黃精凝集素PCL-2誘導(dǎo)人前列腺癌LNCap細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究

孫婷婷，劉 洋，李卓柯，宗時(shí)宇，支文冰，狄志彪，李 曄，張 紅

陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 710003

前列腺癌(prostate cancer)是發(fā)生于男性前列腺組織的一種惡性腫瘤，近年來(lái)隨著人口老齡化及飲食結(jié)構(gòu)的改變，前列腺癌在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率呈明顯增高的趨勢(shì)，將成為危害我國(guó)男性健康的主要疾病[1]。前列腺癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前臨床對(duì)于前列腺癌的治療手段主要包括外科手術(shù)加術(shù)后放療，但傳統(tǒng)治療模式無(wú)法顯著提高前列腺癌患者的五年生存率，而藥物治療主要用于不能手術(shù)治療或晚期患者的保守治療，其顯著的不良反應(yīng)限制了臨床治療效果且尚無(wú)有效的根治藥物[2,3]。因此，尋找新的有效的治療前列腺癌的特效藥物成為科學(xué)研究者的難題。

近年來(lái)，從天然產(chǎn)物中尋找高效低毒的抗癌活性成分逐漸成為研究的熱點(diǎn)，尋找抗前列腺癌的藥物或有效成分對(duì)臨床防治前列腺癌具有重要的指導(dǎo)意義。藥用植物因資源分布廣泛、種類繁多，是抗腫瘤制劑的優(yōu)勢(shì)來(lái)源。植物凝集素(lectin)是一類糖結(jié)合特異性非免疫原性蛋白質(zhì)或糖蛋白，廣泛存在于多種植物中，能凝集紅細(xì)胞、癌細(xì)胞等各種細(xì)胞，其作為植物源性蛋白類物質(zhì)，具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞增殖和殺傷癌細(xì)胞的作用，其對(duì)正常細(xì)胞的毒害作用和副作用較化療藥物小很多，將其作為一類潛在的抗腫瘤藥物進(jìn)行開(kāi)發(fā)具有極廣闊的前景[4]。

黃精為百合科黃精屬植物黃精PolygonatumcyrtonemaHua.的干燥根莖。黃精藥用歷史悠久，療效確切，是一味重要的藥食兩用中藥，臨床主要用于治療陰虛燥咳、脾胃虛弱、腰膝酸軟等癥[5]。黃精主要含有多糖、皂苷、黃酮、蒽醌及氨基酸類等成分。前期研究發(fā)現(xiàn)，黃精中提取所得黃精凝集素PSL具有顯著的凝集活性，可抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC3細(xì)胞的增殖和Warburg效應(yīng)并通過(guò)降低HK2的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解[6]。目前，黃精凝集素對(duì)前列腺癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞LNCap的研究報(bào)道較少。本研究從黃精鮮藥材中提取分離得到一種黃精凝集素PCL-2，探究PCL-2對(duì)人前列腺癌LNCap細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)抗腫瘤機(jī)制，為抗前列腺癌藥物黃精凝集素PCL-2的開(kāi)發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮黃精藥材采購(gòu)自陜西省紅河谷地區(qū)，經(jīng)鑒定為百合科植物多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua.的新鮮根莖。人前列腺癌細(xì)胞LNCap(武漢普諾賽生命科技有限公司)。WST-1試劑盒、活性氧ROS試劑盒、BCA蛋白測(cè)定試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、10×Tris甘氨酸蛋白電泳液、10×電轉(zhuǎn)移緩沖液(凱基生物技術(shù)有限公司)；蛋白Marker(美國(guó)Thermo Scientific公司)；5-氟尿嘧啶(5-FU)、20×TBST緩沖液、青鏈霉素混合液(100 ×)(北京索來(lái)寶科技有限公司)；0.45 μm PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)；超敏ECL即用型化學(xué)發(fā)光試劑盒(博士德生物工程有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清(上海依科賽生物制品有限公司)；多克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)。硫酸銨、甲苯、吡啶、甲醇等試劑(國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司)，所用水為純凈水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

