸道微生物群的改變、衰老細胞的清除、從年輕個體獲得血液因子和使用抗衰老的藥物也可以改善個體的健康狀況［1］。全面了解衰老過程和限制壽命因素一直是生物學家面臨的重要挑戰(zhàn)。過去30 年，研究人員對衰老途徑的研究，已經(jīng)從了解衰老表型過渡到研究衰老表型的遺傳因素。衰老遺傳學的研究揭示了一個復雜的細胞內(nèi)信號網(wǎng)絡和相互作用的過程，顯示與衰老相關的基因在其中扮演重要角色［2］?；蛲蛔兊姆e累往往與衰老相關，基因編輯工具可以實現(xiàn)基因突變位點的精確修復，具備從根本上逆轉(zhuǎn)由基因突變導致的衰老表型的潛力。目前已經(jīng)有很多綜述介紹了CRISPR/Cas 系統(tǒng)及其應用，如核酸檢測、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀修飾、RNA 編輯等［3-6］。本綜述主要介紹利用最廣泛的第2 類系統(tǒng)中的CRISPR/Cas9 及其變體和Cas蛋白衍生編輯器，并討論這些基因編輯工具在衰老及其衰老相關疾病研究中的應用進展。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)

在自然界，CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種細菌和古細菌中的適應性免疫機制，能夠利用RNA指導Cas蛋白核酸酶結(jié)合并切割外源核酸［7-8］。這種適應性免疫過程包括3個主要階段：適應、表達和干擾。在適應階段，Cas蛋白復合物識別出一個獨特的前間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM），并結(jié)合到靶序列，切割靶序列的一部分，并在CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）陣列的5′末端進行復制，復合體將靶序列片段插入CRISPR 間隔重復序列中，使其成為新的間隔區(qū)序列［9-10］。但一些CRISPR/Cas 系統(tǒng)也采用另一種適應機制，通過由基因座編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄，從RNA中獲得間隔區(qū)。在表達階段，CRISPR 陣列通常先被轉(zhuǎn)錄為CRISPR RNA 前體，然后再被加工為成熟的CRISPR RNA（crRNA），且每個crRNA 都包含間隔序列和部分側(cè)翼重復序列［11］。然而，不同的CRISPR 系統(tǒng)，crRNA 前體的加工也是不同的，分別是由多蛋白Cas 復合物的不同亞單位、單體多結(jié)構(gòu)域Cas 蛋白或非宿主RNA 酶介導。在干擾階段，crRNA 與Cas 蛋白結(jié)合形成的復合物，可以通過crRNA 識別病毒或入侵質(zhì)粒的核酸序列，然后具有核酸酶活性的Cas蛋白可以切割和失活靶序列［12-13］。根據(jù)這種靶向識別切割機制，研究人員重編程設計gRNA（guide RNA）中間隔序列，可廣泛地靶向DNA 或RNA 序列［14-17］。

天然存在的CRISPR/Cas 免疫系統(tǒng)分為兩大類型：第1類型是具有核酸酶切的活性多亞基效應復合物；第2 類型是具有核酸酶切活性的單體蛋白［18-19］。由于單體蛋白的優(yōu)勢，第2 類型系統(tǒng)是生物研究和轉(zhuǎn)化應用最廣泛的CRISPR/Cas系統(tǒng)。第2類型可以細分為三亞型：Ⅱ、Ⅴ與Ⅵ，每一類亞型都有一種不同的Cas 蛋白［18，20-21］。在第2 類型系統(tǒng)的Cas 蛋白中，常用的是Ⅱ型Cas9 變體和Ⅴ型Cas12 變體，具有RNA 引導的DNA 內(nèi)切酶活性，而Ⅵ型Cas13變體具有靶向和切割RNA的活性［22］。

