微生物細胞工廠合成五環(huán)三萜皂苷類化合物

任師超，孫秋艷，馮旭東，李春，2，3

（1 北京理工大學化學與化工學院化學工程系，生物化工研究所，醫(yī)藥分子科學與制劑工程工業(yè)和信息化部重點實驗室，北京100081；2 清華大學化學工程系，工業(yè)生物催化教育部重點實驗室，北京 100084；3 清華大學，合成與系統(tǒng)生物學研究中心，北京 100084）

三萜類化合物是一類由六個異戊二烯單元構成的含有30 個碳原子的烴類含氧衍生物［1］，其中五環(huán)三萜是指具有五環(huán)結構骨架的三萜類化合物。代表化合物包括甘草中的主要活性物質甘草酸（glycyrrhizic acid，GL）、白樺樹皮中的樺木酸（betulinic acid，BA），以及存在于多種植物中的山楂酸（maslinic acid，MA）、熊果酸（ursolic acid，UA）、齊墩果酸（oleanolic acid，OA）等。三萜皂苷是由疏水性三萜苷元和一個或多個親水性糖基組成的糖苷化合物［2］，根據其皂苷元結構的不同，分為齊墩果烷型（oleanane type）、烏索烷型（ursane type）、羽扇烷型（lupane type）、木栓烷型（friedelane type）等。從天然合成途徑來看，五環(huán)三萜皂苷類化合物，先是由氧化鯊烯經過氧化鯊烯環(huán)化酶（squalene oxide cyclase，OSC）催化形成不同的五環(huán)三萜化合物骨架（包括β-香樹脂醇、α-香樹脂醇、羽扇醇、日耳曼醇等），這些五環(huán)三萜化合物骨架經過P450 氧化酶及其還原酶在不同的位點進行多種形式的氧化，再經過糖基轉移酶的修飾，最終可得到結構及功能各異的五環(huán)三萜皂苷類化合物。由于大多五環(huán)三萜骨架具有較強疏水性，不利于其在植物當中儲存、運輸，所以植物中五環(huán)三萜化合物多以皂苷的形式存在。多樣化的糖基化修飾對五環(huán)三萜類化合物的理化性質具有較大的影響。例如，糖基化會提高化合物的水溶性，有利于五環(huán)三萜類化合物在植物當中的合成、儲存、運輸等，同時，糖基化可以調整化合物的脂水分配系數，進而提高生物利用度；另外，多種糖基化修飾配合體內不同的糖苷水解酶也使得五環(huán)三萜類化合物的生理、藥理活性更加豐富。

五環(huán)三萜皂苷類化合物因其結構多樣且具有多種藥理、生理活性而被廣泛應用于食品、化妝品、醫(yī)藥、保健品等領域。例如，甘草酸因其在保肝護肝方面的顯著作用，用于多種肝病藥物的研發(fā)；大豆皂苷具有抗腫瘤、降低膽固醇等保健作用，應用也很廣泛［3-4］。一些三萜皂苷還是重要的天然甜味劑和乳化劑，具有重要的應用價值，如單葡萄糖醛酸基甘草次酸（glycyrrhetinic acid monoglucuronide，GAMG），其甜度是蔗糖的941 倍［5］，在食品添加劑行業(yè)的應用前景廣闊。目前五環(huán)三萜皂苷類化合物的主要獲取方式為植物提取。該方法具有很多局限性，包括：①化合物在植物當中的含量非常低，而野生資源有限，盲目對野生資源進行采挖會造成生態(tài)環(huán)境的破壞，不符合可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略要求；②所以對相應植物進行人工種植成為化合物提取來源的重要補充，而許多植物具有很強的道地性，且需要多年的生長，不適合人工種植，且人工種植會大量占用耕地，同時并不能保證化合物的含量達到相關要求；③植物提取過程中需要復雜的分離純化工藝，要用到大量的酸堿試劑或者有機試劑以保證提取率和純度，而隨著我國環(huán)保政策的推行，這些工業(yè)廢液的排放難以符合環(huán)境友好可持續(xù)發(fā)展的要求，成了目前工業(yè)生產的一大難題；④很多糖基化修飾豐富的化合物穩(wěn)定性較差，提取過程中pH 的大范圍改變、性質活潑的有機試劑的使用可能會造成糖基的破壞，很難提取到目標化合物。對于有些植物含量低的化合物還可能通過化學全合成或者半合成的方式來獲取，但由于五環(huán)三萜皂苷類化合物的修飾類型較為復雜，包括羥基、羧基、羰基以及糖基化修飾等，很難從頭合成，存在難度大、收率低、環(huán)境不友好等問題，目前只有半合成的報道，且都停留在實驗室水平，不具備產業(yè)化的能力。相比于植物提取和化學合成，生物合成可以在一定程度上減少有機試劑、酸堿試劑的使用量，且發(fā)酵周期短，無需考慮季節(jié)、環(huán)境氣候等因素，能夠實現可持續(xù)性生產，更有利于推動綠色生物制造，達到國家環(huán)保要求，在推動社會經濟發(fā)展的同時，對于我國的環(huán)境、資源保護都具有重要意義。而通過微生物異源合成天然產物具有周期短、環(huán)境友好、可持續(xù)發(fā)展等優(yōu)勢。近幾年隨著合成生物學的發(fā)展，天然產物的微生物合成取得了重大突破。2013 年，Keasling 課題組［6］利用工程化釀酒酵母成功合成了倍半萜化合物青蒿素的前體青蒿酸，并結合化學法實現了抗瘧疾有效成分青蒿素的半合成。Smolke 課題組［7-8］于2019 年、2020 年分別報道了在釀酒酵母中從頭合成生物堿類化合物托品堿和莨菪堿、東莨菪堿，此工作的亮點為在工程化酵母中整合了來源于酵母、細菌、植物、動物的26個基因，橫跨6個亞細胞定位，最終成功從頭合成了廣泛應用于神經肌肉疾病治療的生物堿類化合物，該工作具有里程碑式意義。五環(huán)三萜皂苷類化合物的微生物合成近幾年也取得了重大的突破，本綜述主要總結了重要五環(huán)三萜皂苷類化合物的結構特點及其在微生物中的合成進展，對部分合成途徑未知的化合物，結合已報道的P450氧化酶、尿苷二磷酸（uridine diphosphate，UDP）-糖基轉移酶，以及微生物底盤宿主的代謝通路，對其合成途徑進行了推測。

