爐甘石氧化鋅洗劑微生物限度檢查法的建立

李錦妹，林穎蘋，陳文靜，梁俊昌，朱文娟

1.惠州市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 惠州 516003；2.惠州市皮膚病防治研究所，廣東 惠州 516001

爐甘石氧化鋅洗劑主要成分為爐甘石粉、氧化鋅、苯酚、薄荷腦等，具有抑菌、殺菌、止癢作用，在治療皮膚瘙癢、潰瘍和紅腫方面有良好的效果。文獻(xiàn)報(bào)道，爐甘石、氧化鋅、苯酚、薄荷腦等，對細(xì)菌、霉菌以及金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均有不同程度的抑制作用［1-4］。若用常規(guī)法對其進(jìn)行微生物限度檢查，結(jié)果并不能真實(shí)反映樣品的污染情況［5］。為此，根據(jù)《中國藥典》2020 年版四部1105 和1106 的標(biāo)準(zhǔn)和方法［6］，對爐甘石氧化鋅洗劑進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，消除本品的抑菌性，從而準(zhǔn)確有效地檢出樣品中污染的微生物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用對供試液靜置3 min 后取上清的平皿法，對本品進(jìn)行微生物限度檢查，回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)，說明方法可行［7］。該方法不需使用復(fù)雜的儀器設(shè)備，具有簡便、快捷、準(zhǔn)確、可行的優(yōu)點(diǎn)，能真實(shí)反映爐甘石氧化鋅洗劑的微生物污染水平，可有效控制該類藥品的質(zhì)量，并為其他含抑菌性不溶性粉末的液體藥品的微生物限度檢查法提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（JC 1013A，南通嘉誠儀器有限公司）；立式自動壓力蒸汽滅菌器（GR85DP，廈門致微）；生化培養(yǎng)箱（LRH-250，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；霉菌培養(yǎng)箱（MJX-250B Ⅲ，天津泰斯特）；生物安全柜（BS-1600，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］，均購自北京三藥科技開發(fā)公司。

1.3 培養(yǎng)基

沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）和溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。以上培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果符合《中國藥典》2020 年版四部規(guī)定［8］，并按其使用說明配制。

1.4 試劑

稀釋液、沖洗液：pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；洗脫液：含0.05%（v/v）聚山梨酯80 的0.9%氯化鈉溶液。

1.5 供試品

爐甘石氧化鋅洗劑（批號：202106221，202106222，202106223），惠州市皮膚病防治研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備［6］

2.1.1金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌將3 代試驗(yàn)菌接種至TSB 中，置32.5 ℃培養(yǎng)24 h；取TSB 培養(yǎng)液用0.9%無菌氯化鈉溶液分別制成每1 mL 含菌數(shù)約為104cfu、102cfu 的菌懸液。

2.1.2白色念珠菌將3 代白色念珠菌接種至SDB中，置32.5 ℃培養(yǎng)24 h；取SDB 培養(yǎng)液用0.9%無菌氯化鈉溶液分別制成每1 mL 含菌數(shù)約為104cfu的菌懸液。

2.1.3黑曲霉將3 代黑曲霉接種至SDA 斜面培養(yǎng)基中，置22.5 ℃培養(yǎng)7 d，用10 mL 洗脫液，將孢子洗脫，然后用無菌吸管吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，再用洗脫液制成每1 mL 含菌數(shù)約為104cfu 的黑曲霉孢子懸液。

2.2 供試液制備

分別取3 個(gè)批號供試品10 mL，加稀釋液至100 mL，搖勻，制成1∶10 的供試液；依法制成1∶20、1∶30、1∶50 和1∶100 的供試液［9］。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)

需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)在用1 批次樣品確定適合的檢查方法后，驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3次不同批次的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收比值，回收比值應(yīng)在0.5～2 范圍內(nèi)。

2.3.1平皿法（1）試驗(yàn)組：取供試液各10 mL，分別置滅菌試管中，加入試驗(yàn)菌菌液（104cfu/mL）0.1 mL，振蕩均勻，使供試液的含菌量在100 cfu/mL 以內(nèi)，各吸取1 mL 至2 個(gè)平皿中，立即注入瓊脂培養(yǎng)基（44 ℃）約20 mL，混勻，待凝固后，倒置培養(yǎng)；需氧菌總數(shù)平板置32.5 ℃培養(yǎng)3 d，霉菌和酵母菌總數(shù)平板置22.5 ℃培養(yǎng)5 d。（2）菌液對照組:取稀釋液10 mL，分別置滅菌試管中，加入試驗(yàn)菌菌液（104cfu/mL）0.1 mL，振蕩均勻，使供試液的含菌量在100 cfu/mL 以內(nèi)，各吸取1 mL 置2 個(gè)平皿中，立即注入瓊脂培養(yǎng)基（44 ℃）約20 mL，混勻，待凝固后，倒置培養(yǎng)。（3）供試品對照組：取上述供試液10 mL，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作，測定供試品對照組的平均菌落數(shù)。

2.3.2薄膜過濾法（1）試驗(yàn)組：取供試液各10 mL，分別置滅菌試管中，加入試驗(yàn)菌菌液（104cfu/mL）0.1 mL，振蕩均勻，使供試液的含菌量在100 cfu/mL 以內(nèi)，吸取1 mL 加至含100 mL 沖洗液的一次性無菌薄膜過濾器中，混勻，過濾，取濾膜菌面朝上貼于相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基平板上。各試驗(yàn)菌平行制備2 張濾膜。（2）菌液對照組：取1 mL 試驗(yàn)菌菌液（102cfu/mL）加至含100 mL 沖洗液的一次性無菌薄膜過濾器中，混勻，過濾，取濾膜菌面朝上貼于相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基平板上。各試驗(yàn)菌平行制備2張濾膜。（3）供試品對照組：取供試液1 mL，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作，測定供試品對照組的平均菌落數(shù)。