2 Cas9蛋白及其變體

Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)的Cas9蛋白是通過RNA引導的核酸內(nèi)切酶，可以在DNA靶向序列中產(chǎn)生雙鏈斷裂［16］。在自然條件下，Cas9需要crRNA和反式激活的crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）共同引導，才能識別外源DNA并進行切割［11］。然而，大多數(shù)Cas9 介導的基因組編輯是使用單一向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA），即將crRNA和tracrRNA 融合成單個RNA 分子［23］。靶位點識別開始于sgRNA和Cas9蛋白形成復合物，并與PAM 同源序列結(jié)合，隨后雙鏈DNA 解鏈，并在gRNA 和靶DNA 序列之間形成RNA-DNA 異源雙鏈［16］。當非靶向DNA 鏈被gRNA 取代時，形成了單鏈DNA“R 環(huán)”，使其暴露并被其他分子接近［24］。在R 環(huán)形成后，Cas9 構(gòu)象發(fā)生變化，其核酸酶結(jié)構(gòu)域被活化［25-26］。最后，DNA 的磷酸二酯骨架被Cas9 的兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域水解：HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域負責切割sgRNA 結(jié)合的靶DNA 鏈；RuvC 樣核酸酶結(jié)構(gòu)域負責切割含PAM的非靶向DNA鏈（圖1）。

圖1 CRISPR/Cas9作用Fig.1 Schematic diagram for CRISPR/Cas9

精確編輯是基因編輯技術得以廣泛應用的重要前提，在一定程度上依賴于sgRNA/Cas核糖核蛋白從全基因組范圍中區(qū)分靶向序列與相似的非靶向序列的能力［27］。為了提高Cas9 蛋白的靶向特異性，研究人員設計和優(yōu)化了一些Cas9變體，具有較低的非靶向編輯活性（表1）。篩選得到的K848A、K1003A和R1060A突變組合eSpCas9（1.1）在人類細胞中展示出高效精確的基因組編輯［43］。SpCas9-HF1是通過降低Cas9-sgRNA復合物和目標DNA之間的結(jié)合親和力，來減少其脫靶效率［44］。HypaCas9（N692A、M694A、Q695A和H698A）是一種利用復合物構(gòu)象變化機制設計的SpCas9變體，展現(xiàn)出高的靶向切割活性與降低脫靶比例［45］。研究人員利用酵母正負向篩選得到evoCas9［46］，表現(xiàn)出高保真性。利用類似策略，研究人員在大腸桿菌篩選得到Sniper-Cas9，使用縮短的sgRNAs 或正常sgRNAs均可展現(xiàn)與野生型相似水平的靶向編輯活性［47］。此外，CRISPR/Cas 系統(tǒng)以RNP 復合物的形式來靶向基因組，通常會降低脫靶水平［48］。最近，SpCas9的一種單點突變體HiFiCas9（R691A），通過RNP遞送時顯示出更低的非靶向編輯［49］。截短的sgRNAs 可以將非靶向編輯效率降低多達3 個數(shù)量級，同時保持高水平的靶向編輯［50］。