1 齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷化合物

齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷化合物，從結構上來看，是以齊墩果烷（oleanane）［又稱β-香樹脂烷（βamyrane）］為結構基礎，進行多種類型結構衍生之后的一類化合物。從天然代謝途徑來看，大多數齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷化合物，是通過2，3-氧化鯊烯經氧化鯊烯環(huán)化酶催化生成β-香樹脂醇后，再進行后續(xù)修飾而生成，其中具有代表性的化合物有齊墩果酸、山楂酸、甘草次酸及其糖苷類衍生物等。

1.1 齊墩果酸類五環(huán)三萜皂苷化合物

以β-香樹脂醇為底物，經過CYP716A 家族P450酶的氧化，可在其28位C原子上進行連續(xù)氧化修飾，依次生成高根二醇、齊墩果醛、齊墩果酸等化合物［9］。以齊墩果酸為基礎繼續(xù)催化，可得到山楂酸、櫟焦油酸（queretaroic acid）、金盞花苷E（calenduloside E）、常春藤皂苷元（hederagenin）等多種齊墩果烷型三萜化合物（圖1）。其中，山楂酸具有抗癌、抗氧化、抗艾滋病、抗菌、抗糖尿病等多種生物活性，其存在于山楂、紅棗、枇杷葉和油橄欖等多種植物中；櫟焦油酸存在于三臺紅花等植物中，具有一定的抗癌活性；常春藤皂苷元主要提取于五加科常春藤屬植物中華常春藤，主要具有抗癌和抗抑郁功效，而在常春藤皂苷元基礎上可進行多種糖基化修飾，生成生理活性豐富多樣的多種常春藤皂苷；金盞花苷E具有抗心律失常、降血壓、降血糖等功效，對治療糖尿病和病態(tài)肥胖有潛在的作用。近年來，利用微生物細胞工廠從頭合成齊墩果酸及其糖苷衍生物取得了較大進展。2013 年，張學禮課題組［10］通過在釀酒酵母中過表達甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）途徑中的鯊烯氧化酶ERG1、角鯊烯合成酶ERG9、甲羥戊酸激酶ERG8，抑制競爭途徑的羊毛甾醇合酶ERG7，同時整合來源于苜蓿的P450酶，來自擬南芥的P450酶還原伴侶（cytochrome P450 reductase，CPR），以及來自于光果甘草的β-香樹脂醇合酶，發(fā)酵7 天最終得到的齊墩果酸產量達到71.0 mg/L。2018 年，盧文玉課題組［11］在釀酒酵母中過表達限速酶羥甲基戊二酸單酰輔酶A tHMG1、法尼基焦磷酸合酶ERG20、外源的白念珠菌的鯊烯環(huán)氧酶ERG1，以增強前體鯊烯的供應，整合來自長春花的香樹脂醇合酶，并進行不同強度啟動子的篩選優(yōu)化，將來自于苜蓿和長春花的P450 酶與來自擬南芥和百脈根的CPR 進行組合搭配篩選，確定苜蓿的P450 酶和擬南芥的CPR 為最優(yōu)搭配，分批補料發(fā)酵所得齊墩果酸的產量為155.58 mg/L，此外該課題組［12］還利用解脂耶氏酵母為宿主，結合P450酶與CPR融合表達的策略，將齊墩果酸的產量提高到540.7 mg/L。2018年，李春課題組［9］在釀酒酵母中過表達MVA 途徑限速酶tHMG1、鯊烯氧化酶ERG1、角鯊烯合成酶ERG9等，偶聯半乳糖代謝調控網絡，使齊墩果酸的產量達到186.1 mg/L，經過發(fā)酵調控優(yōu)化，產量達到了606.9 mg/L，是目前已報道的最高水平。

圖1 齊墩果酸類五環(huán)三萜皂苷化合物（綠色標注為推測途徑）Glc-葡萄糖基；GlcA-葡萄糖醛酸基；Csl-類纖維素合酶Fig.1 Pentacyclic triterpenoid saponins with oleanolic acid(the predicted pathways are highlighted in green)Glc-glucosyl;GlcA-glucuronyl;Csl-cellulose synthase-like enzyme

