蘿卜硫素對急性低溫暴露鼠骨骼肌Nrf2介導(dǎo)的抗氧化能力的影響

徐 磊，賈 杰，江秉澤，張 纓*

1北京體育大學(xué)運動與體質(zhì)健康教育部重點實驗室；2北京體育大學(xué)運動人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084

骨骼肌是低溫環(huán)境下機體產(chǎn)熱的重要器官。低溫環(huán)境下骨骼肌以戰(zhàn)栗性與非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱來維持體溫穩(wěn)態(tài)[1]，此過程需要水解大量的ATP，將其化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)闄C體所需的熱能[2]。骨骼肌在低溫環(huán)境下主要以提高脂肪酸氧化分解速率滿足產(chǎn)熱需求[3]，而線粒體脂肪酸氧化速率的增加伴隨著活性氧(reactive oxygen species，ROS)的加速產(chǎn)生[4]。已有研究表明，急性或長期低溫暴露使老鼠的靜息代謝速率和骨骼肌ROS水平增加[5,6]。而ROS水平的增加會引起骨骼肌蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)的氧化損傷，進而影響骨骼肌的運動表現(xiàn)與恢復(fù)[7]。因此，及時清除低溫環(huán)境下骨骼肌產(chǎn)生的大量ROS，提高骨骼肌的抗氧化能力，對維持其正常生理功能至關(guān)重要。

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)介導(dǎo)的抗氧化防御系統(tǒng)，在維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中起著非常重要的作用[8]。當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激時，胞質(zhì)中的Nrf2則不會被其負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白——Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(epoxy chloropropane Kelch sample related protein-1，Keap1)泛素化降解，進而入核與眾多基因啟動子上的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合，上調(diào)大多數(shù)的抗氧化酶和II期解毒酶的表達，對機體的氧化應(yīng)激刺激起保護作用[9]。然而，研究發(fā)現(xiàn)，急性或長期低溫暴露使鼠心臟、肝臟及肺組織器官中Nrf2mRNA及其蛋白表達顯著降低[10-12]，表明在低溫環(huán)境下可能抑制組織器官Nrf2的表達。但急性低溫暴露是否也同樣抑制骨骼肌Nrf2表達及其抗氧化能力？國內(nèi)外未見報道。

蘿卜硫素(sulforaphane，SFN)在十字花科植物中含量豐富，被公認(rèn)為是Nrf2的特異激活劑[13]。因此，本研究試圖首先觀察1和3 h不同時長的急性低溫暴露，對小鼠骨骼肌Nrf2和抗氧化酶表達及抗氧化能力的影響；進而在此基礎(chǔ)上，進一步探討在低溫暴露前給予SFN，對骨骼肌Nrf2介導(dǎo)的抗氧化酶系統(tǒng)和谷胱甘肽氧化還原穩(wěn)態(tài)的作用。本研究將為探究SFN作為低溫環(huán)境下運動營養(yǎng)補充品的可能性提供前期實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

70只8周齡健康雄性C57BL/6N小鼠分兩批購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號為：SCXK(京)2016-0006。動物購進后適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，飼養(yǎng)條件：每籠飼養(yǎng)3～4只，飼養(yǎng)溫度和濕度分別維持在25 ℃左右和65%左右，12 h明暗循環(huán)，整個飼養(yǎng)過程中動物自由進食和飲水。該動物實驗經(jīng)過了北京體育大學(xué)運動科學(xué)實驗倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：2021042A)，實驗嚴(yán)格遵循3R原則，給予人道關(guān)懷。