表1 Cas9變體及所識別的PAM序列Tab.1 Cas9 variants and identified PAM sequences

擴大CRISPR/Cas 的基因組靶向范圍一直是技術發(fā)展的焦點。Cas蛋白結(jié)合靶序列，需要PAM序列的存在［7，30，46，51］。研究人員發(fā)現(xiàn)了許多Cas9 直系同源物，能夠識別不同的PAM序列［52-53］，可實現(xiàn)大部分基因組序列的靶向編輯。利用合理的蛋白結(jié)構(gòu)設計和定向進化，研究人員獲得SpCas9-EQR、SpCas9-VQR 和SpCas9-VRER 等SpCas9 變體，可分別 識 別NGAG、NGA 和NGCG PAM 序 列［29］。通過噬菌體連續(xù)進化（PACE）和細菌的選擇，將噬菌體復制與PAM 相容性聯(lián)系起來，研究人員發(fā)現(xiàn)了xCas9-3.7 等變體，在非NGG PAM 序列（特別是NGT 和NGA PAM） 上顯示出比野生型SpCas9 更高的活性，且降低了其在哺乳動物細胞中的脫靶效率［30］。通過結(jié)構(gòu)導向的設計，科學家們發(fā)現(xiàn)了SpCas9-NG，可以識別所有NG PAM 序列，表現(xiàn)出不同的編輯效率，但在多數(shù)情況下比xCas9-3.7 具有更高的效率［53］。最近，David Liu 實驗室利用噬菌體的連續(xù)和非連續(xù)進化產(chǎn)生了3種新的SpCas9 變體，SpCas9-NRRH、SpCas9-NRCH 和SpCas9-NRTH，其活性高于xCas9-3.7，可共同識別靶向幾乎任何天然序列［41］。研究人員使用結(jié)構(gòu)引導的方法開發(fā)了SpG 和SpRY 變體，分別識別NGN 和NRN/NYN（Y 是C 或T）PAMs，其 中NRN比NYN的識別效率更高［40］。此外，一種嵌合Cas9 蛋白的Spy-mac Cas9 能夠識別NAA PAM 序列［54］和高活性ScCas9 變體可識別NNG PAM 序列［55］。通過對PAM 相互作用結(jié)構(gòu)域的突變和細菌選擇，研究人員開發(fā)了SaCas9-KKH 變體［56］，可以識別NNNRRT PAM 序列，與野生型SaCas9 相比，其靶向范圍擴大了4 倍。具有高特異性的FnCas9，通過合理的方法設計，可以識別YG PAMs，而不是其原來的NGG PAM［57］。這些Cas9變體的發(fā)明，極大擴展了CRISPR/Cas 系統(tǒng)的基因組靶向能力，增強了其應用能力。

3 基于Cas9的衍生編輯器

研究人員基于Cas蛋白研發(fā)了多種精確的基因編輯器，如堿基編器、引導編輯器、轉(zhuǎn)座/重組酶等［58-63］（圖2）。CRISPR/Cas 及其衍生的編輯器，可以實現(xiàn)多種形式精確的基因編輯，滿足人們對不同的基因改造的需求。

圖2 CRISPR/Cas衍生編輯器的作用Fig.2 Schematic diagram for CRISPR/Cas-derived editors

3.1 堿基編輯器

由任何一個核酸酶結(jié)構(gòu)域突變失活產(chǎn)生的nCas9 切口酶，和兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域均失活產(chǎn)生的dCas9，仍可以與sgRNA 一起結(jié)合到特定的DNA序列［64］。研究人員通過將nCas9 與堿基脫氨酶融合，發(fā)明了堿基編輯器。該堿基編輯器可以精確實現(xiàn)基因組目標堿基的替換，而不需要DSB 或供體DNA模板，也不依賴HDR。

