甲狀腺功能亢進(jìn)患者外周血miRNA-21和miRNA-192的表達(dá)

丁莉, 陳日秋, 朱向盈, 官常榮

麗水市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科(浙江麗水 323000)

甲狀腺功能亢進(jìn)(甲亢)是常見的一種內(nèi)分泌代謝疾病，主要是機體中甲狀腺素合成異常的增多，使機體代謝亢進(jìn)和交感神經(jīng)興奮的內(nèi)分泌疾病[1-3]。甲亢表現(xiàn)主要為食欲亢進(jìn)，消瘦乏力，易激動，怕熱多汗，興奮性增高，心悸，甲狀腺腫大及心率增快等，且伴浸潤性或非浸潤性突眼、視力減退等較為嚴(yán)重的眼疾等，嚴(yán)重者可能出現(xiàn)甲狀腺危象[4-6]。因此，采取及時有效的診斷和治療甲亢方法尤為重要。微小RNA(miRNA)主要是由20～22個核苷酸組成的一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA。miRNA通過抑制靶mRNA翻譯和(或)誘導(dǎo)mRNA降解調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與多種疾病發(fā)生、發(fā)展，成為近年來研究熱點。本研究探討甲亢患者外周血miRNA-21和miRNA-192的表達(dá)，以期為診斷和治療甲亢提供參考?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年12月至2020年12月就診于麗水市人民醫(yī)院甲亢患者97例作為研究對象，依據(jù)《中國甲狀腺疾病診斷指南》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合甲亢診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)入組前沒有接收過相關(guān)藥物或外科手術(shù)治療；(3)簽訂知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他疾病導(dǎo)致甲亢者；(2)服用影響鈣、磷代謝藥物者；(3)精神疾病者；(4)合并心腦血管、惡性腫瘤疾病者；(5)合并其他甲狀腺疾病者；(6)過敏體質(zhì)者。

納入的97例中，男43例，女54例；年齡43～75歲，平均(60.32±7.81)歲；病程1～12個月，平均(6.12±1.43)個月。另選擇同期健康體檢者80例作為對照組，其中男32例，女48例；年齡41～75歲，平均(58.97±6.59)歲。兩組性別和年齡一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準(zhǔn)(202104161100000371807)。

1.2 治療方法 所有甲亢患者合理臥床休息，給予高維生素、低碘等常規(guī)治療，且口服甲硫咪唑片初始劑量10 mg，3次/d，患者病情改善后，逐步降低至5～10 mg/d，后期維持該劑量連續(xù)治療。連續(xù)治療3個月。

1.3 血清miRNA-21和miRNA-192表達(dá)測定 采用qRT-PCR檢測血清miRNA-21和miRNA-192表達(dá)，采集清晨空腹靜脈血5 mL，分離提取血清，離心半徑10 cm，離心轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心10 min，將其置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，采用TRIzol試劑提取血清總RNA，取5 μL總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并檢測總RNA的純度和完整度。按照美國Biomiga公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以U6作為內(nèi)參基因，檢測血清miRNA-21和miRNA-192表達(dá)。取cDNA進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min，共完成40個循環(huán)，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：miRNA-21上游引物：5′-GCCCATCCTCAAATACAAAGC-3′，下游引物：5′-GGTCCTGAACACAAAATGAGC-3′；miRNA-192上游引物：5′-TTAATGCTAATCGTGACTAAG-3′，下游引物：5′-ACCTGAGAGTAGACCAGAGAG-3′；GAPDH上游引物：5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，下游引物：5′-TTGATTTTGGAGGG ATCTCG-3′。采用2-ΔΔCt法計算miRNA-21和miRNA-192相對表達(dá)量。

1.4 甲狀腺功能水平測定 采集清晨空腹靜脈血5 mL，分離提取血清，離心半徑10 cm，離心轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心10 min，將其置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。采用放射免疫分析法測定甲狀腺功能指標(biāo)[游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、總?cè)饧谞钕僭彼?TT3)、游離甲狀腺素(FT4)、總甲狀腺素(TT4)和促甲狀腺素(TSH)]水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miRNA-21和miRNA-192相對表達(dá)量比較 甲亢組血清miRNA-21相對表達(dá)量高于對照組，而血清miRNA-192相對表達(dá)量低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清miRNA-21和miRNA-192相對表達(dá)量比較

2.2 兩組甲狀腺功能指標(biāo)變化比較 甲亢組FT3、TT3、FT4和TT4水平高于對照組，而TSH水平低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組甲狀腺功能指標(biāo)比較

2.3 治療前后血清miRNA-21和miRNA-192相對表達(dá)量比較 治療后血清miRNA-21相對表達(dá)量低于治療前，而血清miRNA-192相對表達(dá)量高于治療前(P<0.05)。見表3。

