耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌流行病學(xué)調(diào)查與耐藥性分析

李少媚 吳森泉 張嘉文 賴應(yīng)昌 黎雪晶 姜義榮▲

1.廣東省東莞市人民醫(yī)院血液淋巴瘤科，廣東東莞 523000；2.廣東省東莞市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣東東莞 523000；3.廣東省東莞市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 523000

耐碳青霉烯類腸桿菌（carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE）包含70多種細(xì)菌，該類腸桿菌科細(xì)菌能夠產(chǎn)生碳青霉烯酶進(jìn)而對(duì)碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐藥性[1]。自2001年首例攜帶肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（klebsiella pneunwniae carbapenemase，KPC）的CRE被報(bào)道，世界范圍內(nèi)關(guān)于CRE感染的報(bào)道越來越多見[2]。目前市面上絕大多數(shù)抗菌藥物對(duì)CRE的抗菌活性均較差，無藥可用成為CRE感染者死亡的重要原因，而隨著臨床碳青霉烯類抗生素應(yīng)用的增加，進(jìn)一步增加CRE的檢出率[3]。本研究回顧性分析2014年1月至2019年12月東莞市人民醫(yī)院CRE耐藥情況，以期為臨床用藥及院感防控提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

收集2014年1月至2019年12月東莞市人民醫(yī)院送檢標(biāo)本中分離的83株耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細(xì)菌，標(biāo)本共對(duì)應(yīng)83例臨床患者，年齡1～85歲，平均（56.25±6.75）歲。質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌（批號(hào)：ATCC 700579/ BAA-1805）、大腸埃希菌（批號(hào)：ATCC 25799）。

1.2 藥敏分析及菌種鑒定

采用VITEK-2 型全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司）對(duì)進(jìn)行菌種鑒定及藥敏分析，參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S27 標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行結(jié)果判讀，使用改良Hodge試驗(yàn)（modified Hodge test，MHT）[5]對(duì)待測(cè)菌碳青霉烯酶陽性情況進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)陽性即提示該菌株產(chǎn)碳青霉烯酶。

1.3 碳青霉烯酶基因檢測(cè)

制備模板DNA（煮沸法），以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增碳青霉烯酶基因；擴(kuò)增體系為Premix Taq（大連寶生物工程有限公司）50 μl，引物各 1 μl，Premix Taq 25 μl，滅菌雙蒸水 21 μl，模板2 μl。反應(yīng)條件：①blaIMP：置于94℃下變性5 min、94℃變性 45 s、55.5℃變性 45 s、72℃變性 1 min，30個(gè)循環(huán)后，于72℃下延伸10 min；②blaVIM：置于 94℃下變性 5 min、94℃變性 45 s、56℃變性 45 s、72℃變性1 min，30個(gè)循環(huán)后，于72℃下延伸10 min；③blaKPC：置于94℃下變性5 min、94℃變性1 min、56℃變性 1 min、72℃變性 1 min，30 個(gè)循環(huán)后，于 72℃下延伸10 min；④blaOXA-48：置于94℃下變性5 min、94℃變性 45 s、48.5℃變性 45 s、72℃變性 1 min，32 個(gè)循環(huán)后，于72℃下延伸5 min。采用UVP一體化凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)GelDoc-ItTS3）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。各基因?qū)?yīng)引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。

表1 碳青霉烯酶基因引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)；采用WHONET 5.6進(jìn)行耐藥性分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株來源分析

83株CRE標(biāo)本來自尿液33株（39.76%）、痰液 16株（19.28%）、血 液 15株（18.07%）、膽 汁4株（4.82%）、分泌物8株（9.64%）、鼻腔拭子 1株（1.20%）、支氣管肺泡灌洗液1株（1.20%）、腹水1株（1.20%）、糞便1株（1.20%）、其他3株（3.61%）；其中尿液、痰液、血液中CRE菌株占比最高，三種途徑菌株共計(jì)64株，占總數(shù)的77.11%（64/83）。

2.2 CRE菌種分布分析

83株CRE當(dāng)中肺炎克雷伯菌（36株）、大腸埃希菌（20株）、陰溝腸桿菌（14株）占比最高，三種病原菌共計(jì)70株，占總數(shù)的84.34%（70/83）。見表2。

表2 CRE菌種分布

2.3 碳青霉烯酶基因檢測(cè)結(jié)果

36株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌中檢出攜帶碳青霉烯酶基因的菌株共31株，檢出率為86.11%（31/36），其中 blaKPC 30株、blaVIM 4株、blaIMP 4株、blaOXA-48 0株，檢出率分別為83.33%、11.11%、11.11%、0；檢出率最高的碳青霉烯酶基因?yàn)镵PC（30株），檢出率高達(dá)83.33%。有一例同時(shí)攜帶KPC、VIM、IMP三種碳青霉烯酶基因，有3例同時(shí)攜帶IMP、KPC，有1例同時(shí)攜帶VIM、KPC。部分KPC基因的結(jié)果見圖1。

