非重癥新型冠狀病毒Delta變異株病毒轉(zhuǎn)陰因素分析

黃春明， 胡中偉， 詹遠(yuǎn)京

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八醫(yī)院隔離十九區(qū)(廣東廣州 510060)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)從2020年開始席卷全球，目前已有較多SARS-CoV-2病毒核酸轉(zhuǎn)陰的臨床研究，然而，各種臨床研究顯示病毒轉(zhuǎn)陰時(shí)間差異很大[1]，一項(xiàng)綜述顯示重癥和非重癥患者病毒轉(zhuǎn)陰時(shí)間分別為19.8 d和17.2 d[1]，病毒轉(zhuǎn)陰的影響因素亦有較大的差異性[2-5]，如性別、年齡、基礎(chǔ)病等一般情況，還有病毒載量、機(jī)體炎癥和細(xì)胞免疫等均可能影響病毒轉(zhuǎn)陰[6-7]。SARS-CoV-2已發(fā)現(xiàn)并命名多種變異株[8]，2021年5月廣州和7月南京相關(guān)本土病例證實(shí)為Delta變異株，此變異株傳染性更強(qiáng)[9]，而Delta變異株病毒轉(zhuǎn)陰報(bào)道少，本研究分析非重癥新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)患者病毒轉(zhuǎn)陰情況，并探討早期病毒首次轉(zhuǎn)陰的相關(guān)因素，并防治疫情提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年5月20日至6月18日廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八醫(yī)院隔離病區(qū)收治的廣州市本土SARS-CoV-2 Delta變異株非重癥患者，一共88例成年患者納入本研究，所有患者均符合《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，非重癥患者定義：包括輕型和普通型患者。RT-PCR檢測病毒N基因和Orf1a/b基因，結(jié)果表示為周期閾值(Ct)，Ct值越小，病毒復(fù)制拷貝越活躍，病毒載量越高，Ct值>40，判定為陰性?；颊哚t(yī)院住院診治分2個(gè)階段：臨床治療期(簡稱治療期)和臨床留觀隔離期(簡稱留觀期)。治療期出院標(biāo)準(zhǔn)：(1)2次連續(xù)(間隔>24 d)鼻拭子陰性；(2)臨床癥狀好轉(zhuǎn)，至少3 d不發(fā)熱；(3)胸部CT肺部感染好轉(zhuǎn)。留觀期出院標(biāo)準(zhǔn)：每例患者至少隔離觀察14 d，癥狀緩解，2次連續(xù)(間隔>24 h)鼻拭子陰性，胸部CT肺部感染明顯吸收好轉(zhuǎn)。病毒首次轉(zhuǎn)陰時(shí)間定義：從首次鼻拭子陽性到2次連續(xù)(間隔>24 h)陰性試驗(yàn)中的第1次的時(shí)間。早期轉(zhuǎn)陰組：病毒首次轉(zhuǎn)陰時(shí)間<15 d；晚期轉(zhuǎn)陰組：病毒首次轉(zhuǎn)陰時(shí)間≥15 d。病毒最終轉(zhuǎn)陰時(shí)間：截止2021年9月5日，從首次鼻拭子核酸陽性，至第1天核酸陰性結(jié)果的時(shí)間間隔，并且核酸陰性后不轉(zhuǎn)化為陽性結(jié)果。N基因波谷和Orf1a/b基因波谷：整個(gè)診治期間最低Ct值；波谷時(shí)間：從入院時(shí)間至波谷值的時(shí)間。鼻拭子采樣間隔：治療期鼻拭子隔天檢測1次，留觀期核酸復(fù)查陽性者隔天檢測1次，陰性者3～5 d檢測1次。本研究獲得廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(202007140)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 臨床資料收集 SARS-CoV-2 Delta變異株感染患者資料收集均來自醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)，包括性別、年齡、血常規(guī)、C反應(yīng)蛋白(CRP)和血清淀粉樣蛋白A(SAA)，基線白細(xì)胞介素-6(IL-6)。全部病例首次SARS-CoV-2核酸陽性由廣州市疾病預(yù)防控制中心確診，廣東省疾病預(yù)防控制中心確定病毒株基因測序。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 全組患者整體情況：隨訪中位數(shù)92 d，病毒首次轉(zhuǎn)陰時(shí)間中位數(shù)為19(15，22)d，范圍1～28 d；治療期住院時(shí)間中位數(shù)為21(18，25)d，范圍10～30 d；留觀期住院時(shí)間中位數(shù)為28(21，29)；留觀期檢測核酸陽性40例(45.5%)；病毒最終轉(zhuǎn)陰時(shí)間中位數(shù)為28(19，45)d，范圍1～75 d。早期轉(zhuǎn)陰組20例(22.7%)，晚期轉(zhuǎn)陰組68例(77.3%)，兩組性別和年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與晚期轉(zhuǎn)陰組比較，早期轉(zhuǎn)陰組治療期住院時(shí)間和病毒最終轉(zhuǎn)陰時(shí)間更短(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者一般情況 M(P25,P75)

