柴胡皂苷d對(duì)蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干電生理特性的影響?

羅 林，徐婷婷，陳 衛(wèi)，楊春艷，張建武

川北醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637100

柴胡皂苷d（Saikosaponin d，SSd，C42H68O13）是從傘形科植物柴胡Bupleurum ChineseD C.和狹葉柴胡Bupleurum scozonerifoliumWilld.干燥根中提取的一類皂苷類單體成分，是柴胡主要化學(xué)指標(biāo)和生物活性成分之一［1］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，SSd具有抗腫瘤［2］、抗炎［3］、保肝［4］、免疫調(diào)節(jié)［5］、雌激素樣作用［6］等多種藥理作用，同時(shí)還有一定的毒性作用［7］，但SSd對(duì)外周神經(jīng)系統(tǒng)的影響及其機(jī)制報(bào)道較少。為進(jìn)一步完善SSd的作用機(jī)制，本研究從電生理學(xué)的角度探討SSd對(duì)蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位的影響，為臨床應(yīng)用提供一定的電生理實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取活躍、皮膚濕潤(rùn)、膚色均勻灰暗的中華蟾蜍40只，體質(zhì)量（50±5）g，雌雄兼用，由川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（川）2018-076。飼養(yǎng)條件：常規(guī)條件下飼養(yǎng)于川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 試劑與儀器SSd（CAS：20874-52-6，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），純度≥98%；標(biāo)準(zhǔn)任氏液（NaCl 6.5 g，KCl 0.14 g，CaCl20.12 g，NaHCO30.20 g，NaH2PO40.01 g，加蒸餾水至1000 mL，所用試劑均為化學(xué)純品，成都科龍化工試劑廠提供；BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；AC0033型神經(jīng)屏蔽盒（成都泰盟電子有限公司）；AC0047型刺激電極（成都泰盟電子有限公司）；引導(dǎo)電極（成都泰盟電子有限公司，AC0043）；常用蛙類手術(shù)器械：蛙足釘（成都泰盟電子有限公司，AC0012）、蛙板（成都泰盟電子有限公司，AC0014）；電子天平ES6000-1（沈陽(yáng)龍騰電子有限公司）；記錄顯示設(shè)備（聯(lián)想公司）；優(yōu)普純水/超純水制造系統(tǒng)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；加樣槍（芬蘭biohit）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試藥制備60 kg柴胡在60℃條件下，用丁柱工業(yè)甲醇提取3次。然后依次用二氯甲烷和正醇萃取，將所得2.1 kg正丁醇萃取物進(jìn)行硅膠層析，依次用12∶1的二氯甲烷∶甲醇及二氯甲烷∶甲醇∶水的溶劑系統(tǒng)按照極性由小到大進(jìn)行梯度洗脫，薄層層析合并得到9個(gè)組分。利用其制備高效液相色譜，采用80%甲醇對(duì)組分4（170 g）進(jìn)行反相制備（10 cm柱，流速280 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm），得到3個(gè)組分；用42%乙腈對(duì)組分3即CH-4-3（21 g）進(jìn)行反相制備純化（10 cm柱，流速280 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm），得到化合物1（18.11 g）。采用1H-NMR和13C-NMR對(duì)該化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，通過(guò)解析圖譜發(fā)現(xiàn)該化合物1與文獻(xiàn) 報(bào) 道 基 本 一 致［8］，故 鑒 定 該 化 合 物1為SSd。

1.3.2 分組及處理 預(yù)熱電子天平30 min后，精確稱量所取SSd，并按照所取質(zhì)量分別加入相應(yīng)任氏液配置成陽(yáng)性組所需試劑?；陬A(yù)實(shí)驗(yàn)的前提下，陽(yáng)性組按照SSd溶液的濃度分為SSd 18、36、72 μmol/L，對(duì)照組則選用同一來(lái)源的任氏液作為實(shí)驗(yàn)試劑。隨機(jī)選取制備好的蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干標(biāo)本分配至對(duì)照組及各陽(yáng)性組，運(yùn)用加樣槍準(zhǔn)確抽取200 μL相應(yīng)試劑，小心滴至刺激電極和引導(dǎo)電極之間的神經(jīng)干上，待藥物充分作用后，檢測(cè)動(dòng)作電位相關(guān)參數(shù)。每次給藥前進(jìn)行充分搖勻再用加樣槍抽取試劑，以防局部濃度不均導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差。