圖1 部分KPC基因的結(jié)果

2.4 CRE耐藥性分析

耐藥性分析結(jié)果顯示對(duì)CRE敏感率最高的三種抗菌藥物為阿米卡星、慶大霉素、呋喃妥因，敏感率分別為69.88%、37.35%、37.35%；有6種抗菌藥物（氨芐西林/舒巴坦、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢唑啉、亞胺培南、厄他培南）對(duì)CRE的敏感率為0，有2種抗菌藥物（氨芐西林、頭孢替坦）對(duì)CRE的敏感率＜ 10.00%。見表3。

表3 CRE耐藥性分析

3 討論

碳青霉烯類抗生素是目前臨床抗菌效果最好、抗菌譜最廣的一類抗生素，被認(rèn)為是治療多重耐 藥 菌（multi-drug resistant bacteria，MDROS）感染的最有效藥物，大大提高了MDROS感染患者生存率及預(yù)后水平。盡管碳青霉烯類抗生素對(duì)大部分MDROS具有良好抗菌活性，但CRE卻對(duì)其余大部分抗生素具有耐藥性，因此臨床又稱其為“超級(jí)細(xì)菌”[6-8]。人體感染CRE后病原菌會(huì)侵入人體組織及血液，并在體內(nèi)不斷繁殖導(dǎo)致體內(nèi)正常細(xì)胞組織死亡而引起人體組織、器官出現(xiàn)功能障礙和炎癥反應(yīng)。長(zhǎng)期使用各類抗生素進(jìn)行治療的患者體內(nèi)病原菌發(fā)生變異的概率更高，因此這部分患者感染CRE的風(fēng)險(xiǎn)也更高[9-10]。人體一旦發(fā)生CRE感染，由于缺乏有效抗菌藥物，后果往往較為嚴(yán)重，因此，臨床為提高這部分感染者的治療效果通常主張采用多種抗菌藥物聯(lián)合使用以盡早殺滅病原菌，提高患者預(yù)后水平。

大量研究證實(shí)CRE對(duì)市面上絕大多數(shù)抗菌藥物均具有耐藥性，其對(duì)哌拉西林/他唑巴 坦（tazobactam-piperacillin，TZP）、氨 曲 南（Aztreonam，ATM）等常見抗生素的耐藥率達(dá)到 90% 以上，對(duì)頭孢他啶（Ceftazidime，CAZ）、頭孢西丁（cefoxitin，F(xiàn)OX）等的耐藥率也高達(dá)80%以上，無藥可用也使得CRE感染者具有較高的病死率[11-13]。而本研究耐藥性分析結(jié)果顯示，TZP、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢唑啉、亞胺培南、厄他培南對(duì)CRE的敏感率為0，氨芐西林、頭孢替坦對(duì)CRE的敏感率＜10.00%，這與既往研究結(jié)果基本一致，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了CRE對(duì)抗菌藥物的高耐藥性[14-15]。此外，本研究結(jié)果還顯示，肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌三種病原菌占總菌株的比值高達(dá)84.34%，而其中以肺炎克雷伯菌最多，臨床可通過對(duì)上述三種CRE病原菌進(jìn)行針對(duì)性研究以降低CRE感染率，提高CRE感染者治療效果。本文主要針對(duì)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌進(jìn)行耐藥性基因檢測(cè)，結(jié)果顯示，36株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌中檢出攜帶碳青霉烯酶基因的菌株共31株，檢出率為86.11%，其中檢出率最高的碳青霉烯酶基因?yàn)镵PC，檢出率高達(dá)83.33%，這與王青等[16]的研究對(duì)應(yīng)，這一結(jié)果提示bla-KPC基因或?yàn)镃RE對(duì)碳青霉烯類抗生素具有耐藥性的最主要原因。值得關(guān)注的是，本研究耐藥性分析顯示對(duì)CRE敏感率最高的三種抗菌藥物為阿米卡星、慶大霉素、呋喃妥因，敏感率分別為69.88%、37.35%、37.35%，這也提示上述三種抗菌藥物或?qū)RE感染治療具有臨床價(jià)值。本研究通過對(duì)CRE菌種分布、碳青霉烯酶基因分布及耐藥性展開分析，可為臨床CRE檢出患者抗菌藥物種類的選擇及整體治療方案的制訂提供參考依據(jù)，具有一定現(xiàn)實(shí)意義。但是，本研究受人員、經(jīng)費(fèi)及研究時(shí)間等限制，存在樣本量小、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較單一等局限性，可能導(dǎo)致結(jié)果與臨床實(shí)際存在偏差，仍存在進(jìn)一步拓展研究?jī)r(jià)值。

綜上所述，KPC基因是檢出率最高的碳青霉烯酶基因，而阿米卡星、慶大霉素、呋喃妥因?qū)RE敏感率分別達(dá)到69.88%、37.35%、37.35%，以上三種抗菌藥物對(duì)臨床CRE感染治療具有積極意義。此外，合理使用抗菌藥物，提高院感防控力度是降低CRE感染的有效手段。