化學(xué)模式識別結(jié)合HPLC指紋圖譜的僵蠶質(zhì)量評價研究

王 梅，萬子玉，陳 輝，張德林，喻 文，李 敏*，肖 禾

1成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611137；2四川廣元岷江中藥材種植有限責(zé)任公司，廣元 628000

僵蠶為臨床常用大宗動物藥之一，主要用于治療肝風(fēng)夾痰，驚癇抽搐，小兒急驚，破傷風(fēng)等疾病[1]，其來源為蠶蛾科昆蟲家蠶BombyxmoriLinnaeus 4～5齡的幼蟲感染白僵菌Beauveriabassiana(Bals.)Vuillant 而致死的干燥體。化學(xué)研究表明其主要活性成分為蛋白質(zhì)、氨基酸類、黃酮類等成分[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明僵蠶富蛋白提取物具有抗癲癇[3]、免疫調(diào)節(jié)及抑制E.G7荷瘤小鼠的腫瘤生長有增強(qiáng)的保護(hù)作用[4]、促進(jìn)MPTP誘導(dǎo)的帕金森病小鼠的運(yùn)動受損的恢復(fù)，防止多巴胺的耗竭等等。

作為食性單一的家蠶，其僅以桑為食的特點(diǎn)決定了家蠶體內(nèi)對桑葉主要的黃酮類成分的吸收、轉(zhuǎn)化和代謝的豐富多樣。研究表明白僵菌感染家蠶后，在其體內(nèi)對黃酮類成分進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化，例如將槲皮素和山奈酚等黃酮類物質(zhì)進(jìn)行4-O-甲基葡萄糖苷化反應(yīng)轉(zhuǎn)化成槲皮素-7-O-β-D-4-O-甲基葡萄糖苷和山奈酚-7-O-β-D-4-O-甲基葡萄糖苷等[4]。Xing等[5]研究發(fā)現(xiàn)，隨著僵死時間的延長，其體內(nèi)黃酮化合物的含量和轉(zhuǎn)化也不同，并推測出槲皮素-7-O-β-D-4-O-甲基葡萄糖苷和山奈酚-7-O-β-D-4-O-甲基葡萄糖苷可作為其質(zhì)量控制指標(biāo)之一。由此，黃酮類化合物可作為僵蠶質(zhì)量評價的重要指標(biāo)。

指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別是評價中藥材質(zhì)量的有效手段，已廣泛應(yīng)用于中藥材、中藥飲片、配方顆粒等的質(zhì)量評價[6-8]。目前針對僵蠶開展的相關(guān)指紋圖譜研究多樣，包括紫外指紋、紅外指紋[9]、HPLC[10,11]、HPCE[12]以及蛋白指紋圖譜[13,14]等，其成分類別涵蓋了水溶性成分、脂溶性成分、醇溶性成分等。但均存在分離效果不佳，指認(rèn)峰較少的問題，難以表征其質(zhì)量特征。有研究者表明川產(chǎn)僵蠶質(zhì)較優(yōu)[15]，白僵菌素含量較于廣西、云南、浙江等產(chǎn)地高[16,17]。雖然目前針對僵蠶化學(xué)成分和質(zhì)量控制已有部分研究報道，但因其成分復(fù)雜、含量較低，尚無較好的質(zhì)量控制手段。因此，本研究采用高效液相色譜法建立20批次不同產(chǎn)地的僵蠶藥材指紋圖譜，并結(jié)合相似度分析、聚類分析、主成分分析等化學(xué)識別模式展開區(qū)分研究，并參照《中國藥典》2020年版一部僵蠶項(xiàng)下要求測定其水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物，采用課題組前期方法測定有效成分白僵菌素含量，旨在綜合評價不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量，為僵蠶藥材質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)完善提供科學(xué)依據(jù)，同時為其他藥材的研究提供借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200 HPLC高效液相色譜儀；BP-121s精密電子天平(十萬分之一，浙江精密儀器有限公司)；BS-200S-WEI精密電子天平(千分之一，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與材料