在齊墩果酸的基礎上，可繼續(xù)經過多種P450酶的修飾生成多種五環(huán)三萜類化合物，其中包括但不限于：

（1）通過CYP716C 家族的P450 酶在其2 號位上進行氧化，實現羥基化修飾，可以得到山楂酸。2018 年，張學禮課題組［13］在山楂中挖掘到一個新的P450 酶CYP716C49，在齊墩果酸的釀酒酵母生產菌株中異源表達該酶，實現了從頭合成山楂酸，最終產量為384 mg/L。

（2）通過CYP72A68 及CYP93E 家族的P450酶可分別對齊墩果酸的23 號位和24 號位進行羧基化和羥基化修飾，生成絲石竹酸及4-epi-常春藤皂苷元。2018 年，張學禮課題組［14］在薔薇科植物蘋果中挖掘到P450 酶MdMA02，在齊墩果酸的釀酒酵母生產菌株中對其進行異源表達，實現了常春藤皂苷元的從頭合成，產量達到了101 mg/L。

（3）通過CYP72A63對齊墩果酸的30號位進行羥基化修飾，得到化合物櫟焦油酸。早在2006年，日本的莫西亞（Mercian）公司的生物資源實驗室就利用來源于直腸小四孢菌的P450 酶P450moxA及其還原酶，通過體外無細胞催化系統(tǒng)，催化齊墩果酸得到了櫟焦油酸，轉化率為17%［15］。

關于齊墩果酸的糖基化修飾方面，通過歐洲山芥的糖基轉移酶UGT73C11 可對其3 號位的羥基以及28 號位的羧基進行葡萄糖基化修飾，可以分別生成3-O-葡萄糖-齊墩果酸和28-O-葡萄糖-齊墩果酸，該類化合物具有抗蟲抗菌的生理活性［16］。2018 年，楊生超課題組［17］利用姜狀三七轉錄組數據，成功鑒定催化齊墩果酸C-3位羥基的葡萄糖醛酸基轉移酶OAGT，利用大腸桿菌對其進行重組表達，可以催化齊墩果酸得到金盞花苷E。

1.2 甘草次酸類五環(huán)三萜皂苷化合物

甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）是甘草酸的苷元化合物，具有突出的抗肝炎病毒B及保肝護肝等活性，是目前市場上肝病治療藥物的主要功能成分。甘草酸是甘草中最主要的活性成分，對肉瘤、癌細胞生長有抑制作用，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、提高免疫力等藥理活性，與此同時，其甜度是蔗糖的170 倍且具有特殊的回甘口感，也是重要的食品添加劑和香料基料。近年來，在醫(yī)藥、化工、食品、日用化工等行業(yè)也得到了廣泛的應用。單葡萄糖醛酸基甘草次酸由于少一個葡萄糖醛酸基，使其極性適中，在保留其生理、藥理活性的同時增加了生物利用度，在醫(yī)藥、食品等領域具有更大的競爭優(yōu)勢，且其甜度達到了蔗糖的941倍，具有巨大的開發(fā)應用前景［18］。

以β-香樹脂醇為結構基礎，通過P450 酶CYP88D6 及其還原酶的催化，可對β-香樹脂醇的11位進行氧化修飾，生成化合物11-O-β-香樹脂醇，具有抗增殖和抗炎活性，可作為合成多種三萜類化合物 的 骨架。 再由P450 酶CYP72A63 或CYP72A154 及還原酶催化，可對其30 位的甲基繼續(xù)進行多步氧化修飾，最終生成甘草次酸（圖2）。近年，日本研究人員通過對烏拉爾甘草轉錄組數據庫進行挖掘，結合EST 序列與RNA-Seq 技術解析了甘草次酸的生物合成途徑，并在釀酒酵母體內實現了甘草次酸的從頭合成，但是其生產水平停留在概念驗證階段，產量僅為20 μg/L，并伴隨有多種副產物的生成［19］。2018 年，李春課題組［20］從苜蓿和甘草中成功獲得特異性更強、活性更高的P450 酶（Uni25647）及其還原酶，并優(yōu)化了甘草次酸的合成途徑，在5 L 發(fā)酵罐中的產量達到18.9 mg/L。在此基礎上，該課題組［21］對P450 酶進行理性設計，對關鍵位點氨基酸進行突變，最終實現甘草次酸及其中間體化合物甘草次醇、甘草次醛的選擇性合成，甘草次酸及甘草次醛的產量分別達到了36.4 mg/L 和31.4 mg/L，并成功合成了稀有萜類化合物29-羥基-11-O-β-香樹脂醇，產量為10.2 mg/L，均是目前已報道的最高水平。

圖2 甘草次酸類五環(huán)三萜皂苷類化合物Glc-葡萄糖基；GlcA-葡萄糖醛酸基Fig.2 Pentacyclic triterpenoid saponins with glycyrrhetinic acidGlc-glucosyl;GlcA-glucuronyl