2.2 兩組患者炎癥指標(biāo)及免疫細(xì)胞比較 與晚期轉(zhuǎn)陰組基線橫向比較，早期轉(zhuǎn)陰組淋巴細(xì)胞(LYM)更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SAA、CRP和IL-6有更低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與晚期轉(zhuǎn)陰組第1周橫向比較，早期轉(zhuǎn)陰組LYM和嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)更高，而SAA和CRP更低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第2～4周，兩組SAA、CRP、LYM和EOS差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組患者檢驗(yàn)指標(biāo)比較 M(P25,P75)

縱向比較：兩組患者基線LYM和EOS均最低(P<0.05)，第1周后逐漸恢復(fù)正常；早期轉(zhuǎn)陰組基線、第1周和第2周SAA和CRP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與基線、第1周和第2周比較，第4周SAA和CRP更低；晚期轉(zhuǎn)陰組第1周SAA和CRP最高(P<0.05)，第2周后逐漸恢復(fù)正常。第1周后未規(guī)范查IL-6，因此無相關(guān)比較數(shù)據(jù)。

2.2 兩組患者N基因和Orf1a/b基因比較 與晚期轉(zhuǎn)陰組比較，早期轉(zhuǎn)陰組N基因和Orf1a/b基因波谷更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者PT-PCR病毒基因比較 M(P25,P75)

2.3 相關(guān)因素分析 病毒首次轉(zhuǎn)陰時(shí)間與N基因波谷、Orf1a/b基因波谷、基線LYM、第1周LYM和EOS呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.353、-0.358、-0.294、-0.297和-0.230(P<0.05)；而與最終轉(zhuǎn)陰時(shí)間、第1周SAA和CRP呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.353、0.323和 0.238(P<0.05)。第2～4周LYM、EOS、SAA和CRP均與病毒首次轉(zhuǎn)陰不相關(guān)，同時(shí)，病毒首次轉(zhuǎn)陰與性別、年齡和慢性基礎(chǔ)性疾病(如高血壓病、糖尿病、慢性肺部疾病、慢性肝病)不相關(guān)(P>0.05)。

2.4 預(yù)測SARS-CoV-2 Delta變異株病毒首次轉(zhuǎn)陰ROC曲線分析 將上述相關(guān)因素作ROC曲線分析預(yù)測病毒首次轉(zhuǎn)陰(圖1)，結(jié)果顯示基線LYM、第1周LYM、EOS、SAA、CRP、N基因波谷和Orf1a/b基因波谷預(yù)測早期病毒首次轉(zhuǎn)陰的ROC曲線下面積分別是0.677(0.530～0.823)、0.720(0.597～0.843)、0.748(0.636～0.861)、0.278(0.148～0.408)、0.292(0.150～0.433)、0.753(0.641～0.865)和0.741(0.622～0.859)，cut off值分別是1.49×109·L-1、1.56×109·L-1、0.02×109·L-1、124 mg/L、7.27 mg/L、21.2和20.2。

圖1 各項(xiàng)指標(biāo)預(yù)測病毒首次轉(zhuǎn)陰的ROC曲線圖

3 討論

SARS-CoV-2病毒轉(zhuǎn)陰對于確定適當(dāng)?shù)母綦x期至關(guān)重要，目前關(guān)于SARS-CoV-2病毒轉(zhuǎn)陰的臨床研究結(jié)果，具有顯著異質(zhì)性[1]，這可能與診斷標(biāo)準(zhǔn)、病例分型、隨訪時(shí)間、標(biāo)本類型、采樣間隔時(shí)間、患者基本情況(如性別、年齡構(gòu)成比、基礎(chǔ)病)、檢測試劑敏感性和藥物因素等有關(guān)。