對照品：蘆丁(批號：100080-20070，中國食品藥品檢定研究院)；金絲桃苷(批號：111521-200303，中國食品藥品檢定研究院)；槲皮素(批號：100081-200907，中國食品藥品檢定研究院)；山奈酚(批號：MUST-16102605，成都曼思特生物科技有限公司)；紫云英苷(PS1099-0010MG，成都普斯生物科技有限公司)；白僵菌素(批號：L280Q50，北京百靈威科技有限公司)純度均大于98%。

乙腈、磷酸均為色譜純；甲醇為分析純；水為超純水。

20批僵蠶藥材信息見表1。經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李敏教授鑒定為蠶蛾科昆蟲家蠶BombyxmoriLinnaeus 4～5齡的幼蟲感染(或人工接種)白僵菌Beauveriabassiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥體。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC指紋圖譜建立

2.1.1 樣品制備

取僵蠶粉末(過四號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取(功率250 W，頻率100 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾即得。

2.1.2 對照品溶液制備

取蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成混合對照品溶液，即得。

2.1.3 色譜條件

色譜柱為 Insertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)；柱溫30 ℃；檢測波長為365 nm；進(jìn)樣量10 μL；流速為0.8 mL/min；梯度洗脫程序：0～10 min(10%→20%A)；10～30 min(20%→35%A)；30～35 min(35%→95% A)；35～55 min(95%A)；55～60 min(95%→10%A)。

2.2 指紋圖譜的方法學(xué)考察

2.2.1 精密度考察

取同一份僵蠶粉末，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄液相色譜圖。以蘆丁為參照峰，計算主要共有色譜峰的相對保留時間的RSD的范圍為0.12%～1.56%，相對峰面積RSD范圍為0.36%～1.12%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性

取同一份僵蠶樣品，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行檢測，記錄液相色譜圖。結(jié)果表明，僵蠶主要色譜峰的相對保留時間的RSD的范圍為0.23%～1.35%，共有峰的峰面積RSD范圍為0.61%～1.27%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3 重復(fù)性考察

取同一份僵蠶樣品，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，僵蠶主要色譜峰的相對保留時間的RSD的范圍為0.05%～1.12%，共有峰的峰面積RSD范圍為0.08%～1.45%，說明該方法重現(xiàn)性好。

2.3 指紋圖譜的生成

20批僵蠶藥材按照樣品制備方法制備，再按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄液相色譜圖。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2012版)，以S1為參照圖譜，采用中位數(shù)法，時間窗寬度為0.1 min，建立對照圖譜，運(yùn)用多點(diǎn)校正Mark峰匹配，建立20批僵蠶藥材的指紋圖譜，結(jié)果見圖1。

圖1 20批僵蠶藥材指紋圖譜Fig.1 Fingerprint of 20 batches Bombyx Batryticatus

2.3.1 共有峰的指認(rèn)

從20批僵蠶藥材中標(biāo)定了9個共有峰，通過與對照品比對，指認(rèn)出5個成分，分別是1號峰為蘆丁，2號峰為金絲桃苷，4號峰為紫云英苷，6號峰為槲皮素，7號峰為山奈酚?；旌蠈φ掌啡芤旱腍PLC圖譜見圖2。

圖2 對照品指認(rèn)圖Fig.2 Reference standards identification of fingerprint

2.3.2 相似度分析

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2012版)軟件建立20批僵蠶藥材的指紋圖譜，其相似度評價結(jié)果見表2。結(jié)果顯示相較于對照指紋圖譜，所有樣品相似度在0.92～0.99之間，均大于0.90，不同產(chǎn)區(qū)藥材相似度均較好。

表2 20批僵蠶藥材相似度結(jié)果Table 2 Similarity evaluation results of 20 batches of samples

