TLR4、TREM1在燒傷感染患者血清中的表達(dá)水平及其診斷價(jià)值*

劉燕, 馬清昌, 徐偉, 狄海萍

開封市中心醫(yī)院 1醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科， 2燒傷整形科， 3骨科(河南開封 475000)； 4鄭州市第一人民醫(yī)院燒傷中心(河南鄭州 450004)

燒傷作為一種復(fù)雜的損傷形式，可導(dǎo)致機(jī)體生理紊亂，患者表現(xiàn)為皮膚功能受損、體液丟失、組織壞死、細(xì)菌移位等，患者極易發(fā)生感染，感染是導(dǎo)致病死率升高的主要原因[1]。但由于感染癥狀不明顯，不具有典型性和特異性，在早期診斷中很難發(fā)現(xiàn)，增加了風(fēng)險(xiǎn)[2]。因此，發(fā)現(xiàn)與燒傷感染相關(guān)的基因?qū)τ诩霸缭\斷燒傷患者感染具有較高價(jià)值。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)作為天然免疫模式識別受體，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠識別受損組織和壞死細(xì)胞釋放的內(nèi)源性病原分子，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[3]；淋病奈瑟菌能夠?qū)е氯祟愖訉m內(nèi)膜上皮感染損傷，抑制TLR4可減少感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥，可能成為減少人子宮內(nèi)膜上皮淋病奈瑟菌感染的治療方法[4]。髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體1(triggering receptor expressed on myeloid cell 1，TREM1)屬于免疫球蛋白超家族，是先天免疫效應(yīng)細(xì)胞的模式識別受體之一，作為炎癥的上游因子，胞外細(xì)菌、脂多糖等均可促進(jìn)TREM1上調(diào)[5]；在膿毒癥中表達(dá)上調(diào)，從而誘發(fā)肺損傷等并發(fā)癥[6]。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，激活TREM1后能夠激活TLR4通路直接或間接放大炎性反應(yīng)，從而參與多種急、慢性炎癥疾病過程[7]。但目前少見兩者在燒傷患者中的相關(guān)研究。因此，本研究檢測TLR4、TREM1在燒傷感染患者血清中的表達(dá)情況并探究其診斷價(jià)值，以期為臨床上及早發(fā)現(xiàn)影響燒傷患者感染的基因提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年6月至2021年3月本院78例燒傷科住院病例為研究對象(研究組)，男47例、女31例，年齡19～73歲、平均(37.48±7.92)歲；同期健康體檢者80例作為對照(對照組)，男50例、女30例，年齡20～75歲、平均(39.41±8.17)歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。研究組燒傷原因：熱液燒傷42例、火焰燒傷21例、電燒傷12例，其他3例。燒傷面積：燒傷面積≥30% 11例、10%≤燒傷面積<30% 21例、燒傷面積<10% 46例。

研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)燒傷24 h內(nèi)就醫(yī)；(2)患者成年；(3)本研究患者知情并同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入院72 h內(nèi)死亡患者；(2)存在心肌梗死、腦出血、惡性腫瘤等重大疾病患者；(3)入院前使用抗生素患者；(4)哺乳期婦女或孕婦。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無發(fā)熱感染等癥狀；(2)心、肝、腎功能正常；(3)白細(xì)胞計(jì)數(shù)正常。

研究組分為3個(gè)亞組：膿毒癥患者為重癥感染組(n=18)，男10例、女8例，年齡23～70歲、平均(37.85±8.13)歲，燒傷面積≥30% 3例、10%≤燒傷面積<30% 6例、燒傷面積<10% 9例；局部感染為局部感染組(n=37)，男21例、女16例，年齡19～71歲、平均(37.62±7.81)歲，燒傷面積≥30% 5例、10%≤燒傷面積<30% 10例、燒傷面積<10% 22例；單純燒傷未發(fā)生感染為未感染組(n=23)，男16例、女7例，年齡20～73歲、平均(36.97±8.16)歲，燒傷面積≥30% 3例、10%≤燒傷面積<30% 5例、燒傷面積<10% 15例。3組性別、年齡及燒傷面積情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。膿毒癥符合燒傷膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：(1)臨床表現(xiàn)為精神抑郁、煩躁或譫語，出現(xiàn)腹脹、腹瀉或消化道出血癥狀，舌質(zhì)絳紅、毛刺，干而少津；(2)體溫>39℃或<35.5℃，連續(xù)3 d；(3)氣促>28次/min；(4)心率>120次/min；(5)白細(xì)胞計(jì)數(shù)>12×109·L-1或<4×109·L-1，其中中性粒細(xì)胞百分比>80%或幼稚粒細(xì)胞百分比>10%。符合第1條中任何一項(xiàng)加后4項(xiàng)中任何2項(xiàng)即確診為燒傷膿毒癥。局部感染診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床表現(xiàn)為：體溫升高(最高≤38℃)或降低(最低≥36℃)，白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高(最高≤12×109·L-1)或降低(最低≥4×109·L-1)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)升高(最高≤7×109·L-1)或降低(最低≥2×109·L-1)等，但不符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)具有明顯感染癥狀：局部紅、腫、熱、痛、創(chuàng)面有膿性分泌物、異味等；(3)創(chuàng)面細(xì)胞培養(yǎng)呈陽性、血培養(yǎng)呈陰性。符合上述標(biāo)準(zhǔn)為局部感染。單純燒傷未感染標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床指標(biāo)：36.3℃≤體溫≤37.7℃、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及中性粒細(xì)胞在正常范圍內(nèi)且波動不大；(2)一般情況良好，創(chuàng)面以滲出為主，未見明顯感染癥狀；(3)創(chuàng)面及血培養(yǎng)均為陰性。符合上述標(biāo)準(zhǔn)為單純創(chuàng)傷未感染。