SARS-CoV-2病毒轉(zhuǎn)陰無統(tǒng)一定義，依據(jù)我國制定的COVID-19診療方案[10]，連續(xù)2次間隔>24 h呼吸道標(biāo)本RT-PCR檢測核酸陰性(即本文定義的病毒首次轉(zhuǎn)陰)是主要出院標(biāo)準(zhǔn)之一，然而，呼吸道標(biāo)本核酸復(fù)測核酸陽性是常見的現(xiàn)象[11-12]，因此以治療期出院(或病毒首次轉(zhuǎn)陰)作為隨訪終點(diǎn)的病毒轉(zhuǎn)陰時(shí)間，與隨訪時(shí)間長且根據(jù)病毒最終轉(zhuǎn)陰(或最后一次陽性)作為隨訪終點(diǎn)的研究結(jié)果，可能存在一定的差異性。以病毒首次轉(zhuǎn)陰作為隨訪終點(diǎn)，Huang等[13]報(bào)道了一項(xiàng)納入迄今最大樣本(796例)的非重癥COVID-19患者的研究，病毒轉(zhuǎn)陰時(shí)間為13(9，18)d；Zhou等[14]報(bào)道金銀譚醫(yī)院和武漢肺部醫(yī)院2020年1月31日前出院的191例COVID-19患者，未區(qū)分重癥和非重癥患者，幸存者病毒轉(zhuǎn)陰時(shí)間為20(17，24)d；韓國一項(xiàng)納入21例非重癥COVID-19患者的臨床研究顯示，病毒轉(zhuǎn)陰時(shí)間為34 d(95%置信區(qū)間最少24 d)[15]。以病毒最終轉(zhuǎn)陰(或最后一次陽性)作為隨訪終點(diǎn)，Zhang等[16]報(bào)道5例普通型患者病毒轉(zhuǎn)陰時(shí)間43.6 d，個(gè)案報(bào)道顯示，病毒轉(zhuǎn)陰甚至可超過3個(gè)月[17]；Li等[18]報(bào)道18例無癥狀或輕癥狀患者，病毒轉(zhuǎn)陰時(shí)間為22.5 d，但是浙江135例非重癥患者病毒轉(zhuǎn)陰時(shí)間僅為13 d[7]。Fontana等[1]一項(xiàng)SARS-CoV-2病毒轉(zhuǎn)陰綜述，未區(qū)分病毒轉(zhuǎn)陰定義，非重癥患者呼吸道病毒轉(zhuǎn)陰時(shí)間為17.2 d。本研究所有患者未使用任何抗病毒藥物，結(jié)果提示非重癥患者病毒首次轉(zhuǎn)陰時(shí)間為19 d(范圍1～28 d)，治療期住院時(shí)間中位數(shù)21 d，留觀期檢測核酸陽性40例(45.5%)，病毒最終轉(zhuǎn)陰時(shí)間為28(19，45)d。與我院去年收治的野生株病毒轉(zhuǎn)陰時(shí)間比較，Delta變異株病毒轉(zhuǎn)陰時(shí)間更長[19]，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)留觀期間歇性病毒核酸陽性是一個(gè)常見現(xiàn)象，這提示達(dá)到治療期出院標(biāo)準(zhǔn)后，繼續(xù)留觀監(jiān)測核酸是必要的。

我們根據(jù)病毒首次轉(zhuǎn)陰時(shí)間是否超過2周，將患者分為早期轉(zhuǎn)陰組和晚期轉(zhuǎn)陰組，早期轉(zhuǎn)陰組N基因和Orf1a/b基因波谷更高，N基因和Orf1a/b基因波谷與病毒首次轉(zhuǎn)陰時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，具有中等預(yù)測病毒首次轉(zhuǎn)陰的價(jià)值(AUC=0.753和0.741)，這說明N基因和Orf1a/b基因Ct值越低(即病毒載量越高)，病毒首次轉(zhuǎn)陰時(shí)間越長；同時(shí)，病毒首次轉(zhuǎn)陰時(shí)間與最終轉(zhuǎn)陰時(shí)間正相關(guān)(r=0.353),上呼吸道病毒載量可能是影響病毒轉(zhuǎn)陰的重要因素。