2.3.3 聚類分析

以5個指認(rèn)共有峰峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS 22.0軟件，采用平均聯(lián)接法，選擇平方歐氏距離為測度對其進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。聚類分析結(jié)果見圖3，當(dāng)判別距離為7.5時，可將其分為3類。其中，來自四川廣元產(chǎn)區(qū)的樣品S1～S4可聚為一類，來自四川省中藥飲片有限責(zé)任公司的樣品S5～S11可聚為一類，來自不同藥材市場的可聚為一類。說明不同廠家生產(chǎn)的藥材質(zhì)量有差異，且同一產(chǎn)區(qū)質(zhì)量相對穩(wěn)定，而市場流通的僵蠶藥材來源相似，可能主要為自然染病僵蠶或質(zhì)量差異較大。

續(xù)表2(Continued Tab.2)

圖3 20批僵蠶藥材的聚類分析譜系圖Fig.3 Cluster family correlationgship of 20 batches of samples

2.3.4 主成分分析(PCA)

利用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，由特征值大于1且貢獻(xiàn)率大于70%的標(biāo)準(zhǔn)來看，前2個特征值均大于1(見圖4)，累計貢獻(xiàn)率大于85%，即提取的2個主成分包含了9個共有成分的89.221%的信息，符合主成分分析條件，結(jié)果見表3。采用SIMCA 14.1軟件，以20批次僵蠶樣品的共有峰峰面積為數(shù)據(jù)陣，對不同產(chǎn)區(qū)的藥材進(jìn)行主成分分析，得分圖如圖5所示，與聚類分析結(jié)果一致。因此，在指紋圖譜的基礎(chǔ)上，利用聚類分析和主成分分析可以進(jìn)一步對不同產(chǎn)區(qū)藥材進(jìn)行區(qū)分。

圖5 20批僵蠶藥材的PCA得分圖Fig.5 PCA scores of 20 batches of samples

圖4 20批僵蠶藥材的主成分分析碎石圖Fig.4 Principal component analysis of 20 batches of samples

2.4 質(zhì)量評價

僵蠶藥材水分、浸出物、總灰分、酸不溶性灰分參照《中國藥典》2020年版[1]一部僵蠶項(xiàng)下進(jìn)行測定，白僵菌素含量參照課題組前期方法[18]進(jìn)行。

2.4.1 性狀測定

參照《中國藥典》2020年一部僵蠶項(xiàng)下性狀描述對僵蠶藥材的形狀、表面、斷面進(jìn)行評分量化。評分細(xì)則如下，形狀：條順直或略彎曲、形體飽滿：9～10分；條彎曲、形體飽滿：7～8分；條彎曲、形體皺縮：5～6分；條彎曲皺縮、形體干癟0～4分。斷面：亮棕色或亮黑色的絲腺環(huán)多4個：10分；亮棕色或亮黑色的絲腺環(huán)2～4個：8～9分；亮棕色或亮黑色的絲腺環(huán)2～3個：6～7分；亮棕色或亮黑色的絲腺環(huán)多2個：6分；無亮棕色或亮黑色的絲腺環(huán)：5分。20批僵蠶藥材性狀測定及評分結(jié)果見表4。

表4 20批僵蠶藥材外觀性狀觀測結(jié)果Table 4 Observation results of appearance characters of 20 batches of s,n =50)

續(xù)表4(Continued Tab.4)

2.4.2 水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、白僵菌素含量的測定

由表5可知，20批藥材的水分、酸不溶性灰分、浸出物均符合藥典要求。S11、S12、S13、S16、S18總灰分不合格，超過藥典標(biāo)準(zhǔn)，說明市場藥材質(zhì)量參差不齊，尤以石灰包裹家蠶、死蠶等偽劣品較多，總灰分超標(biāo)嚴(yán)重。此外，白僵菌素作為僵蠶抗驚厥的有效成分之一，規(guī)范化生產(chǎn)所得藥材(S1～S9)白僵菌素平均含量(0.026 7%)大于市場藥材(S10～S20)白僵菌素平均含量(0.025%)，不同市場的白僵菌素含量以荷花池藥材市場藥材大于其他藥材市場，荷花池藥材市場藥材主要產(chǎn)地為四川，這與Shi等[15]的研究結(jié)果“四川產(chǎn)者較優(yōu)”一致。