1.2 實驗藥物與試劑

蘿卜硫素(中國深圳市福山生物科技有限公司)；活體組織氧化應(yīng)激ROS高質(zhì)熒光測定試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，貨號：GMS10016.3 v.A)；總抗氧化能力檢測試劑盒、還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽含量檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：BC1315、BC1175、BC1185)；RT-PCR試劑盒和SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO公司，貨號：FSQ-101、QPK-201)；RT-qPCR引物：谷胱甘肽過氧化酶1(Gpx1)、血紅素加氧酶(Hmox1)、過氧化氫酶(Cat)、超氧化物歧化酶1(Sod1)、醌氧化還原酶1(Nqo1)、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(Gclc)、谷胱甘肽還原酶(Gsr)、18s(Qiagen公司，貨號：QT01195936、QT00159915、QT01058106、QT001650 39、QT00094367、QT00130543、QT01758232、QT02448075)，Nrf2、谷氨酰半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基(Gclm)和谷胱甘肽合成酶(Gss)的引物在Invitrogen公司合成，具體引物序列見表1；RIPA裂解液(碧云天公司，貨號：P0013B)；Pierce蛋白酶和磷酸酶抑制劑微型片劑、BCA試劑盒、Bolt 4%-12% Bis-Tris Plu凝膠(ThermoFisher Scientific公司，貨號：A32961、23225、NW04125BOX)；一抗：Nrf2、GPX1、SOD1、NQO1、β-actin(Santa Cruz Biotechnology公司，貨號：sc-365949、sc-22145、sc-11407、sc-32793、sc-47778)；HMOX1(Abcam公司，貨號：ab13248)；CAT(Proteintech公司，貨號：66765-1-Ig)。

表1 Nrf2、Gclm和Gss的引物序列Table 1 The primer sequence of Nrf2,Gclm and Gss

1.3 儀器

快速組織破碎儀(美國NEXT ADVANCE公司，型號：BBY24M)；iBlot2轉(zhuǎn)膜儀(ThermoFisher Scientific公司，型號：IB23001)；搖床(海門其林貝爾公司，型號：TS-100)；低溫離心機(德國Epperndorf公司，型號：Centrifuge 5424R)；熒光定量PCR儀(ThermoFisher Scientific公司，型號：ABI7500)；多功能微孔板檢測儀(美國Bio-Tek公司，型號：Bio-Tek SynergyTMH1)；Bio-Rad凝膠成像分析儀(美國伯樂公司，型號：BIO-RADXR)。

1.4 動物分組及干預(yù)

首先，30只8周齡健康雄性C57BL/6N小鼠隨機分為3組，每組10只：常溫對照組(0 h組)、低溫暴露1 h組(1 h組)和低溫暴露3 h組(3 h組)。常溫對照組置于25 ± 1 ℃的室溫環(huán)境，低溫暴露組則分別置于4 ± 1 ℃冷庫1、3 h，在此期間各組均能自由飲水和進食。

其次，40只8周齡健康雄性C57BL/6N小鼠隨機分為4組，每組10只：磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)常溫對照組(PBS+Con)、PBS低溫暴露3 h組(PBS+Cold)、SFN常溫對照組(SFN+Con)和SFN低溫暴露3 h組(SFN+Cold)。小鼠在進行急性溫度干預(yù)前72、48、24和3 h這4個時間點通過腹腔注射SFN或等體積PBS[14]。SFN溶解于PBS中，每只小鼠每次的注射劑量為25 mg/kg和0.2 mL。常溫對照組置于25 ± 1 ℃的室溫環(huán)境，低溫暴露組則置于4 ± 1 ℃冷庫3 h，在此期間各組均能自由飲水和進食。

1.5 取材

急性低溫暴露結(jié)束后即刻將小鼠頸椎脫臼處死，迅速取小鼠腿部的腓腸肌和股四頭肌，稱重，編號，投入液氮，隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存待用。

1.6 骨骼肌ROS水平測定

骨骼肌ROS水平采用活體組織氧化應(yīng)激ROS高質(zhì)熒光測定試劑盒測定。取各組50 mg腓腸肌置于提前加入GENMED清洗液的勻漿管并清洗，棄去清理液，用濾紙吸干。然后加入GENMED稀釋液，用剪刀將組織剪碎，勻漿，并用BCA法測蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度規(guī)定上樣量為10 μL和50 μg蛋白，隨后在避光酶標(biāo)板相應(yīng)孔內(nèi)加入190 μL的GENMED染色工作液，37 ℃避光孵育20 min，激發(fā)波長490 nm，散發(fā)波長520 nm檢測熒光強度值。計算與空白熒光強度差值，以表示該孔ROS水平。