目前，主要有兩類堿基編輯器：胞嘧啶堿基編輯器（CBEs）［65］，催化C→T/G→A 堿基對的轉(zhuǎn)換；腺嘌呤堿基編輯器（ABEs）［66］，催化A→G/T→C 轉(zhuǎn)換。CBEs 和ABEs 可以實現(xiàn)4 種堿基突變（C→T/G→A、A→G/T→C），約占目前人類致病突變的30%［67］。在CBEs 和ABEs 中，sgRNA 指導nCas9可將ssDNA 脫氨酶定位于基因組靶序列。在Cas 蛋白結(jié)合時，gRNA 與靶序列雜交引發(fā)位移，形成ssDNA R環(huán)［16］。PAM-遠端核苷酸以ssDNA形式暴露，可被脫氨酶結(jié)構(gòu)域催化［68］。胞嘧啶脫氨酶可將R環(huán)內(nèi)的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，尿嘧啶被DNA聚合酶識別為胸腺嘧啶，然后在DNA 的修復過程中將C·G轉(zhuǎn)換為T·A［65］。類似地，ABE是通過蛋白進化得到的TadA 腺苷脫氨酶將R 環(huán)內(nèi)的腺苷轉(zhuǎn)化為肌苷，后者被DNA聚合酶識別為鳥嘌呤，將A·T轉(zhuǎn)換為G·C［69］。R 環(huán)內(nèi)目標核苷酸的堿基編輯依賴于脫氨酶和底物核苷酸之間的有效相互作用，且R環(huán)內(nèi)高效堿基編輯的核苷酸位置被定義為堿基編輯“活性窗口”。SpCas9 衍生的CBEs 和ABEs 的活性窗口通常是前體間隔序列的4～8位置，但也受染色體結(jié)構(gòu)、不同位置或細胞類型的影響［65-66］。研究人員通過融合表達兩個尿嘧啶糖基化酶抑制劑蛋白（UGIs）、使用nCas9 替換dCas9、優(yōu)化融合蛋白之間的連接序列、優(yōu)化密碼子和核定位序列，得到了CBEmax和ABEmax 的變體，顯著提高了堿基編輯器在哺乳動物細胞和體內(nèi)的編輯效率［70］。隨后，科研人員通過對堿基編輯器進行進一步優(yōu)化與改造，提高了它們在基因組的靶向范圍、擴大編輯活性的窗口以及減少脫靶和編輯副產(chǎn)物［59，61］。

近期，研究人員通過胞嘧啶脫氨酶的突變優(yōu)化篩選，研發(fā)出CGBE，可以催化C→G/G→C 的堿基轉(zhuǎn)換［71］。研究人員還通過將胞嘧啶脫氨酶和腺苷脫氨酶同時與催化缺陷的nCas9融合，得到可以同時實現(xiàn)C→T/G→A 和A→G/T→C 替換的編輯編輯器［72-73］。

3.2 引導編輯器

哺乳動物基因組中與疾病相關的突變存在多種形式，需要通過基因編輯工具進行糾正，更需要精確引入堿基的編寫，例如堿基替換，小片段的插入和缺失。通過核酸酶產(chǎn)生DNA 雙鏈斷裂后，雖可通過NHEJ 引入插入和缺失，或者通過HDR 精確改變，但往往會伴隨各種錯誤的編輯。堿基編輯器可以實現(xiàn)C→T/G→A、A→G/T→C 的編輯，但是其他形式的堿基替換還無法實現(xiàn)［74］。此外，當在編輯活性窗口存在多個編輯活性位點時，也會存在一定的脫靶效應，且會受到PAM 的限制。引導編輯器可以實現(xiàn)12 種點突變的轉(zhuǎn)換和小片段的插入與缺失。引導編輯器是nCas9和結(jié)構(gòu)優(yōu)化的逆轉(zhuǎn)錄酶融合形成的功能蛋白，通過pegRNA（prime editing guide RNA）可以靶向編輯目標序列。當結(jié)合到靶向序列后，Cas9 RuvC 核酸酶會在含PAM 的DNA 鏈形成缺口。逆轉(zhuǎn)錄酶以pegRNA 作為模板合成所需編輯的序列，DNA 在修復的過程中將編輯序列留存在基因組中，實現(xiàn)靶位點的編輯［74］。引導編輯已經(jīng)被應用在多種人類細胞系和小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元［74］、人誘導多能干細胞［75］和T 細胞［76］、小鼠胚胎［77］和斑馬魚胚胎［76］等。目前引導編輯器的編輯效率還不高，且會產(chǎn)生較高水平非靶向編輯的副產(chǎn)物，但通過pegRNA的設計和逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)的改進有望改善上述問題［78］。