以甘草次酸為底物，通過一系列的糖基轉移酶可對其3 位羥基或/及30 位羧基進行葡萄糖基化修飾，生成3-O-葡萄糖-甘草次酸、30-O-葡萄糖-甘草次酸及雙葡萄糖基化修飾的甘草次酸。2017年，李春課題組［22］通過大腸桿菌異源表達糖基轉移酶UGT73C11，并在體外對甘草次酸進行催化，成功得到3-O-葡萄糖-甘草次酸，轉化率達到98%。在此基礎上，該課題組［23］從甘草數據庫中鑒定到兩個新的糖基轉移酶UGT73C33 和UGT73F24，成功在體外合成多種甘草次酸糖苷衍生物，包括3-O-葡萄糖-甘草次酸、30-O-葡萄糖-甘草次酸、3，30-O-雙葡萄糖-甘草次酸，并在工程化釀酒酵母中首次合成了3-O-葡萄糖-甘草次酸，產量達到26.31 mg/L。甘草次酸經過糖基轉移酶GuGT14 及UGT73P12 的催化，可先后生成化合物單葡萄糖醛酸基甘草次酸（GAMG）以及甘草酸（GL）。2019 年，葉敏課題組［24］從甘草中鑒定到糖基轉移酶GuGT14，并對其進行體外驗證，成功得到了化合物GAMG。同年，Muranaka 課題組［25］從甘草中鑒定到糖基轉移酶UGT73P12，該酶可催化GAMG 生成GL，并推測其可能是甘草中甘草酸天然合成途徑中的糖基轉移酶。2020 年，有研究者從紫花苜蓿、烏拉爾甘草、百脈根、大豆等植物中發(fā)現了一種類纖維素合酶（cellulose synthase-like enzymes，Csls）具有葡萄糖醛酸基轉移酶活性，并利用瞬時轉染的煙草和工程化釀酒酵母合成了3-O-葡萄糖醛酸-苜蓿酸、GAMG 和金盞花苷E 等化合物［26-27］，并在此基礎上利用釀酒酵母從頭合成GL，產量達到了791 μg/L［27］。

1.3 大豆皂苷類五環(huán)三萜皂苷化合物

大豆皂苷（soybean saponins）也是一類重要的五環(huán)三萜皂苷類化合物，主要存在于豆科植物當中。近年來，國內外大量研究表明：大豆皂苷不僅毒副作用很小，而且還具有許多對人體健康有益的生理功能，例如在保健作用方面，具有增強免疫調節(jié)功能、保護記憶力、作為免疫原性物質、預防骨質疏松、改善肥胖、改善膽固醇和脂肪代謝、改善心肌供氧、提高機體的耐缺氧功能、加強中樞交感神經的活動、抗衰老、防止動脈粥樣硬化、調節(jié)心腦血管系統(tǒng)等作用；在藥理活性方面，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗石棉塵毒性、抗自由基、抗凝血、抗血栓、抗糖尿病等功能［28-33］。

依據皂苷元可將大豆皂苷分為大豆皂苷A 類、B 類、E 類、DDMP（2，3-二氫-2，5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮）等四類（圖3）。以β-香樹脂醇為底物，對其22 位進行羥基化修飾，可生成槐花二醇，此為大豆皂苷的合成前體化合物，且具備一定生理及藥理活性。2010 年有研究報道了齊墩果烯三萜化合物的22 位羥化酶，也是目前報道的唯一具有該功能的酶［34］。而通過另外一個途徑，以β-香樹脂醇為底物，經過CYP93E 家族的P450酶催化，可對β-香樹脂醇的24位進行羥基化修飾，生成化合物24-羥基-β-香樹脂醇，在此基礎上通過P450 酶CYP72A61 的催化，可繼續(xù)在其C-22 上進行羥基化修飾，生成大豆皂醇B，后經糖基轉移酶催化可在C-3羥基上加糖，形成大豆皂苷B 類化合物［35］。2010年，Ebizuka課題組［36］將從大豆轉錄組克隆得到的糖基轉移酶UGT74M1與UGT71G1基因在大腸桿菌中重組表達，與大豆皂苷B單葡萄糖醛酸反應，得到大豆皂苷Ⅲ與Ⅰ。大豆皂醇B可在糖基轉移酶Sg-9（UGT73B4）的催化下在C-22上連接一個DDMP基團，C-3羥基經葡萄糖醛酸基修飾，形成大豆皂苷DDMP類［37］。P450酶Sg-5（CYP72A69）可將大豆皂醇B的C-21氧化形成羥基，生成大豆皂醇A，經糖基轉移酶催化可在C-3羥基、C-22加不同的糖基，生成大豆皂苷A類化合物［38］。DDMP類皂苷不穩(wěn)定，容易脫去DDMP基團在C-22位形成羰基，生成大豆皂苷E類化合物［35，38-39］。

圖3 大豆皂苷類五環(huán)三萜皂苷化合物（綠色標注為推測途徑）GlcA-葡萄糖醛酸基；Rx-糖基化修飾；Csl-類纖維素合酶Fig.3 Pentacyclic triterpenoid saponins with soybean saponin(the Predicted pathways are highlighted in green)GlcA-glucuronyl;Rx-glycosylation;Csl-Cellulose synthase-like enzyme