1.7 骨骼肌總抗氧化能力測定

骨骼肌總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)采用T-AOC檢測試劑盒測定。先按照說明書繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再取50 mg股四頭肌組織放入提前加入預(yù)冷提取液的勻漿管內(nèi)勻漿，后離心5 min(4 ℃，10 000 rpm)，取上清用BCA法測蛋白濃度。同時按照說明書，用96孔板測定空白管和測定管在593 nm處的吸光值，計算差值并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到各組中Fe2+的濃度，最后按照說明書提供的按蛋白濃度計算的公式得到各組的T-AOC。

1.8 骨骼肌還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽含量及兩者比值

骨骼肌還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)含量分別采用還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽含量檢測試劑盒測定。取各組股四頭肌稱重并記錄，再按照說明書繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再將稱好的股四頭肌放入提前加入預(yù)冷試劑一的勻漿管內(nèi)勻漿，后離心10 min(4 ℃，8 000 rpm)，轉(zhuǎn)移上清置于4 ℃待測。按照說明書，用96孔石英板測定空白管和樣本管在412 nm處的吸光值，計算差值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線并按照說明書提供的按樣本質(zhì)量計算的公式得到各組的GSH含量。再按照說明書，用96孔石英板分別測定空白管和樣本管在412 nm處30 s與150 s的吸光值，再將樣本管兩個時間點吸光度差值減去空白管兩個時間點吸光度差值，最后將這個差值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線并按照說明書提供的按樣本質(zhì)量計算的公式得到各組的GSSG含量。

1.9 實時熒光定量PCR

取50 mg腓腸肌加入0.8 mL預(yù)冷Trizol中，剪碎，勻漿后，依次采用氯仿、異丙醇、75%酒精進行分離提純總RNA，用紫外分光光度計測定總RNA的純度和濃度，采用RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用PCR擴增儀擴增。隨后采用ABI7500熒光定量PCR儀，以由SYBR Green Realtime PCR Master Mix、引物、cDNA模板和dd H2O構(gòu)成的20 μL反應(yīng)體系進行實時熒光定量PCR檢測。使用ABI7500 PCR儀自帶的軟件對實時熒光定量CT值進行讀取，用比較CT法對目的基因表達結(jié)果進行相對定量。具體計算公式為：目的基因=2-△△CT。

1.10 Western blot

按照0.05 g Pierce蛋白酶和磷酸酶抑制劑微型片劑溶于10 mL RIPA裂解液來配置蛋白提取液。取50 mg腓腸肌組織加入含有勻漿珠和1 mL蛋白提取液的勻漿管中，并充分勻漿，隨后置于冰上靜置30 min，再離心30 min(4 ℃，12 000 rpm)，最后提取上清。利用BCA試劑盒測定組織總蛋白濃度，并根據(jù)蛋白濃度與上樣蛋白量20 μg計算上樣體積。電泳時采用Bolt 4%～12% Bis-Tris Plu凝膠分離目的蛋白，隨后采用iBlot2轉(zhuǎn)膜儀進行轉(zhuǎn)膜。5% BSA封閉1 h，而后加入一抗并置于4 ℃搖床過夜。4 ℃孵育過夜后，用1×TBST洗膜3次，每次10 min。加入相應(yīng)二抗，置于搖床室溫孵育1 h。再用1×TBST洗膜3次，每次10 min。最后用Bio-Rad凝膠成像分析儀和Image Lab軟件進行條帶檢測和灰度值分析。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。采用單因素方差分析和雙因素方差分析對數(shù)據(jù)進行分析，P<0.05和P<0.01分別代表具有顯著性和非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同時長急性低溫暴露對小鼠骨骼肌Nrf2介導(dǎo)的抗氧化酶mRNA轉(zhuǎn)錄水平和ROS水平的影響

由圖1可知，與0 h組相比，3 h組小鼠骨骼肌Nrf2mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈下降趨勢，Gpx1、Hmox1、Cat和Nqo1mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P<0.05)，且ROS水平顯著增加(P<0.05)，而1 h組并無變化。與1 h組相比，3 h組小鼠骨骼肌Nrf2、Gpx1、Cat、Sod1和Nqo1mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P<0.05)，且ROS水平顯著增加(P<0.01)。