本研究經(jīng)本院倫理委員會審核并通過(2018021)。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清中TLR4、TREM1水平 單純燒傷患者、重癥感染者及局部感染者、健康體檢者分別于入院當(dāng)天、獲得臨床診斷當(dāng)天、體檢當(dāng)天空腹抽取靜脈血5 mL，室溫靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，上清備用。嚴(yán)格按照人TLR4、TREM1 ELISA試劑盒(英國abcam公司，貨號分別為：ab277392、ab270884)說明書檢測血清中TLR4、TREM1水平。

2 結(jié)果

2.1 研究組、對照組血清中TLR4、TREM1水平情況 與對照組相比，研究組血清中TLR4、TREM1水平升高(P<0.05)。見表1。

表1 研究組、對照組血清中TLR4、TREM1水平比較

2.2 重癥感染組、局部感染組、未感染組血清中TLR4、TREM1水平情況 與重癥感染組相比，局部感染組、未感染組血清中TLR4、TREM1水平降低(P<0.05)；與局部感染組相比，未感染組血清中TLR4、TREM1水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 重癥感染組、局部感染組、未感染組血清中TLR4、TREM1水平比較

2.3 燒傷患者血清中TLR4與TREM1的關(guān)系 血清中TLR4與TREM1呈正相關(guān)(r=0.526，P<0.05)。見圖1。

圖1 燒傷患者血清中TLR4與TREM1的相關(guān)性

2.4 血清TLR4、TREM1水平對燒傷患者感染的診斷價(jià)值 因重癥感染組、局部感染組均發(fā)生感染，將兩組數(shù)據(jù)合并，通過ROC曲線探究血清TLR4、TREM1水平對燒傷患者感染與否的診斷價(jià)值。ROC曲線顯示，血清TLR4水平預(yù)測燒傷患者感染的ROC曲線下面積為0.825(95%CI:0.732～0.918)，截?cái)嘀禐?.686 ng/mL，其敏感度為65.45%、特異度為91.30%、準(zhǔn)確度為73.08%；血清TREM1水平預(yù)測燒傷患者感染的ROC曲線下面積為0.801(95%CI:0.699～0.916)，截?cái)嘀禐?42.482 ng/L，其敏感度為81.82%、特異度為69.57%，準(zhǔn)確度為78.21%；兩者聯(lián)合預(yù)測燒傷患者感染的ROC曲線下面積為0.911(95%CI:0.829～0.973)，敏感度為87.27%、特異度為86.96%、準(zhǔn)確度為87.18%。見圖2。血清TLR4水平與TLR4+TREM1 ROC曲線下面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.438，P=0.075)；與血清TREM1水平相比，TLR4+TREM1 ROC曲線下面積升高(Z=1.659，P=0.048)。血清TLR4水平敏感度、準(zhǔn)確度均低于TLR4+TREM1(P<0.05)。見表3。

圖2 血清TLR4、TREM1水平預(yù)測燒傷患者發(fā)生感染的ROC曲線

表3 血清TLR4、TREM1水平及兩者聯(lián)合對燒傷患者感染的診斷價(jià)值的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度比較 %

3 討論

燒傷是常見的創(chuàng)傷性疾病，會導(dǎo)致患者機(jī)體免疫功能及抵抗力低下，細(xì)菌等乘虛而入，引起局部或全身感染，從而減慢傷口愈合，嚴(yán)重患者會出現(xiàn)多器官臟器功能衰退，其中膿毒癥作為大面積燒傷感染的主要并發(fā)癥之一，影響患者生命安全[9]。且在治療過程中，感染貫穿燒傷治療的全過程，可能因感染而加重，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡。因此，尋找與燒傷感染關(guān)系密切的基因，及早發(fā)現(xiàn)感染并對應(yīng)治療對于疾病意義重大。