大豆皂苷糖基化的主要基因是Sg-1，Chigen Tsukamoto課題組［40］對中國8株野生大豆進行測序分析，發(fā)現不同Sg-1 突變體可對C-22 羥基添加不同的糖基，如Sg-1b（UGT73F2）可在大豆皂苷A類化合物的C-22位乙酰葡萄糖上加葡萄糖生成A0-αg 皂苷，Sg-1a（UGT73F4）可在C-22 位乙酰葡萄糖上加木糖生成Ab類皂苷。Sg-10-b可阻止C-22結合阿拉伯糖，生成大豆皂苷A0 類［40-43］。Sg-4（UGT73P10）可在大豆皂苷B類的C-3位糖基上加一個阿拉伯糖，生成大豆皂苷Bc′，Sg-4（UGT73P10）同源酶GMSG 2（UGT73P2）可催化大豆皂苷B類的C-3 羥基結合一個半乳糖，生成大豆皂苷Bb′［44］。UGT73P2 和UGT73P10 可催化大豆皂苷C-3 位糖基上分別修飾半乳糖和阿拉伯糖，生成大豆皂苷B類和DDMP類［42］。UGT73P2和UGT73P10與UGT73F2來 源 于 同 一 祖 先［43］。 Sg-3 （UGT91H9） 和UGT91H4 可分別在大豆皂苷C-3 位的糖鏈上添加第3個葡萄糖和鼠李糖生成大豆皂苷Ab等［42，44］。

1.4 多位點修飾的齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷類化合物

1.4.1 柴胡皂苷類

柴胡皂苷（saikosaponin）是一類廣泛存在于柴胡根中的五環(huán)三萜皂苷類化合物，在治療感冒、癌癥等方面有重要作用。目前柴胡皂苷的生物合成途徑尚不清晰，有研究者推測柴胡皂苷以β-香樹脂醇為前體，經過細胞色素P450 酶與糖基轉移酶修飾形成柴胡皂苷類化合物［45-46］。

以3，16-二羥基-齊墩果烷為結構基礎，使其C-11 與C-12 之間呈雙鍵，C-13 與C-28 之間呈環(huán)氧鍵，就形成了柴胡皂苷的基本結構單元柴胡皂苷元E，繼續(xù)對其C-23 位進行羥基化修飾，可得到柴胡皂苷元G、F。對各個柴胡皂苷元C-3 位的羥基進行巖藻糖、葡萄糖、鼠李糖等糖基化修飾，可得到柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、柴胡皂苷c等多種柴胡皂苷。在C-3、C-16、C-23、C-28 位點多羥基修飾的齊墩果烷基礎上，其母核上C-9 與C-11 之間、C-11與C-12之間、C-12與C-13之間、C-13與C-18 之間，形成一個或兩個雙鍵，結合C-13 位與C-28位的環(huán)氧鍵，再對其C-3位的羥基進行糖基化修飾，可形成柴胡皂苷元A、B、C、D，柴胡皂苷b1、b2、b3、b4，柴胡皂苷f等多種柴胡皂苷。

1.4.2 商陸酸類五環(huán)三萜皂苷化合物

商陸酸（esculentic acid）類化合物是一類廣泛存在于商陸根中的五環(huán)三萜類化合物，在治療各種炎癥中具有重要作用，目前主要從商陸根中提取［47-48］。商陸酸是在齊墩果酸的結構基礎上，對C-23、C-16 分別進行羥基化修飾，對C-30 位進行羧基化修飾而成的五環(huán)三萜化合物。對商陸酸的C-2、C-3 羥基、C-30 羧基分別選擇性羥基化、糖基化、甲基化修飾，可得到多種商陸皂苷元及商陸皂苷類化合物。

遠志皂苷是遠志的主要活性成分，其功效主要是有益智力、安定神志、縮短酒精體內代謝時間、化痰止咳、延緩衰老及抑菌等［49］。近年來，有學者對遠志皂苷類化合物的天然合成途徑進行了研究，推測了其理論合成路線，為遠志皂苷類五環(huán)三萜化合物的微生物合成奠定了基礎［50］。以2，27-二羥基-3-O-葡萄糖-商陸酸為基礎，對其C-23 進行羧基化衍生之后，繼續(xù)對其C-28 進行多種類型的糖基化修飾，結合母核上的多種羥基、雙鍵等修飾，可形成結構各異的遠志皂苷，包括遠志皂苷A、B、C、D、E、F。由于修飾較為復雜且氧化程度較高，多數遠志皂苷的穩(wěn)定性較差，經常以遠志皂苷元的形式存在。

目前利用微生物細胞工廠合成齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷化合物的報道大多集中于苷元的合成，如齊墩果酸、甘草次酸、山楂酸等。雖然催化相關母核的C-2、C-23、C-24、C-28、C-30 等位點形成相應苷元的P450 酶已經報道，但大多存在活性低、特異性差等問題，導致副產物多、產量低，在相關糖苷化合物生物合成方面的報道相對較少，且產量普遍較低，目前只有齊墩果酸、甘草次酸等少數幾個化合物糖苷衍生物的生物合成報道。柴胡皂苷、商陸皂苷、遠志皂苷等化合物的結構更為復雜、多樣，而催化C-16、C-27 等位點的P450 酶尚未報道，且部分反應過程未知，導致異源合成困難。在糖基轉移酶方面，除了異源表達糖基轉移酶活性低、特異性差的問題外，還涉及糖基供體選擇性問題，底盤宿主一般很難提供充足且多樣化的糖基供體，需要對底盤宿主進行優(yōu)化改造，且在合成途徑當中很多P450酶未解析，這也為途徑當中糖基轉移酶的鑒定增加了難度。