表5 20批僵蠶藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、白僵菌素含量的測定結(jié)果Table 5 Determination results of moisture,total ash,acid-insoluble ash,extract and beauvericin of 20 batches of =3)

2.5 相關(guān)性分析

將20批藥材性狀(形狀、長度、直徑、重量、斷面特征)、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、白僵菌素含量、9個共有峰峰面積進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖6所示。所有共有峰與藥材長度、表面性狀、重量呈正相關(guān)，1號峰～7號峰均與藥材斷面性狀正相關(guān)，說明該指紋圖譜能有效反映出藥材的性狀特征；3號峰、5號峰、6號峰、7號峰、8號峰、9號峰與藥材總灰分、浸出物呈負(fù)相關(guān)，總灰分與浸出物呈正相關(guān)，且藥材總灰分越高，劣質(zhì)品和摻偽品比例越大，不符合藥典要求。綜上，本文所建立的指紋圖譜能一定程度反映出藥材的性狀特征、質(zhì)量優(yōu)劣。

圖6 相關(guān)性分析圖Fig.6 Correlation analysis diagram注：1～9為1～9號峰峰面積；10-水分；11-總灰分；12-酸不溶性灰分；13-浸出物；14-白僵菌素含量；15-形狀評分；16-長度；17-直徑；18-斷面評分；19-重量。Note:1～9:No.1～No.9 peak area;10-Moisture;11-Total ash;12-Acid-insoluble ash;13-Extract;14-Beauvericin content;15-Shape score;16-Length;17-Diameter;18-Section score;19-Weight.

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分別考察了提取方法、提取溶劑、提取時間等前處理?xiàng)l件，確定了提取方法(回流提取、超聲提取)以超聲提取最佳，提取溶劑(甲醇、80%甲醇、乙腈和水)以80%甲醇最佳，提取時間(15、30、45 min)以30 min最優(yōu)。所建立的僵蠶指紋圖譜，其相似度在0.92～0.99之間，相似度較高，為僵蠶的質(zhì)量評價提供依據(jù)。

本研究所建立的指紋圖譜主要針對于僵蠶藥材的黃酮類成分，Wang等[19]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)研究結(jié)果表明槲皮素、山奈酚等成分可能為僵蠶息風(fēng)止痙的主要物質(zhì)基礎(chǔ)成分。多項(xiàng)研究[20,21]也表明槲皮素、山奈酚為治療癲癇的主要藥效成分之一，僵蠶作為息風(fēng)止痙要藥，其作用物質(zhì)基礎(chǔ)之一可能為黃酮類成分。此外，本研究還將各共有峰峰面積與藥材的性狀、浸出物、總灰分、白僵菌素含量進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明斷面性狀與表面性狀、藥材長度、白僵菌素含量正相關(guān)，與峰1號峰、2號峰、3號峰、4號峰、6號峰、7號峰峰面積正相關(guān)，1號峰、2號峰、4號峰、6號峰、7號峰經(jīng)比對指認(rèn)分別為蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山奈酚，均為桑葉中主要的黃酮類成分，說明僵蠶形成過程中黃酮類成分的轉(zhuǎn)化與斷面“玻璃體”等藥材品質(zhì)形成具有較強(qiáng)的相關(guān)性，也印證了自古以來“僵蠶以色白、條直、斷面黑亮者為佳”的品質(zhì)特征點(diǎn)。

綜上，本文所建立的指紋圖譜不僅包含了僵蠶“息風(fēng)止痙”藥效可能的物質(zhì)基礎(chǔ)成分，還與僵蠶藥材本身質(zhì)量品質(zhì)指標(biāo)具有一定的相關(guān)性，能綜合體現(xiàn)僵蠶藥材的質(zhì)量，為僵蠶藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。在對僵蠶藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中，應(yīng)充分考慮到其本身為“菌-蟲-葉”的復(fù)合體，采用多指標(biāo)綜合評價其質(zhì)量，建立更為科學(xué)合理的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。