圖1 不同時長急性低溫暴露對小鼠骨骼肌Nrf2介導(dǎo)的抗氧化酶mRNA轉(zhuǎn)錄水平和ROS水平的影響Fig.1 Effects of different time acute cold exposure on the mRNA transcription of antioxidant enzymes mediated by Nrf2 and ROS level in mice skeletal muscle注：與0 h組相比，*P <0.05，**P <0.01；與1 h組相比，#P <0.05，##P <0.01。Note:Compared with 0 h group,*P <0.05,**P <0.01;Compared with 1 h group,#P <0.05,##P <0.01.

2.2 SFN對急性低溫暴露小鼠骨骼肌Nrf2表達、ROS水平和T-AOC的影響

由圖2可知，與PBS+Con組相比，PBS+Cold組小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表達呈降低趨勢，且T-AOC水平顯著降低(P<0.01)，而ROS水平呈增加趨勢。與PBS+Cold組相比，SFN+Cold組小鼠骨骼肌Nrf2mRNA及其蛋白表達和T-AOC顯著增加(P<0.05)，而ROS水平顯著降低(P<0.05)

圖2 SFN對急性低溫暴露小鼠骨骼肌T-AOC、ROS水平和Nrf2表達的影響Fig.2 Effects of SFN on T-AOC,ROS level and Nrf2 expression in skeletal muscle of mice exposed to acute cold注：與PBS+Con組相比，**P <0.01；與PBS+Cold組相比，#P <0.05。Note:Compared with PBS+Con group,**P <0.01;Compared with PBS+Cold group,#P <0.05.

2.3 SFN對急性低溫暴露小鼠骨骼肌谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)的影響

由圖3可知，與PBS+Con組相比，PBS+Cold組小鼠骨骼肌GSSG含量和GSH/GSSG分別顯著增加和降低(P<0.05)；而SFN+Con組小鼠骨骼肌GssmRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增加(P<0.05)，且GSH含量顯著降低(P<0.01)。與PBS+Cold組相比，SFN+Cold組小鼠骨骼肌Gclm和GssmRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增加(P<0.05)，且GSH含量顯著降低(P<0.01)，GSSG含量和GSH/GSSG分別顯著降低和增加(P<0.01)。

圖3 SFN對急性低溫暴露小鼠骨骼肌谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)的影響Fig.3 Effect of SFN on glutathione antioxidant system in skeletal muscle of mice exposed to acute cold注：與PBS+Con組相比，*P <0.05，**P <0.01；與PBS+Con或PBS+Cold組相比，#P <0.05，##P <0.01。Note:Compared with PBS+Con group,*P <0.05,**P <0.01;Compared with PBS+Con or PBS+Cold group,#P <0.05,##P <0.01.

2.4 SFN對急性低溫暴露小鼠骨骼肌Nrf2介導(dǎo)的抗氧化酶mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

由圖4可知，與PBS+Con組相比，PBS+Cold組小鼠骨骼肌Gpx1、Hmox1、Cat、Sod1和Nqo1mRNA轉(zhuǎn)錄水平均呈降低趨勢。與PBS+Cold組相比，SFN+Cold組小鼠骨骼肌Gpx1、Hmox1、Cat、Sod1和Nqo1mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著增加(P<0.01)。

圖4 SFN對急性低溫暴露小鼠骨骼肌Nrf2介導(dǎo)的抗氧化酶mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.4 Effect of SFN on the mRNA transcription of antioxidant enzymes mediated by Nrf2 in skeletal muscle of mice exposed to acute cold注：與PBS+Cold組相比，##P <0.01。Note:Compared with PBS+Cold group,##P <0.01.