2 烏索烷型五環(huán)三萜皂苷化合物

烏索烷型又稱α-香樹脂烷型，在天然代謝途徑中，2，3-氧化鯊烯經氧化鯊烯環(huán)化酶催化生成α-香樹脂醇（α-amyrin），以α-香樹脂醇為基礎進行后續(xù)修飾形成的一類五環(huán)三萜化合物，代表化合物有熊果酸、地榆皂苷等（圖4）。

圖4 熊果酸類五環(huán)三萜皂苷化合物（綠色標注為推測途徑）Glc-葡萄糖基；Ara-阿拉伯糖基；Rha-鼠李糖基Fig.4 Pentacyclic triterpenoid saponins with ursolic acid (the predicted pathways were marked in green)Glc-glucosyl;Ara-arabinosyl;Rha-rhamnosyl

2.1 熊果酸類五環(huán)三萜皂苷化合物

熊果酸廣泛存在于多種植物當中，包括木犀科植物女貞、薔薇科植物枇杷、唇形科植物夏枯草等。熊果酸具有鎮(zhèn)靜、保肝抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗?jié)?、抗病毒、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、降低血糖等多種功能，被廣泛地用作醫(yī)藥和化妝品原料。

α-齊香樹脂醇在CYP716A 家族的P450 酶及其還原酶催化下，可氧化其C-28生成熊果酸，再經過CYP716C49對其C-2進行羥基化修飾，可生成科羅索酸（corosolic acid）。2019 年，張學禮課題組［13］從植物山楂中鑒定到P450 酶CYP716C49，利用工程化釀酒酵母對其異源表達，合成了熊果酸和科羅索酸，科羅索酸的產量達到了141 mg/L。許輝課題組［51］將具有催化28-O-葡萄糖基化功能的糖基轉移酶UGT74AG5，連同來自冬青的α-香樹脂醇合酶在釀酒酵母中共表達，產生了一種罕見的熊果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.2 地榆皂苷

地榆為我國常用中藥，始載于《神農本草經》，列為中品，具有涼血止血、解毒斂瘡之功效，在臨床上經常應用于止血、燒燙傷、直腸炎、結腸炎、腎炎的治療［52］。地榆皂苷類化合物是地榆中的主要活性物質，具有抗腫瘤以及美容護膚的作用，其中地榆皂苷Ⅰ不僅可以有效防止膠原纖維降解，也可以有效促進Ⅰ型膠原蛋白的產生，可用于美容護膚產品的開發(fā)［53-54］。對熊果酸C-3 位羥基進行阿拉伯糖修飾（UGT73C家族）可得到地榆皂苷B，繼續(xù)對地榆皂苷B的C-19位進行α-羥基化衍生可生成地榆皂苷Ⅱ（ziyuglycoside Ⅱ），繼續(xù)催化地榆皂苷Ⅱ的C-28 位羧基加上葡萄糖得到地榆皂苷Ⅰ（ziyuglycoside Ⅰ）。

2.3 積雪草酸

《神農本草經》同樣記載了積雪草的相關信息。積雪草為我國常用中藥，在印度等一些亞洲國家和地區(qū)也應用廣泛，在臨床上可用于跌打損傷、傳染性肝炎、流行性腦炎等疾病的治療。積雪草苷（asiaticoside）等五環(huán)三萜皂苷化合物是積雪草中的主要活性物質，可用于皮膚病、部分腎功能疾病的治療。積雪草的有效成分提取物可以有效抑制癌細胞的增殖、抗抑郁、加速傷口愈合，而且具有改善肝、腎功能的作用。南非、印度、東南亞等許多國家和地區(qū)也將其作為傳統(tǒng)藥物加以應用［55］。

理論上CYP72A68 對科羅索酸23 號位進行羥基化衍生可生成積雪草酸。通過多種糖基轉移酶在積雪草酸的C-28 羧基上進行一系列的糖基化修飾，加上葡萄糖-葡萄糖-鼠李糖，可得到積雪草苷。對積雪草酸和積雪草苷的C-6 進行羥基化衍生，可分別得到羥基積雪草酸和羥基積雪草苷［55］。2017 年，Kim 等［56］發(fā)掘UGT73AH1 可以在積雪草酸C-28 的羧基上添加一個葡萄糖，形成單葡萄糖-積雪草酸，再由其他糖基轉移酶在C-28 位的葡萄糖上添加葡萄糖-鼠李糖，形成積雪草苷。積雪草酸的生物利用度低，作為幾種疾病的潛在治療劑，需要對積雪草酸的結構進行修飾。研究表明，多種內生真菌以積雪草酸作為底物生成生物活性更高的積雪草酸衍生物［57-59］。例如，內生真菌深黃傘形霉可將積雪草酸轉化生成2α，3β，7β，23-四羥基-12-烯-28-酸和2α，3β，7β，23-四羥基-11-烯-28，13-內酯［58］。高兆輝等［59］利用小孢擬盤多毛孢可將積雪草酸轉化生成多種不同的衍生物。