3.3 dCas9融合的轉(zhuǎn)座酶/重組酶

在活細胞中實現(xiàn)大片段靶向整合，一直是基因組編輯領域的難點。通過Cas蛋白與轉(zhuǎn)座酶形成的融合蛋白，可以將外源基因整合到基因組中。研究人員通過dCas9 和Himar1 轉(zhuǎn)座酶的融合，使用靶向的sgRNA，可以實現(xiàn)在大腸桿菌胞內(nèi)質(zhì)粒上介導靶向DNA 序列整合［79］。此外，研究人員還報道了CRISPR 相關轉(zhuǎn)座子酶（CRISPR-associated transposase，CAST），可以在E.coli實現(xiàn)轉(zhuǎn)座子酶活性［80］。Cas融合重組酶可以插入、刪除、倒置或替換目標DNA。Ginβ 重組酶和dCas9 的融合，通過兩個相鄰的gRNA，形成必需的二聚體，可進行靶向重組。這種編輯系統(tǒng)可以在哺乳動物細胞中修飾質(zhì)粒底物，也能實現(xiàn)低效率的大片段基因組的刪除，但對目標序列有大量限制［81］。因此，進一步研發(fā)識別基因組的靶向轉(zhuǎn)座子，改造CRISPR和重組酶，可實現(xiàn)在基因組中精確重排大片段的DNA序列［32，82-84］。

4 CRISPR/Cas 系統(tǒng)工具在衰老研究中的應用

衰老的特點是隨著時間的推移，維持機體平衡的能力下降，增加許多慢性疾病和退行性疾病的患病風險，最終導致個體死亡［85］。衰老受多種基因和表觀遺傳因素的影響，增加了研究衰老表型及相關疾病的難度［86］。為了解影響細胞衰老的遺傳和表觀遺傳學因素，研究人員在Werner 綜合征（Werner syndrome，WS）病人來源的人間充質(zhì)前體細胞（human mesenchymal progenitor cells，hMPCs）中，進行了全基因組靶向基因失活篩選。通過篩選，研究人員發(fā)現(xiàn)一些基因的缺失可減輕細胞衰老，如KAT7 的失活可在兩種早衰hMPC 模型中減輕衰老表型。接著，通過靜脈注射編碼Cas9/sgRNA-Kat7 的慢病毒載體，可以延長生理衰老小鼠和早衰小鼠的壽命?；贑as9 篩選是一種系統(tǒng)性發(fā)現(xiàn)與衰老相關基因的方法，這些衰老基因也可能被發(fā)展為抗衰老的治療靶點［87］。此外，CRISPR/Cas 系統(tǒng)及其衍生編輯器可以在多種傳統(tǒng)衰老模型中操控和調(diào)節(jié)基因功能，將揭示基因在端粒損傷、表觀遺傳失調(diào)和細胞衰老的作用，也將大大加速新的動物和細胞衰老模型的建立，用于研究衰老疾病的病理及研發(fā)抗衰老的治療策略。

4.1 早衰綜合征

早衰綜合征（Hutchinson-Gilford progeria syndrome，HGPS）是由于LMNA基因（編碼核結(jié)構(gòu)蛋白lamin A）在11 號外顯子產(chǎn)生了同義突變（c.1824C>T；p.Gly608Gly），導致RNA 錯誤剪接，從而產(chǎn)生早衰蛋白（progerin）［88］。早衰蛋白是一種誘導早衰癥兒童快速衰老，并將其壽命縮短至大約14 歲的有毒蛋白質(zhì)，因此，通過CRISPR/Cas系統(tǒng)來降低progerin 蛋白的表達量，可能是一種有效的治療手段。研究人員用慢病毒CRISPR/Cas 系統(tǒng)，可以降低小鼠和人早老癥成纖維細胞中progerin的蛋白量并恢復了異常的核型。在新出生3 天HGPS 小鼠模型的腹腔內(nèi)注射了AAV-CRISPR 病毒，能有效降低小鼠體內(nèi)progerin 的蛋白量，顯著改善小鼠的健康狀況［89］。在另一項研究中，研究人員把AAV9-gRNAs 通過面部靜脈給藥的方式注射入HGPS-Cas9 小鼠模型體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)小鼠的皮膚、心血管系統(tǒng)和肌肉抓力等指標顯著變好，整體健康狀態(tài)得到改善，并顯著延長了小鼠的壽命［90-91］。最近，研究人員使用ABE 直接糾正來自早衰癥兒童的成纖維細胞和HGPS 小鼠模型的致病性HGPS突變。慢病毒將ABE 傳遞給HGPS 患者的成纖維細胞，可以實現(xiàn)87%～91%的致病性等位基因的糾正、RNA 錯誤剪接的緩解、progerin蛋白水平的降低和細胞核異常的改善。在人類LMNAc.1824純合的轉(zhuǎn)基因小鼠中，通過單次眼球注射編碼ABE 靶向?qū)>T 等位基因的腺相關病毒（AAV9），可顯著、持久地糾正致病性突變（注射6個月后各器官約20%～60%糾正效率），恢復正常RNA 剪接，并降低progerin蛋白水平。在出生后第14天，單次注射表達ABE 的AAV9 可以提高小鼠的活力，并大大延長小鼠的中位壽命（從215 天延長到510 天）。這些研究表明，體內(nèi)堿基編輯技術可直接糾正導致HGPS和其他遺傳疾病的點突變，可能成為一種治療HGPS和其他遺傳疾病的治療方法［91］。