2.5 SFN對急性低溫暴露小鼠骨骼肌Nrf2介導(dǎo)的抗氧化酶蛋白表達的影響

由圖5可知，與PBS+Con組相比，PBS+Cold組小鼠骨骼肌HMOX1和CAT蛋白表達顯著降低(P<0.05)。與PBS+Cold組相比，SFN+Cold組小鼠骨骼肌HMOX1和SOD1蛋白表達顯著增加(P<0.05)。

圖5 SFN對急性低溫暴露小鼠骨骼肌Nrf2介導(dǎo)的抗氧化酶蛋白表達的影響Fig.5 Effect of SFN on the protein expression of antioxidant enzymes mediated by Nrf2 in skeletal muscle of mice exposed to acute cold注：與PBS+Con組相比，*P <0.05；與PBS+Cold組相比，#P <0.05。Note:Compared with PBS+Con group,*P <0.05;Compared with PBS+Cold group,#P <0.05.

3 討論與結(jié)論

Nrf2是維持骨骼肌氧化還原穩(wěn)態(tài)的核心調(diào)控因子[15]。已有研究報道，低溫暴露抑制心臟、肝臟及肺等組織器官Nrf2表達，可導(dǎo)致這些器官ROS大量產(chǎn)生而無法被清除[10-12]。然而，急性低溫暴露對骨骼肌Nrf2表達及其抗氧化能力的影響，目前未見報道。因此，本研究首先探討1和3 h低溫暴露對骨骼肌Nrf2介導(dǎo)的抗氧化系統(tǒng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 h低溫暴露小鼠骨骼肌Nrf2mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，而ROS水平顯著升高。后續(xù)的實驗結(jié)果同樣顯示，與PBS+Con組相比，PBS+Cold組小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表達呈降低趨勢，且T-AOC水平顯著降低，而ROS水平呈增加趨勢。由此推測，3 h低溫暴露可能抑制了小鼠骨骼肌Nrf2的表達，降低其抗氧化能力。

3 h低溫暴露使骨骼肌抗氧化能力降低，可能與Nrf2介導(dǎo)的抗氧化酶表達和谷胱甘肽氧化還原穩(wěn)態(tài)受到抑制有關(guān)。已有研究報道，3 h急性低溫暴露可使小鼠腎臟、肺組織以及棕色脂肪SOD1表達顯著下降[16]。間歇性低溫暴露(每天8 h，共3天)大鼠肺組織GPX1活性和HMOX1蛋白表達顯著降低[12]。長期低溫暴露(每天4 h，每周6天，共2周)小鼠腦組織SOD1活性及CAT蛋白表達顯著下降[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與0和1 h組相比，3 h組小鼠骨骼肌抗氧化酶基因(Gpx1、Hmox1、Cat、Sod1、Nqo1)mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。后續(xù)的實驗結(jié)果同樣顯示，與PBS+Con組相比，PBS+Cold組小鼠骨骼肌抗氧化酶基因(Gpx1、Hmox1、Cat、Sod1、Nqo1)mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈降低趨勢，且HMOX1和CAT蛋白表達顯著降低。由此可知，3 h低溫暴露可能抑制了Nrf2介導(dǎo)的抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄、翻譯，從而影響骨骼肌的抗氧化能力。另外有研究表明，急性低溫暴露可使人紅細(xì)胞中的GSSG含量和GSH/GSSG的比率降低[18]以及大鼠肝臟和胃組織的GSH含量減少[19]。本研究結(jié)果顯示，與PBS+Con組相比，PBS+Cold組小鼠骨骼肌GSSG含量和GSH/GSSG比值分別顯著增加和降低，而GSH含量變化不大。表明GSSG的堆積可能是GSH/GSSG比值降低的主要原因。

SFN對Nrf2的特異性激活效應(yīng)已得到了廣泛的證實。研究發(fā)現(xiàn)，12周的SFN飲食干預(yù)激活了老年小鼠趾長伸肌Nrf2調(diào)控的抗氧化酶系統(tǒng)，提高老年小鼠肌肉力量和運動耐力[20]。此外，大鼠在力竭運動前3天腹腔注射SFN，其血漿乳酸脫氫酶和肌酸磷酸激酶活性降低，并且股外側(cè)肌Nrf2及抗氧化酶(NQO1、GST、GSR)蛋白表達及活性提高，且運動至力竭的時間和距離增加[21]。以上研究結(jié)果表明，SFN激活Nrf2對其介導(dǎo)的抗氧化能力和運動耐力的提高有著重要作用。因此，為改善3 h低溫暴露過程中骨骼肌抗氧化能力的降低，我們在小鼠3 h低溫暴露前給予SFN補充。實驗結(jié)果顯示，SFN+Cold組與PBS+Cold組小鼠相比，其骨骼肌Nrf2mRNA及其蛋白表達和T-AOC顯著增加，且ROS水平顯著降低。提示，SFN激活Nrf2可提高3 h低溫暴露骨骼肌的T-AOC，消除過量的ROS，對維持骨骼肌的氧化還原穩(wěn)態(tài)有著積極的作用。