與地榆皂苷、積雪草苷等化合物C-6、C-19 位氧化相關的P450 酶尚未解析，且多種糖基的修飾過程也尚未完全清晰，導致利用微生物細胞工廠合成烏索烷型五環(huán)三萜皂苷具有一定難度，除了熊果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的生物合成之外，關于烏索烷型三萜皂苷生物合成的報道相對較少。由于烏索烷型與齊墩果烷型三萜皂苷結構類似，合成途徑的部分酶可以通用，在多種化合物的天然合成途徑方面可以相互參考，所以利用微生物細胞工廠合成烏索烷型五環(huán)三萜皂苷化合物具有很大發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3 羽扇烷型五環(huán)三萜皂苷化合物

羽扇烷型五環(huán)三萜化合物是由羽扇豆醇合酶（lupeol synthase，LUS）催化2，3-氧化鯊烯合成羽扇醇，以羽扇醇為結構基礎進行后續(xù)修飾形成的一類五環(huán)三萜化合物。代表化合物有樺木酸、麥珠子酸等（圖5）。

圖5 樺木酸類五環(huán)三萜皂苷化合物（綠色標注為推測途徑）Glc-葡萄糖基；Ara-阿拉伯糖基；Rha-鼠李糖基Fig.5 Pentacyclic triterpenoid saponins with betulinic acid(the predicted pathways are highlighted in green)Glc-glucosyl;Ara-arabinosyl;Rha-rhamnosyl

3.1 樺木酸類五環(huán)三萜皂苷化合物

樺木酸具有抗腫瘤、抗艾滋病毒、抗炎和體外抗瘧等多種生物活性，尤其對于惡性皮膚黑色素瘤有很好的效果，而且毒性很小，是最有前途的抗癌藥物前體［60］。樺木酸天然存在于植物白樺樹的樹皮當中，在很大程度上限制了樺木酸的植物提取，因此，利用微生物細胞工廠對樺木酸進行生物合成具有巨大的應用前景。

CYP716A 家族的P450 酶同樣可以催化羽扇醇的C-28位生成樺木酸，再經CYP716C49催化其C-2位加羥基生成麥珠子酸。目前已成功利用釀酒酵母微生物細胞工廠從頭合成了樺木酸和麥珠子酸（alphitolic acid），麥珠子酸的產量達到23 mg/L［13］。李靜、張彥生［61］通過調節(jié)釀酒酵母中樺木酸和脂肪酸途徑關鍵基因的表達，表達擬南芥羽扇豆醇合酶LUS1、長春花P450 單加氧酶CrAO，使樺木酸產量達到1.92 mg/L（以OD 計）。盧文玉課題組［62］在解脂酵母中共表達來自擬南芥的羽扇豆醇合酶（AtLUP1）、P450 酶（CYP716A12）及其還原酶（AtCPR1），合成樺木酸的產量為0.32 mg/L，在P450 酶與其截短的還原酶融合表達、上游甲羥戊酸（MVA）徑的關鍵基因過表達后，產量增加到9.41 mg/L，最后通過甘油發(fā)酵，使樺木酸的產量達到16.98 mg/L。曹英秀等［63］將來自蓖麻的羽扇醇合酶（RcLUS），來自白樺的P450酶（CYP716A180）來自日本蓮花的還原酶（LiCPR）整合到解脂酵母中，合成樺木酸的產量達到25.62 mg/L，再通過將LiCPR 更換為來源于苜蓿的還原酶（MtCPR），樺木酸的產量達到32.33 mg/L。

3.2 白頭翁皂苷

白頭翁是一味用于治療熱毒血痢、溫瘧寒熱、鼻衄、血痔的中藥。白頭翁皂苷（pulchinenoside）是白頭翁中的主要成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗血吸蟲、增強免疫等多種藥理活性［64-67］。

對樺木酸的C-23 位進行羥基化衍生可得到化合物23-羥基樺木酸，以其為結構基礎，在C-3 位的羥基依次進行阿拉伯糖基和鼠李糖基化修飾可得到化合物白頭翁皂苷A，繼續(xù)在其C-28 位的羧基上進行葡萄糖-葡萄糖-鼠李糖的糖基鏈修飾，可得到白頭翁皂苷C［67］。

目前利用微生物細胞工廠合成羽扇烷型五環(huán)三萜化合物的報道很少，基于齊墩果烷型和烏索烷型五環(huán)三萜皂苷化合物合成途徑的分析和推測，為利用微生物合成羽扇烷型五環(huán)皂苷類化合物提供了參考和理論依據。

4 木栓烷型五環(huán)三萜化合物

木栓烷型五環(huán)三萜是木栓烷經過多種修飾、結構衍生形成的一類五環(huán)三萜化合物，其中包括雷公藤酮（tripterygone）等，其合成途徑尚不完全清晰。雷公藤酮主要存在于雷公藤中，在治療癌癥方面具有廣闊前景，目前主要通過化學合成法合成［68-70］。木栓烷是經過齊墩果烷C-4、C-10、C-14的甲基位移到C-5、C-9、C-13 上演變而來的。雷公藤酮是木栓烷C-3與C-4、C-1與C-10均呈雙鍵，C-2 呈酮，C-3 位羥基化、C-30 位經羧基化修飾后所形成。推測該類化合物可能是由2，3-氧化鯊烯經一種未知的氧化鯊烯環(huán)化酶，催化生成了木栓二烯醇，并在此基礎上再進行C-2位、C-30位的氧化等多種修飾的一類化合物（圖6）。