1.3.3 標(biāo)本制備 將蟾蜍進(jìn)行稱重，破壞其腦和脊髓，剪除軀干上部及內(nèi)臟，剝皮并分離左右腿，游離出3～5 cm的坐骨神經(jīng)干，盡量將神經(jīng)干周圍的組織剔除干凈，神經(jīng)干脊柱端和足端用棉線結(jié)扎。然后將制備好的標(biāo)本浸入任氏液中孵育10 min［9］。

1.4 觀察指標(biāo)分別將制備好的坐骨神經(jīng)干標(biāo)本置于神經(jīng)屏蔽盒的電極上，中樞段接刺激電極，外周端接引導(dǎo)電極，測(cè)定加藥前動(dòng)作電位的閾強(qiáng)度、振幅、傳導(dǎo)速度及不應(yīng)期。保持神經(jīng)干在電極上放置的位置不動(dòng)，在刺激電極和引導(dǎo)電極之間的神經(jīng)干上滴入相應(yīng)濃度的SSd溶液，蓋上神經(jīng)屏蔽盒蓋子以防止水分蒸發(fā)和電磁波干擾，用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)每隔5 min檢測(cè)動(dòng)作電位的相關(guān)值，分別檢測(cè)藥物作用后5、10、15、20 min的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)。

1.4.1 神經(jīng)干動(dòng)作電位閾強(qiáng)度測(cè)定 選擇BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目菜單下肌肉神經(jīng)實(shí)驗(yàn)欄中“閾強(qiáng)度與動(dòng)作電位的關(guān)系”，設(shè)置起始刺激強(qiáng)度為0.25 V，刺激強(qiáng)度增量為0.01 V，刺激間隔為1 s，程控記錄第1個(gè)動(dòng)作電位出現(xiàn)時(shí)的刺激強(qiáng)度即為閾強(qiáng)度。

1.4.2 神經(jīng)干動(dòng)作電位幅度的測(cè)定 調(diào)整刺激強(qiáng)度為1.5 V，刺激脈沖寬度為0.3 ms，單刺激，由一對(duì)引導(dǎo)電極引導(dǎo)出復(fù)合動(dòng)作電位，輸入BL-420生物信息采集及處理系統(tǒng)，采用系統(tǒng)的區(qū)間測(cè)量工具分別測(cè)量動(dòng)作電位上相頂點(diǎn)和下相最低點(diǎn)之間的幅度（mV）。

1.4.3 神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度的測(cè)定 測(cè)量第1對(duì)引導(dǎo)電極所測(cè)出的動(dòng)作電位上相頂點(diǎn)到第2對(duì)引導(dǎo)電極所測(cè)出的動(dòng)作電位上相頂點(diǎn)的時(shí)間（ms），同時(shí)直尺測(cè)量神經(jīng)屏蔽盒中第1對(duì)引導(dǎo)電極中點(diǎn)與第2對(duì)引導(dǎo)電極中點(diǎn)之間的距離（mm），據(jù)此計(jì)算動(dòng)作電位的傳導(dǎo)速度（m/s）。