表3 治療前后血清miRNA-21和miRNA-192相對表達(dá)量比較

2.4 ROC曲線分析miRNA-21和miRNA-192對甲亢診斷價值 miRNA-21對甲亢診斷敏感度和特異度分別為75.44%和70.00%；miRNA-192對甲亢診斷敏感度和特異度分別為80.00%和72.34%。見表4和圖1。

表4 miRNA-21和miRNA-192對甲亢診斷價值

圖1 ROC曲線分析miRNA-21和miRNA-192對甲亢診斷價值

2.5 miRNA-21和miRNA-192與甲狀腺功能相關(guān)性 miRNA-21與FT3、TT3、FT4和TT4呈線性正相關(guān)，與TSH呈線性負(fù)相關(guān)；miRNA-192與FT3、TT3、FT4和TT4呈線性負(fù)相關(guān)，與TSH呈線性正相關(guān)。見表5。

表5 miRNA-21和miRNA-192與甲狀腺功能相關(guān)性

3 討論

甲亢具體發(fā)病機制尚未完全闡明，甲亢患者在循環(huán)、消化及神經(jīng)等系統(tǒng)普遍表現(xiàn)出較高的代謝亢進(jìn)和興奮性，且大多數(shù)甲亢患者主要由彌漫性毒性甲狀腺腫所致[8-10]。若不采取及時有效的治療，患者病情可能會進(jìn)一步加重，甚至可能發(fā)展為甲亢性心臟病，嚴(yán)重影響患者生命治療[11-14]。目前，針對甲亢患者尚無特效治療手段，而甲硫咪唑片是主要治療藥物治療，該藥物主要通過抑制甲狀腺過氧化物酶的活性，降低甲狀腺激素的合成量及血液中甲狀腺激素水平，從而促進(jìn)甲狀腺功能恢復(fù)正常[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療后血清miRNA-21相對表達(dá)量低于治療前而血清miRNA-192相對表達(dá)量高于治療前，提示甲硫咪唑片治療后可下調(diào)血清miRNA-21表達(dá)及上調(diào)miRNA-192表達(dá)。

miRNA能夠通過靶向調(diào)節(jié)mRNA蛋白翻譯過程或與特定的mRNA結(jié)合來調(diào)控基因的表達(dá)，具有組織和細(xì)胞特異性，參與了各個系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[16]。與此同時，miRNA具有較高的保守性，故而其可于血清中穩(wěn)定表達(dá)且被檢測到。相比于mRNA其更加準(zhǔn)確、穩(wěn)定，是目前用于診斷多種疾病的熱點研究方向。近年來，miRNA在內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)方面越來越受到重視[17]。目前，臨床上尚無有關(guān)miRNA-21和miRNA-192與甲亢相關(guān)性研究。本研究發(fā)現(xiàn)，甲亢組血清miRNA-21相對表達(dá)量高于對照組而血清miRNA-192相對表達(dá)量低于對照組，提示甲亢患者血清miRNA-21表達(dá)升高，而miRNA-192表達(dá)降低，由此可見miRNA-21和miRNA-192在甲亢疾病的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮一定作用，提示能夠通過調(diào)控或監(jiān)測miRNA-21和miRNA-192的表達(dá)水平預(yù)防或治療甲亢疾??；miRNA-21和miRNA-192用于甲亢患者具有良好敏感度和特異度。由此可見通過檢測miRNA-21和miRNA-192對診斷甲亢疾病具有重要意義。FT3、TT3、FT4、TT4和TSH是評價甲狀腺功能重要指標(biāo)[18]。其中FT3和FT4屬游離的甲狀腺激素，是常用于甲亢的診斷敏感指標(biāo)，F(xiàn)T3主要用于甲亢診斷的敏感指標(biāo)，F(xiàn)T4能夠直觀反映甲狀腺的功能情況。TSH主要由腺垂體分泌，可促進(jìn)甲狀腺功能，且可促進(jìn)甲狀腺激素的合成和分泌，其分泌不僅受促甲狀腺激素釋放激素的作用，且受T3和T4的反饋調(diào)節(jié)[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，甲亢組FT3、TT3、FT4和TT4水平高于對照組而TSH水平低于對照組，提示甲亢患者存在甲狀腺功能異常。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21與FT3、TT3、FT4和TT4呈線性正相關(guān)，與TSH呈線性負(fù)相關(guān)；miRNA-192與FT3、TT3、FT4和TT4呈線性負(fù)相關(guān)，與TSH呈線性正相關(guān)。但本研究還存在一些不足，由于甲亢疾病病程較長，本研究納入樣本量小，且隨訪時間短，還需后續(xù)作多中心、多樣本深入研究，提供可靠的臨床參考價值。

綜上所述，甲亢患者中miRNA-21高表達(dá)，而miRNA-192低表達(dá)，且與甲狀腺功能密切相關(guān)，可作為診斷和治療輔助性指標(biāo)。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：試驗設(shè)計為:丁莉，研究實施為:陳日秋，資料收集為:朱向盈,論文撰寫為:丁莉，論文修訂為:陳日秋，審校為:官常榮。