在本研究中檢測燒傷感染患者血清中TLR4、TREM1的表達(dá)水平，以期早期發(fā)現(xiàn)燒傷患者感染，為患者治療提供一定參考依據(jù)。TLR4在非特異性免疫細(xì)胞和特異性免疫反應(yīng)的T、B淋巴細(xì)胞表面，是炎癥信號傳遞的門戶，在免疫防疫過程中發(fā)揮重要作用，且免疫系統(tǒng)在過敏反應(yīng)、微生物感染、腫瘤免疫等方面均發(fā)揮重要作用[10-11]。TLR4作為經(jīng)典的炎癥通路，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)3部分組成，胞外區(qū)富含亮氨酸，能與CD14分子中的亮氨酸重復(fù)序列結(jié)合從而介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用，胞內(nèi)區(qū)存在與IL-1受體結(jié)合的高度保守序列，該序列是與下游信號傳導(dǎo)分子、蛋白激酶相互作用的關(guān)鍵部位，當(dāng)細(xì)菌或微生物感染時(shí)，病原菌及其成分與靶細(xì)胞膜上TLR4結(jié)合后跨膜信號通過胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域激活轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而引起多種炎癥因子表達(dá)，發(fā)生炎癥發(fā)應(yīng)，這是創(chuàng)面皮膚傷口愈合緩慢的原因之一[12]。在澳大利亞紅桿菌引起的感染中激活巨噬細(xì)胞中的ASC炎癥小體會誘發(fā)炎癥反應(yīng)，TLR4-/-小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞中炎癥因子水平下降可降低澳大利亞紅桿菌的感染效果[13]；燒傷大鼠模型中下調(diào)TLR4可抑制腎臟炎癥從而預(yù)防燒傷誘導(dǎo)的早期急性腎損傷[14]。TREM1作為多核細(xì)胞炎癥受體，被稱為炎癥因子放大器，可應(yīng)答內(nèi)源性和外源性危險(xiǎn)信號，從而協(xié)同和放大TLR4介導(dǎo)的信號通路，誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生，加強(qiáng)炎癥反應(yīng)過程[15]。哥倫比亞人群瘧疾中TREM1出現(xiàn)基因突變與瘧疾的易感性關(guān)系密切，參與免疫過程[16]。

本研究中燒傷患者血清中TLR4、TREM1表現(xiàn)出高表達(dá)；提示燒傷可能誘導(dǎo)機(jī)體各項(xiàng)功能發(fā)生變化，進(jìn)而影響TLR4、TREM1水平。在燒傷患者中，部分患者出現(xiàn)局部感染，部分出現(xiàn)嚴(yán)重感染導(dǎo)致膿毒癥產(chǎn)生，患者感染越嚴(yán)重，血清中TLR4、TREM1水平越高，提示燒傷感染患者中微生物等感染可能與靶細(xì)胞膜上TLR4結(jié)合后跨膜信號通過胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域激活TREM1的表達(dá)，從而擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，進(jìn)而延緩傷后愈合。進(jìn)一步研究表明，在燒傷患者中TLR4與TREM1呈正相關(guān)，且兩者聯(lián)合診斷對燒傷患者感染具有更高的診斷價(jià)值；提示TREM1能夠協(xié)同和放大TLR4介導(dǎo)的信號通路，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥過程。且燒傷患者血清中TLR4水平高于4.686 ng/mL、TREM1水平高于242.482 ng/L在臨床上應(yīng)該受到重視，患者感染的概率升高。TLR4+TREM1 ROC曲線下面積高于血清TREM1 ROC曲線下面積；敏感度、準(zhǔn)確度高于血清TLR4敏感度、準(zhǔn)確度；兩者聯(lián)合診斷可使診斷價(jià)值更高，綜合兩者指標(biāo)對于燒傷患者感染更有價(jià)值。

綜上所述，燒傷感染患者血清中TLR4、TREM1水平升高，兩者關(guān)系密切，且對燒傷患者感染與否有一定診斷價(jià)值。但受樣本例數(shù)限制，本研究結(jié)果可能與實(shí)際情況存在一定偏差，擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究是本研究接下來研究重點(diǎn)。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：馬清昌負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)、實(shí)施、資料收集和論文撰寫及修訂，劉燕和徐偉、狄海萍負(fù)責(zé)研究實(shí)施、資料收集和數(shù)據(jù)分析。