圖6 木栓烷類五環(huán)三萜化合物（綠色標注為推測途徑）Fig.6 Pentacyclic triterpenoid saponins with friedelanes(The predicted pathways are highlighted in green)

5 結論與展望

長久以來，對于具有豐富生理、藥理活性的五環(huán)三萜皂苷類化合物的研究從未間斷，從活性物質的提取到單一化合物的分離、純化，越來越多的五環(huán)三萜皂苷類化合物被分離鑒定出來，而隨著研究的深入，這些化合物的應用價值逐漸被開發(fā)，市場需求量也在不斷加大。為了滿足市場需要，工業(yè)上大量獲取相關化合物最直接的方法就是植物提取，根據化合物的不同性質、相應植物的不同特性，在工業(yè)發(fā)展過程中逐漸形成了特定的生產工藝。利用微生物細胞工廠高效合成五環(huán)三萜皂苷類天然產物，可以在一定程度上精簡工藝步驟。近年來，利用微生物合成五環(huán)三萜皂苷類化合物的研究取得了很大進展，已經實現了部分化合物的從頭合成，例如GAMG、GL、3-O-葡萄糖-甘草次酸、熊果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等（表1），但策略大多集中在轉錄組、基因組數據分析且產量普遍較低。對于現階段應用廣泛的五環(huán)三萜皂苷類化合物，實現其微生物合成的工業(yè)化是一項巨大挑戰(zhàn)，主要有以下幾方面的困難和挑戰(zhàn)：①實驗室菌株通常具有遺傳不穩(wěn)定性，且實際生產過程中的培養(yǎng)條件限制勢必也會帶來新的挑戰(zhàn)，從實驗室菌株到穩(wěn)定的工業(yè)生產菌株，需要大量的嘗試和驗證；②需要有較高的產量，其生產成本才能和現有的植物提取法相當；③需要對現有的生產工藝進行較大改進，在生產成本有優(yōu)勢的情況下，還需要考慮新工藝開發(fā)以及盈利周期，同時需要一定的科技人才儲備及科研和實際生產相結合，對于一般中小企業(yè)難以實現；④基于現有的生產工藝，衍生出了多種產品，在現有產品工藝基礎上，需要考慮利用微生物生產單一的化合物是否滿足整體經濟性，且現有產品已經形成了較為成熟的產業(yè)鏈，生產單一的化合物，在一定程度上會影響現有產業(yè)鏈。解決上述問題的核心基礎則是微生物細胞工廠的實際產量，只有產量達到產業(yè)化要求才有可能實現工業(yè)化生產。

表1 五環(huán)三萜皂苷類化合物的微生物合成

五環(huán)三萜皂苷類化合物的微生物合成主要瓶頸在于：①合成途徑未解析，部分P450 氧化酶、糖基轉移酶未知，對未知途徑關鍵酶的挖掘是建立微生物細胞工廠首要解決的問題，部分關鍵酶在微生物中異源表達能力差、活力低，且天然合成途徑當中有許多功能類似的同工酶，如何篩選到特異性強、催化活性高的關鍵酶也是現階段的關鍵問題；②微生物細胞內UDP 糖基供體的種類較單一、供應量不足也限制了五環(huán)三萜皂苷類化合物的產量；③大部分五環(huán)三萜皂苷類化合物對微生物宿主具有一定的毒性，要實現微生物生長和產物生產的平衡具有一定難度。

針對上述問題，可以考慮從以下幾個方面進行解決：①對相應植物進行轉錄組、基因組、代謝組等組學分析，結合生物信息學分析，挖掘新的關鍵酶。對挖掘到的關鍵酶進行體外酶活驗證，對不同性質的蛋白建立高效的體外可溶表達體系（包括通過不同的標簽、不同表達宿主增加目標蛋白的可溶性表達，通過微粒體對膜蛋白進行功能驗證等），結合晶體學、分子動力學模擬等手段，對關鍵酶的催化機理、關鍵催化位點進行研究；②通過①中的手段，挖掘不同植物、微生物中的脫氫酶、脫羧酶、差向異構酶等，結合不同微生物的代謝特點，選用適合的微生物作為底盤宿主對上述酶進行異源表達，實現多種類型糖基供體的供應，同時采用誘導表達、混菌培養(yǎng)等手段實現五環(huán)三萜化合物的時序性糖基化；③結合現有的五環(huán)三萜皂苷類化合物的藥理活性數據，通過分子對接、分子動力學模擬等手段，進行對宿主的理性改造。通過適應性馴化、常溫常壓等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變等技術，對宿主進行非理性改造，再結合高通量篩選平臺，篩選對目標化合物具有高耐受性的菌株作為底盤宿主進行目標化合物的生產。解決以上問題則有望大幅度提高微生物合成五環(huán)三萜皂苷類化合物的水平，為推進工業(yè)化應用奠定基礎。