補充SFN提高低溫暴露小鼠骨骼肌抗氧化能力，與SFN激活Nrf2介導(dǎo)的抗氧化酶系統(tǒng)密切相關(guān)。Nrf2調(diào)控的內(nèi)源性抗氧化酶是清除ROS的主要執(zhí)行者。例如，SOD1催化超氧陰離子自由基歧化生成氧氣和過氧化氫；CAT可將過氧化氫歧化為水和氧氣；GPX1以GSH為底物催化過氧化氫或有機過氧化物生成水和相應(yīng)的醇；NQO1催化醌發(fā)生雙電子還原反應(yīng)形成氫醌，并促進醌的排泄，防止醌通過單電子還原反應(yīng)產(chǎn)生ROS；HMOX1催化有毒的游離血紅素分解生成具有抗氧化損傷功能的膽綠素、CO和亞鐵離子[22]。本研究結(jié)果顯示，在3 h低溫暴露前給予SFN，我們發(fā)現(xiàn)SFN+Cold組小鼠與PBS+Cold組相比，骨骼肌抗氧化酶基因(Gpx1、Hmox1、Cat、Sod1、Nqo1)mRNA轉(zhuǎn)錄水平和HMOX1、SOD1蛋白表達顯著增加。以上結(jié)果表明，SFN激活Nrf2增強這些抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯。

另外，補充SFN提高低溫暴露小鼠骨骼肌抗氧化能力，除了抗氧化酶表達增強外，也與SFN激活Nrf2介導(dǎo)的谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)密切相關(guān)。谷胱苷肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽，是生物體抗氧化防御系統(tǒng)中重要的小分子活性寡肽[23]。細(xì)胞中谷胱甘肽主要以GSH的形式存在，其分子中半胱氨酸的活性巰基可提供電子給ROS，而后GSH轉(zhuǎn)化生成穩(wěn)定的二聚體GSSG，以阻止ROS持續(xù)地?fù)寠Z電子，使蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸免受氧化損傷，進而維持細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)[24]。機體內(nèi)GSH的生成主要通過合成和還原兩種途徑。首先，谷氨酸和半胱氨酸在GCLC與GCLM的催化下生成谷氨酰半胱氨酸，隨后谷氨酰半胱氨酸與甘氨酸在GSS的催化下生成GSH；其次，GSSG在NADPH和GSR的作用下可被還原為GSH[25]。因此，Gclc、Gclm、Gss和Gsr是調(diào)控生成GSH的關(guān)鍵酶基因，并且是Nrf2下游靶基因[26]。我們發(fā)現(xiàn)，給予SFN補充后，SFN+Cold組小鼠與PBS+Cold組相比，骨骼肌谷胱甘肽合成酶基因Gclm、Gss、GsrmRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，且GSH和GSSG含量顯著降低。推測，這可能是急性低溫應(yīng)激，SFN補充可增強GSH的從頭合成和還原途徑，但GSH在急性低溫暴露引起大量ROS產(chǎn)生的消除中發(fā)揮重要作用，最終造成了GSH的大量消耗。而從評估機體氧化還原平衡的關(guān)鍵指標(biāo)GSH/GSSG比值上看，SFN+Cold組的GSH/GSSG顯著提高。

綜上，本研究表明3 h急性低溫暴露抑制了Nrf2介導(dǎo)的抗氧化作用。而低溫暴露前給予蘿卜硫素，則激活了Nrf2介導(dǎo)的抗氧化酶和谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)，增強了骨骼肌抗氧化能力。