2.3.3平皿法（靜置3 min）步驟同“2.3.1 平皿法”，試驗(yàn)組在加菌后，靜置3 min，取上清液作后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 控制菌檢查法的驗(yàn)證

2.4.1金黃色葡萄球菌的方法適用性試驗(yàn)取1∶10的供試液10 mL 及金黃色葡萄球菌菌懸液（102cfu/mL）1 mL，接入適宜體積TSB 中，于32.5 ℃培養(yǎng)24 h。取TSB 培養(yǎng)液劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，于32.5 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

2.4.2銅綠假單胞菌的方法適用性試驗(yàn)取1∶10 的供試液10 mL 及銅綠假單胞菌菌懸液（102cfu/mL）1 mL，接入適宜體積TSB 中，于32.5 ℃培養(yǎng)24 h。取TSB 培養(yǎng)液劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，于32.5 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 平皿法

需氧菌總數(shù)采用平皿法（1∶100）不能完全消除爐甘石氧化鋅洗劑對枯草芽孢桿菌的抑菌作用，回收比值僅為0.05；霉菌和酵母菌總數(shù)采用平皿法（1∶10），回收比值均不大于0.5，結(jié)果見表1。

表1 平皿法各試驗(yàn)菌株回收比值

3.2 薄膜過濾法

采用1∶20 的供試液、沖洗量為500 mL 的薄膜過濾法，枯草芽孢桿菌的回收比值只有0.01，未達(dá)到藥典要求，結(jié)果見表2。

表2 薄膜過濾法3種菌株的回收比值

3.3 平皿法（靜置3 min）

通過靜置3 min 后，需氧菌總數(shù)采用平皿法（1∶30）、霉菌和酵母菌總數(shù)采用平皿法（1∶10），各菌株的回收比值均在0.5～2.0 之間，結(jié)果見表3。

表3 平皿法（靜置3 min）各試驗(yàn)菌株回收比值

由此可見，靜置3 min 后取上清液作為供試液，可消除爐甘石氧化鋅洗劑對枯草芽孢桿菌的抑菌作用。因此，對供試液靜置3 min 后取上清液，采用平皿法，進(jìn)行需氧菌總數(shù)（1∶30）、霉菌和酵母菌總數(shù)（1∶10）的檢查。

3.4 控制菌檢查法的驗(yàn)證結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)分別比較了采用靜置3 min 吸取其上清液和未靜置兩組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的試驗(yàn)結(jié)果

供試液未靜置時(shí)，增菌液需達(dá)到300 mL 以上，金黃色葡萄球菌才能生長。而供試液經(jīng)過靜置后，只要100 mL 的增菌液，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均生長良好?？梢?，對供試液靜置3 min 后取上清液，可用常規(guī)法檢查控制菌。

4 討論

本品含有爐甘石、氧化鋅、苯酚、薄荷腦等成分，有較強(qiáng)的抑菌作用。驗(yàn)證結(jié)果表明，本品對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的抑制作用。藥典收載的去除或滅活供試品抗菌活性的方法有增加稀釋液或培養(yǎng)基體積、加入適宜的中和劑或滅活劑、薄膜過濾法，或幾法聯(lián)用［6,10］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用增加稀釋液（1∶20）和薄膜過濾法（500 mL/膜）聯(lián)用，枯草芽孢桿菌的回收比值仍不能達(dá)到0.5～2.0 之間。薄膜過濾法只去除了溶于水的苯酚和薄荷腦的抑菌性，但洗劑中大量不溶于水的爐甘石和氧化鋅粉末依然殘留在濾膜上，抑菌性并未完全消除。因此實(shí)驗(yàn)采用供試液靜置3 min 后取上清液，需氧菌總數(shù)采用平皿法（1∶30）、霉菌和酵母菌總數(shù)采用平皿法（1∶10），各菌株的回收比值均在0.5～2.0 之間，滿足藥典要求?？刂凭械慕瘘S色葡萄球菌和銅綠假單胞菌檢查采用供試品靜置3 min 后取上清液，用常規(guī)法即可。本實(shí)驗(yàn)操作簡單，不需要特殊儀器設(shè)備，只需靜置供試液取其上清液和增加稀釋液量即可很好地消除本品在試驗(yàn)條件下的抑菌作用，能很好地控制爐甘石氧化鋅洗劑的質(zhì)量，同時(shí)該法可為同類藥品的微生物限度檢查方法驗(yàn)證提供參考［11］。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)顯示，可采用離心沉淀集菌法［3］，消除樣品中抑菌作用，但本實(shí)驗(yàn)考慮該法操作步驟把控難度及實(shí)驗(yàn)時(shí)間耗時(shí)過長影響污染菌檢出結(jié)果，同時(shí)在進(jìn)行低速離心試驗(yàn)時(shí)，樣品里的不溶性物質(zhì)對樣品中所含的微生物還具有一定的攜帶作用［12］，尤其當(dāng)制劑中含有不溶性輔料時(shí)，其攜帶作用更強(qiáng)［13］。因此嘗試在試驗(yàn)過程中采用靜置吸取其上清液［14］的方法以消除抑菌作用。試驗(yàn)表明，靜置處理可消除樣品的抑菌性，但需要注意的是，靜置時(shí)間需嚴(yán)格控制在一定時(shí)間內(nèi)，時(shí)間過短，樣品的抑菌成分不能完全下沉,抑菌作用不能完全消除，影響回收比值；時(shí)間過長，菌體由于自身下沉作用，上清液體中含菌量偏低，同樣會影響回收比值，且導(dǎo)致樣品中污染菌的實(shí)際檢出結(jié)果偏低。