1.4.4 神經(jīng)干動(dòng)作電位不應(yīng)期的測(cè)定 選擇BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目菜單下肌肉神經(jīng)欄中“神經(jīng)干不應(yīng)期的測(cè)定”。設(shè)置程控，雙刺激，啟示波間隔為10 ms，刺激逐漸減量，記錄每?jī)蓚€(gè)連續(xù)刺激中第2個(gè)動(dòng)作電位正相波消失時(shí)的波間隔時(shí)間為不應(yīng)期。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和管理分析，計(jì)量資料以±s表示，采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)干動(dòng)作電位閾強(qiáng)度3種濃度的SSd處理后均使得蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的閾強(qiáng)度不斷減小。與加藥前比較，18 μmol/L組在加藥后10 min出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），36 μmol/L組和72 μmol/L組在加藥后5 min即出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），并且隨著SSd作用時(shí)間的延長(zhǎng)，差異性愈加顯著（P＜0.01）；而任氏液組隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)并未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。表明不同濃度的SSd溶液均能使蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的閾強(qiáng)度減小，且藥物濃度越大，對(duì)動(dòng)作電位閾強(qiáng)度產(chǎn)生的影響越大；同時(shí)提示SSd對(duì)動(dòng)作電位閾強(qiáng)度的作用效果與作用時(shí)間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。見(jiàn)表1。

表1 各組蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位閾強(qiáng)度比較（±s） mV

表1 各組蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位閾強(qiáng)度比較（±s） mV

注：與同組加藥前比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

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2.2 神經(jīng)干動(dòng)作電位幅度3種濃度的SSd處理后均使得蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的幅度不斷增大。與加藥前相比，18 μmol/L組和36 μmol/L組在加藥后5 min出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），72 μmol/L組在加藥后5 min即出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01），并且隨著SSd作用時(shí)間的延長(zhǎng)，各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.001）；而任氏液組隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)并未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。表明不同濃度的位SSd溶液均能使蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電的幅度增大，并且藥物濃度越大，對(duì)動(dòng)作電位幅度產(chǎn)生的影響越大；同時(shí)提示SSd對(duì)動(dòng)作電位幅度的作用效果與作用時(shí)間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。見(jiàn)表2。

表2 各組蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位幅度比較（±s） mV

表2 各組蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位幅度比較（±s） mV

注：與同組加藥前比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001

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2.3 神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度3種濃度的SSd處理后均使得蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的傳導(dǎo)速度不斷增大。與加藥前相比，18 μmol/L組在加藥后20 min出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），36 μmol/L組在加藥后10 min出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），72 μmol/L組在加藥后10 min即出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），并且隨著SSd作用時(shí)間的延長(zhǎng)，各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.001）；而任氏液組隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)并未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。表明不同濃度的SSd溶液均能使蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的傳導(dǎo)速度增大，并且藥物濃度越大，對(duì)動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度產(chǎn)生的影響越大；同時(shí)提示SSd對(duì)動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度的作用效果與作用時(shí)間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。見(jiàn)表3。

表3 各組蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度比較（±s） m/s

表3 各組蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度比較（±s） m/s

注：與同組加藥前比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001

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2.4 神經(jīng)干動(dòng)作電位不應(yīng)期3種濃度的SSd處理后蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位的不應(yīng)期相較于加藥前有小幅度的縮短，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；任氏液組隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，與給藥前比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位不應(yīng)期比較（±s） m