4.2 心血管疾病

在心臟疾病治療中，具備靶向編輯心肌細胞的能力非常重要，因為心臟不具有典型的干細胞群。CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以在非分裂的細胞內(nèi)進行基因組編輯。研究人員開發(fā)了一個在心肌細胞中特異性表達Cas9 的小鼠模型，通過向小鼠注射攜帶靶向特異基因的sgRNAs的AAV病毒，可以實現(xiàn)靶向心肌細胞內(nèi)的任何基因［92］，可用于糾正心肌細胞中存在的致病性突變［93］。

4.3 年齡相關性黃斑變性

年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration AMD）是老年人失明的主要原因，但目前對濕型AMD 的治療依賴于頻繁的眼部藥物注射，費用昂貴，對患者來說經(jīng)濟負擔較重。CRISPR/Cas可以永久改變導致濕性AMD的基因突變，成為一種治療濕性AMD 的潛在療法。目前抗血管內(nèi)皮生長因子（anti-VEGF）藥物是治療濕性AMD 的重要選擇。研究人員將靶向vegf基因的Cas9核糖核蛋白（RNA-binding protein，RNPs）注射到成年小鼠眼睛，實現(xiàn)了在視網(wǎng)膜色素上皮細胞的靶基因進行編輯，阻止了新生血管形成。Cas9 RNPs有效減少AMD小鼠模型中激光誘導的脈絡膜新生血管（choroid neovascularization，CNV）的面積，改善模型小鼠的視力［94］。

4.4 神經(jīng)退行性疾病

近年來，CRISPR/Cas編輯工具在研究肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）、帕金森?。≒arkinson's disease，PD）等年齡相關神經(jīng)退行性疾病的分子發(fā)病機制方面也做出了重要貢獻。

肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（ALS）是一種致死性疾病，由超氧化物歧化酶1（SOD1）基因突變引起。ALS 目前是不可治愈的，但CRISPR 堿基編輯器具有產(chǎn)生無義突變的能力，有可能成為治療這種疾病的方法。無義突變可以使SOD1基因表達永久失效。研究人員將編碼CBE 堿基編輯器的DNA 拆分并裝到兩個AAV 載體上，然后將兩種AAV 病毒注射到遺傳性ALS 小鼠模型體內(nèi)，沉默了致病基因的表達，改善了小鼠的病理癥狀，并延長小鼠的壽命［95］。