T100型梯度PCR儀、CFX connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、ChemiDox XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；T10 basic高速組織勻漿機(jī)(德國(guó)IKA公司)；掃描電鏡(ΣIGMA)(德國(guó)ZEISS公司)；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀(帝肯(上海)貿(mào)易有限公司)；HS840超凈工作臺(tái)(天津泰斯特儀器有限公司)、Herocell 180二氧化碳培養(yǎng)箱(上海潤(rùn)度生物科技有限公司)；C-P8研究型倒置顯微鏡(意大利OPTIKAGO公司)；YXQ-75SII立式高壓滅菌鍋(上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；DW-86L288超低溫冰箱(青島海爾股份有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黃精凝集素PCL-2的制備

取新鮮黃精藥材500 g，低溫勻漿，按比例加入1 000 mL Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)，室溫下攪拌提取6 h，4 ℃放置24 h，10 000 rpm離心15 min，上清液加適量硫酸銨使飽和度為30%，攪拌4 h，4 ℃放置24 h，10 000 rpm離心15 min，上清液繼續(xù)加入硫酸銨沉淀使飽和度為80%，攪拌4 h，4 ℃放置24 h，10 000 rpm離心15 min，沉淀用水復(fù)溶，3 500 Da透析3天，凍干，即得黃精凝集素PCL。采用DEAE-52纖維素陰離子交換色譜和葡聚糖凝膠Sephadex G-100分子篩柱層析依次對(duì)PCL粗品進(jìn)行分離純化，結(jié)合紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)確定純化組分黃精凝集素PCL-2。采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)測(cè)定PCL-2的分子量，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定PCL-2純度。

1.3.2 PCL-2對(duì)人前列腺癌LNCap細(xì)胞活性的影響

1.3.2.1 人前列腺癌LNCap細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮罐中迅速取出待復(fù)蘇的人前列腺癌LNCap細(xì)胞，在37 ℃水浴鍋中迅速解凍復(fù)蘇，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%雙抗)輕微吹打均勻后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁率達(dá)到80%～90%時(shí)對(duì)細(xì)胞按照以1∶2～1∶3的比例進(jìn)行傳代2～3代，備用。

1.3.2.2 PCL-2對(duì)人前列腺癌LNCap細(xì)胞增殖的影響

采用WST-1法檢測(cè)LNCap細(xì)胞增殖。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LNCap細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種于96孔板培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞正常貼壁生長(zhǎng)后，加入100 μL用RPMI-1640培養(yǎng)液配制的不同濃度PCL-2樣品(0～100 μg/mL)，以不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液作為空白對(duì)照(Con)，以5-FU作為陽(yáng)性對(duì)照(20 μg/mL)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。每孔加入10 μL WST-1標(biāo)記溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定吸光值，按照公式：細(xì)胞活力=Abs樣品/Abs對(duì)照×100%計(jì)算細(xì)胞增殖率。

另取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LNCap細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，接種于12孔板，每孔1.5 mL，培養(yǎng)12 h后，加入1.5 mL用RPMI-1640培養(yǎng)液配制的不同濃度PCL-2樣品(0、100 μg/mL)，以不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，以5-FU作為陽(yáng)性對(duì)照(20 μg/mL)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.3.2.3 集落形成實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LNCap細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×106個(gè)/mL，將細(xì)胞接種于6孔板，每孔2.5 mL，置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后棄上清，用PBS清洗細(xì)胞1～2次，每次2 mL，棄PBS，加入2.5 mL用RPMI-1640培養(yǎng)液配制的不同濃度PCL-2(0～100 μg/mL)溶液，以不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，以5-FU作為陽(yáng)性對(duì)照(20 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)7天以形成集落(每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)，7天后處理細(xì)胞，每孔加入1.0 mL 4%的多聚甲醛，4 ℃條件下固定30 min，棄多聚甲醛，用PBS清洗三次，每次2 mL，棄PBS，每孔加入500 μL結(jié)晶紫溶液，室溫下染色20 min，PBS清洗三次，相機(jī)拍照觀察染色情況，顯微鏡下計(jì)數(shù)，按照下式計(jì)算集落形成率：集落形成率=集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.2.4 活性氧水平(ROS)檢測(cè)