表4 各組蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位不應(yīng)期比較（±s） m

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3 討論

近年來(lái)越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者投身于SSd的研究，SSd的抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等作用被逐漸發(fā)掘，涉及領(lǐng)域也不斷擴(kuò)展［10］。但柴胡皂苷對(duì)坐骨神經(jīng)干的藥理作用尚無(wú)報(bào)道，因此本研究就SSd對(duì)蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位的影響進(jìn)行了探討。神經(jīng)細(xì)胞興奮的標(biāo)志是產(chǎn)生動(dòng)作電位，動(dòng)作電位一旦爆發(fā)即以一定的幅值迅速沿細(xì)胞膜向周圍擴(kuò)布［11］。而動(dòng)作電位形成的離子基礎(chǔ)主要是Na+和K+，神經(jīng)細(xì)胞在靜息電位基礎(chǔ)上接受有效刺激后，Na+通道的通透性增大，Na+瞬間大量?jī)?nèi)流，出現(xiàn)去極化，當(dāng)去極化達(dá)到閾電位水平時(shí)，膜發(fā)生的去極化與Na+電導(dǎo)之間形成正反饋，使膜電位出現(xiàn)爆發(fā)性去極化，形成動(dòng)作電位陡峭的升支，隨后K+通道開(kāi)放，大量K+外流出現(xiàn)復(fù)極化，形成動(dòng)作電位的降支，兩者共同形成尖峰狀的峰電位。峰電位是動(dòng)作電位的主要部分，被視作動(dòng)作電位的標(biāo)志。因此神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位的能力與閾電位的水平有著必然聯(lián)系，而影響閾電位水平的主要因素是電壓門控鈉通道在細(xì)胞膜中的分布密度、功能狀態(tài)以及細(xì)胞外的Ca2+水平［12］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用SSd處理后的蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干其閾強(qiáng)度相較加藥前明顯減小，而且呈明顯的劑量依賴性。在實(shí)驗(yàn)中，本課題組嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)變量，選取來(lái)自同一總體的蟾蜍，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均采用標(biāo)準(zhǔn)任氏液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示任氏液作用于坐骨神經(jīng)干后并未引起統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而細(xì)胞膜上鈉通道的分布密度在短時(shí)間內(nèi)變化不大，因此可以認(rèn)為鈉通道的分布密度和細(xì)胞外的Ca2+水平的變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SSd僅通過(guò)作用于細(xì)胞膜鈉通道的功能狀態(tài)從而影響動(dòng)作電位的形成。故本研究結(jié)果推測(cè)SSd有可能通過(guò)與神經(jīng)細(xì)胞膜上多個(gè)靶點(diǎn)結(jié)合而改變細(xì)胞膜Na+通道的性狀，使Na+通道處于高敏狀態(tài)，細(xì)胞膜對(duì)Na+的通透性增大，故引起動(dòng)作電位的刺激閾強(qiáng)度降低。同時(shí)Na+通道處于高敏狀態(tài)時(shí)，Na+內(nèi)流量也會(huì)增加，從而導(dǎo)致動(dòng)作電位幅度增加［13］，這與本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也是相符的。神經(jīng)纖維上，動(dòng)作電位是以神經(jīng)沖動(dòng)的方式進(jìn)行傳導(dǎo)的。動(dòng)作電位的幅度增大后，興奮區(qū)與未興奮區(qū)形成的局部電流增強(qiáng)，神經(jīng)沖動(dòng)在神經(jīng)纖維上的傳導(dǎo)加快［14］，這與SSd作用后使坐骨神經(jīng)干傳導(dǎo)速度加快的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也是一致的。SSd的濃度越高，浸泡的時(shí)間越長(zhǎng)，Na+通道處于高敏狀態(tài)的數(shù)量就越多，以上現(xiàn)象也更明顯，這與實(shí)驗(yàn)所表現(xiàn)出的濃度依賴性和時(shí)間依賴性一致。

神經(jīng)細(xì)胞一次興奮后要經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的（絕對(duì)不應(yīng)期）恢復(fù)，才能爆發(fā)新的興奮。此恢復(fù)時(shí)間的長(zhǎng)短不僅取決于Na+-K+泵的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間，而且與電壓門控Na+，K+通道的開(kāi)放速度和開(kāi)放時(shí)的電導(dǎo)率有關(guān)［15］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，運(yùn)用SSd作用于坐骨神經(jīng)干后能小幅度的縮短動(dòng)作電位的不應(yīng)期，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明SSd可能不具備對(duì)上述途徑的藥理作用，亦可能是限于設(shè)備精度原因，本課題組無(wú)法精確測(cè)量動(dòng)作電位不應(yīng)期的變化，出現(xiàn)了假陰性結(jié)果。

綜上所述，筆者認(rèn)為SSd減小蟾蜍離體坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位的閾強(qiáng)度，增大其動(dòng)作電位幅度，加快神經(jīng)干的傳導(dǎo)速度可能是通過(guò)與神經(jīng)細(xì)胞膜上多個(gè)靶點(diǎn)結(jié)合而改變細(xì)胞膜Na+通道的性狀，使Na+通道處于高敏狀態(tài)，增大了細(xì)胞膜對(duì)Na+的通透性有關(guān)，但其具體機(jī)制仍有待于更進(jìn)一步研究。