阿爾茨海默?。ˋD）是一種主要的神經(jīng)退行性疾病，其特征是腦中淀粉樣蛋白斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成。這些異常蛋白的聚集會導致進行性神經(jīng)元喪失、造成嚴重的認知障礙和癡呆，最終導致患者過早死亡。研究人員利用CRISPR/Cas9，在人類iPSC 細胞系中高效建立了淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APPSwe）和早老蛋白1（presenilin proteins，PSEN1M146V）基因的純合子和雜合子突變，并誘導分化形成神經(jīng)元，且這些細胞表現(xiàn)出基因型依賴的疾病相關表型。在另一項研究中，研究人員將攜帶早老蛋白2（PSEN2）突變的患者來源的人類誘導多能干細胞轉(zhuǎn)化為基底前腦膽堿能神經(jīng)元，然后對其進行靶向編輯，糾正突變，可以減少Aβ 的產(chǎn)生，恢復神經(jīng)元正常的電生理功能［96］。通過AAV 或納米復合物將CRISPR 編輯系統(tǒng)遞送到活體小鼠體內(nèi)，糾正了神經(jīng)元中的突變［97］。此外，利用CRISPR 靶向APP基因的特定區(qū)域，可在人類iPSC 來源的神經(jīng)元以及成年小鼠大腦齒狀回減少Aβ的產(chǎn)生［98］。

帕金森病（PD）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，僅次于阿爾茨海默病。在世界范圍內(nèi)，估計約有1000萬人患有PD 病，且確診時患者的平均年齡為60 歲，因此帕金森病主要是一種與年齡相關的疾病。CRISPR/Cas9也被用于開發(fā)新的PD模型，通過產(chǎn)生攜帶多個PD 相關基因突變的小型豬，如Parkin、DJ-1 和PINK1［99］。富 亮 氨 酸 重 復 激 酶2（LRRK2）G2019S 是一種相對常見的突變，與全球1%～3%的帕金森?。≒D）病例相關。研究人員成功地使用CRISPR/Cas9 介導的同源重組，將LRRK2 G2019S 突變和LRRK2 激酶結(jié)構(gòu)域的截斷突變引入狨猴胚胎和誘導的多能干細胞中，建立一種新的PD普通狨猴模型［100］。

5 結(jié)語

CRISPR/Cas 系統(tǒng)及其衍生編輯器的發(fā)明與優(yōu)化，改變了生命科學研究的方法和方式，在生命醫(yī)學基礎研究上取得了許多突破性的進展，并為新一代人類疾病療法的研發(fā)奠定了良好的基礎。精確且多功能的基因組編輯工具的發(fā)明，使我們能夠?qū)θ魏位罴毎幕蚪M進行序列改變，且減少或者不產(chǎn)生編輯副產(chǎn)物?；蚪M編輯技術的快速發(fā)展將我們帶入了一個新時代，我們不僅可以編輯及修復人類基因組中的致病突變，也可以編輯那些影響人類生命健康的其他生物體的基因組。這些編輯工具不僅可以用于研究候選基因在基因組中的功能，也可以用于建立有效的疾病動物模型，同時也成為基因治療的有效工具。但是，CRISPR/Cas 系統(tǒng)及其衍生編輯器仍然存在靶向編輯效率較低的問題，且有脫靶風險，同時也需要更加安全有效的遞送工具。

隨著全球人口老齡化越來越嚴重，衰老及其相關疾病將會越來越受關注。引起衰老的原因很多，其中體內(nèi)細胞基因組突變的積累是其中一個重要原因，基因突變的增加和細胞修復能力的減弱，直接影響細胞正常功能的維持。越來越多精確高效基因編輯工具的發(fā)現(xiàn)與廣泛使用，不僅可以使我們更加充分地理解衰老基因組與表型組之間的關系，也可以通過編輯或編寫基因組，達到抵抗衰老和治療衰老相關疾病的目的。目前基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)及其衍生編輯器的治療技術尚未獲得FDA 的臨床批準。如果能夠?qū)崿F(xiàn)臨床應用，這些編輯器將會極大地改善人類衰老相關疾病的病理癥狀、減少疾病負擔、降低死亡率，最終實現(xiàn)健康衰老。