采用2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)熒光探針?lè)╗7]測(cè)定不同濃度PCL-2對(duì)LNCap細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的LNCap細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，接種于24孔板中，每孔1 mL，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，棄上清液，每孔加入1 mL PBS洗滌細(xì)胞，棄PBS，分別加入1 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、5-FU(20 μg/mL)及不同濃度(1～100 μg/mL)的PCL-2水溶液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后棄去上清液，每孔用1 mLPBS洗滌，棄PBS，每孔避光加入500 μL DCFH-DA溶液，37 ℃條件下孵育20 min后棄染色液，用1 mL PBS清洗1～2次，棄PBS，向每孔中加入150 μL RIPA細(xì)胞裂解液(每100 μL細(xì)胞裂解液含1 μL苯甲基磺酰氟)，置冰上裂解15～20 min，用刮鏟小心刮取細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL無(wú)菌離心管中，于4 ℃下10 000 rpm離心10 min，吸取上清液50 μL轉(zhuǎn)移至96孔板中，采用熒光酶標(biāo)儀對(duì)細(xì)胞中ROS含量進(jìn)行定量分析，以未經(jīng)PCL-2樣品處理細(xì)胞的裂解液為空白對(duì)照，在激發(fā)光488 nm，散射光525 nm發(fā)射波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，同時(shí)按照BCA蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定每個(gè)樣品蛋白含量，ROS含量用每毫克蛋白總熒光強(qiáng)度表示。

1.3.3 PCL-2對(duì)人前列腺癌LNCap細(xì)胞凋亡相關(guān)機(jī)制研究

1.3.3.1 PCL-2對(duì)LNCap細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LNCap細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，接種至無(wú)菌24孔板，每孔1 mL，培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞正常貼壁生長(zhǎng)后，分別加入不同濃度(1～100 μg/mL)的PCL-2各組分樣品溶液，以空白培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，5-FU(20 μg/mL)作為陽(yáng)性對(duì)照，培養(yǎng)24 h，每組濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。引物序列如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequence

1.3.3.2 Western blot法檢測(cè)PCL-2對(duì)LNCap細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LNCap細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×106個(gè)/mL，接種至6孔板，每孔2.5 mL，培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞正常貼壁生長(zhǎng)后，分別加入不同濃度(1～100 μg/mL)的PCL-2樣品溶液，以空白培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，5-FU(20 μg/mL)作為陽(yáng)性對(duì)照，每組濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，收集提取總蛋白，利用BCA蛋白定量法對(duì)總蛋白進(jìn)行定量。用SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)樣品，電泳后，凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉孵育2 h，一抗孵育過(guò)夜，將蛋白質(zhì)樣品與二抗孵育2 h，采用ECL進(jìn)行顯影后放入Bio-Rad凝膠成像儀中觀察并拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)Quantity One軟件分析目標(biāo)條帶的密度值。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 PCL-2制備

PCL-2得率為0.19%，高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)和聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)果表明PCL-2分子量為18.89×103Da，純度為97.8%。

2.2 PCL-2對(duì)人前列腺癌LNCap細(xì)胞活性的影響

2.2.1 PCL-2對(duì)人前列腺癌LNCap細(xì)胞增殖的影響

如圖1A所示，空白對(duì)照組人前列癌LNCap細(xì)胞呈梭形貼壁生長(zhǎng)，與空白組比較，陽(yáng)性藥物5-FU組細(xì)胞形態(tài)喪失，細(xì)胞呈皺縮成小球狀，細(xì)胞大量死亡；PCL-2低劑量組(1 μg/mL)部分細(xì)胞體積縮小呈球狀，細(xì)胞有死亡趨勢(shì)；PCL-2高劑量組(100 μg/mL)細(xì)胞皺縮成小球狀，偶見(jiàn)有梭形細(xì)胞，細(xì)胞大量死亡?？梢?jiàn)，PCL-2低劑量(1 μg/mL)時(shí)就能誘導(dǎo)LNCap細(xì)胞死亡。由圖1B可知，在1～100 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，與空白組相比，PCL-2對(duì)人前列腺癌LNCap細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用并呈濃度依賴性；當(dāng)PCL-2濃度為50 μg/mL和100 μg/mL時(shí)，LNCap細(xì)胞活力僅為空白組的42.56%和22.29%；陽(yáng)性藥物組細(xì)胞活力為(19.16±10.41)%。由結(jié)果可知，PCL-2顯著抑制LNCap細(xì)胞增殖(P<0.01)。