SARS-CoV-2可激活先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[20]，LYM和EOS是參與病毒免疫清除的適應(yīng)性免疫細(xì)胞，重癥COVID-19患者LYM和EOS更低[21-22]，SARS-CoV-2不僅激活抗病毒免疫反應(yīng)，而且還可引起不受控制的炎癥反應(yīng)，重癥COVID-19患者體內(nèi)顯著的促炎細(xì)胞因子釋放，可導(dǎo)致LYM減少、LYM功能障礙等免疫細(xì)胞異常，COVID-19 患者的免疫發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)新的潛在療法奠定基礎(chǔ)[23]。本研究為非重癥患者，橫向比較，早期轉(zhuǎn)陰組基線時(shí)LYM更高，第1周LYM和EOS更高，SAA和CRP更低，基線LYM、第1周LYM、EOS、SAA、CRP均可用于預(yù)測病毒首次轉(zhuǎn)陰，然而從第2～4周，兩組SAA、CRP、LYM和EOS差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明病毒首次轉(zhuǎn)陰時(shí)間更長患者，早期免疫損傷及炎癥反應(yīng)更顯著。縱向比較，兩組患者基線LYM和EOS均更低，早期轉(zhuǎn)陰組第1周基本恢復(fù)，晚期轉(zhuǎn)陰組則逐漸回升，第2周基本恢復(fù)；早期轉(zhuǎn)陰組前2周SAA和CRP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，晚期轉(zhuǎn)陰組第1周SAA和CRP達(dá)峰值，第2周后逐漸恢復(fù)正常，這說明病毒首次轉(zhuǎn)陰時(shí)間短，機(jī)體免疫恢復(fù)更快；轉(zhuǎn)陰時(shí)間長患者第1周有顯著炎癥反應(yīng)，結(jié)合其N基因和Orf1a/b基因波谷更低，機(jī)體炎癥反應(yīng)可能與病毒載量峰值呈正相關(guān)?？傊《据d量、早期宿主炎癥、免疫損傷及免疫恢復(fù)可能是病毒轉(zhuǎn)陰的重要因素。探索病毒轉(zhuǎn)陰與病毒載量、機(jī)體炎癥、免疫反應(yīng)特點(diǎn)，可為探索新免疫療法的臨床研究提供理論依據(jù)，實(shí)現(xiàn)早期病毒轉(zhuǎn)陰。

性別、年齡和慢性基礎(chǔ)病是否影響SARS-CoV-2病毒轉(zhuǎn)陰，目前研究[1-5，18，24]結(jié)果不太一致，本研究顯示，非重癥患者Delta變異株病毒首次轉(zhuǎn)陰與性別、年齡、慢性基礎(chǔ)病不相關(guān)，病毒轉(zhuǎn)陰是一個(gè)復(fù)雜的過程，個(gè)體差異性較大。

最后，值得關(guān)注的是，呼吸道病毒核酸陽性的持續(xù)時(shí)間并不一定等于傳播的風(fēng)險(xiǎn)[25]。一般病毒傳播是由病毒復(fù)制決定的，呼吸道病毒核酸陽性患者可能是潛在的傳播源。然而，一些證據(jù)表明，晚期呼吸道核酸陽性COVID-19患者幾乎沒有傳染性，但仍然可以檢測到非傳染性殘余病毒RNA。韓國研究顯示，Ct值>30或癥狀出現(xiàn)13 d后，沒有培養(yǎng)到病毒生長[15]；Bullard等[26]報(bào)告表明Ct值>24或癥狀出現(xiàn)時(shí)間>8 d的樣本中沒有病毒生長；英國研究表明，在Ct值>35的樣本中病毒培養(yǎng)陽性率下降至8%，在癥狀出現(xiàn)后10 d下降至6%[27]；Gao等[25]推斷Ct值>35的患者幾乎沒有傳染性。遺憾的是，本研究未做病毒培養(yǎng)，因此不能辨別其是否具有傳染性，目前急需病毒學(xué)研究評估間歇性病毒核酸陽性患者是否具有傳染性，為制定隔離措施提供理論支持。

本研究具有局限性：本研究病例數(shù)較少，為單中心回顧性研究；本研究采用RT-PCR檢測病毒RNA，并非病毒培養(yǎng)，間歇性病毒核酸陽性是病毒片段還是活病毒是亟急解決的問題。

總之，本研究首次探討了非重癥SARS-CoV-2 Delta變異株病毒轉(zhuǎn)陰情況及病毒首次轉(zhuǎn)陰的影響因素，上呼吸道病毒轉(zhuǎn)陰是一個(gè)復(fù)雜且漫長的過程，病毒首次轉(zhuǎn)陰與病毒載量、機(jī)體免疫和炎癥有關(guān)，留觀期間歇性病毒核酸陽性是一個(gè)常見現(xiàn)象，其機(jī)制和傳染性尚不明確，期待病毒動(dòng)力學(xué)研究探索病毒轉(zhuǎn)陰奧秘并為隔離措施提供理論基礎(chǔ)。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：黃春明：研究設(shè)計(jì)、病例收集、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、論文撰寫；胡中偉：研究設(shè)計(jì)指導(dǎo)；詹遠(yuǎn)京：病例收集、論文修改。