圖1 PCL-2對(duì)人前列腺癌LNCap細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of PCL-2 on the cell viability of human prostate cancer LNCap s，n ≥ 3)注：A：PCL-2對(duì)人前列腺癌LNCap細(xì)胞形態(tài)的影響(×200)；B：PCL-2對(duì)人前列腺癌LNCap細(xì)胞活力的影響(與空白組相比，** P <0.01，*** P <0.001)。Note:A:The effect of PCL-2 on the morphology of human prostate cancer LNCap cells (×200);B:The effect of PCL-2 on the cell viability of human prostate cancer LNCap cells (compared with control,** P <0.01,*** P <0.001).

2.2.2 集落形成實(shí)驗(yàn)

如圖2A所示，正常對(duì)照組LNCap細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)紫色，說(shuō)明培養(yǎng)7天內(nèi)細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)。陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞顏色變淡，細(xì)胞有脫落的現(xiàn)象。PCL-2組細(xì)胞數(shù)量隨著給藥濃度增加藍(lán)紫色顏色逐漸變淺，當(dāng)濃度為100 μg/mL時(shí)，出現(xiàn)細(xì)胞大量脫落，幾乎沒(méi)有藍(lán)紫色出現(xiàn)。由圖2B可知，與空白組相比，經(jīng)不同濃度PCL-2處理后的LNCap細(xì)胞，細(xì)胞集落形成率顯著降低(P<0.05)，并呈濃度依賴性，當(dāng)PCL-2濃度為50 μg/mL，細(xì)胞集落形成率為33.59%，與陽(yáng)性藥物組比較無(wú)顯著性差異(29.64%，P>0.05)，結(jié)果進(jìn)一步表明PCL-2具有抑制LNCap細(xì)胞增殖的作用。

圖2 集落形成實(shí)驗(yàn)注：A：PCL-2對(duì)人前列腺癌LNCap細(xì)胞集落形成的影響；B：LNCap細(xì)胞集落形成率(與空白組相比，** P <0.01，*** P <0.001)。Note:A:The effect of PCL-2 on the colony formation of human prostate cancer LNCap cells;B:The colony formation rate of LNCap cells(compared with control,** P <0.01,*** P <0.001).

2.2.3 活性氧水平(ROS)檢測(cè)

如圖3所示，與空白對(duì)照組相比，PCL-2各劑量組細(xì)胞中ROS含量呈劑量依賴趨勢(shì)(P<0.01)，在1～100 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，ROS含量分別為(122.18±5.67)%、(138.64±10.22)%、(160.62±10.34)%及(182.87±11.48)%，陽(yáng)性組中ROS含量為(215±9.88)%。由結(jié)果可知，PCL-2顯著促進(jìn)LNCap細(xì)胞中ROS生成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖3 PCL-2對(duì)人前列腺癌LNCap細(xì)胞中ROS的影響Fig.3 The effect of PCL-2 on ROS in human prostate 注：與空白組相比，** P <0.01，*** P <0.001。Note:Compared with control,** P <0.01,*** P <0.001.

2.2.4 PCL-2對(duì)人前列腺癌LNCap細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制研究

2.2.4.1 PCL-2對(duì)人前列腺癌LNCap細(xì)胞中相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

如圖4A、4B所示，在1～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，與空白組相比，PCL-2各劑量組Bax基因mRNA表達(dá)量隨濃度升高而顯著增加(P<0.01)，當(dāng)PCL-2樣品濃度為100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞中Bax表達(dá)量為(178.43±12.77)%，陽(yáng)性組Bax表達(dá)量為(199.34±6.96)%；在濃度1～100 μg/mL范圍內(nèi)，與空白組相比，PCL-2各劑量組Bcl-2基因mRNA表達(dá)量隨濃度升高而顯著降低(P<0.01)，其表達(dá)量分別為(88.50±9.17)%、(80.45±6.75)%、(66.59±7.98)%及(56.98±12.09)%，陽(yáng)性組Bcl-2基因mRNA表達(dá)量為(50.64±11.03)%。如圖4C、4D所示，在濃度1～100 μg/mL范圍內(nèi)，與空白組相比，PCL-2各劑量組Caspase-3、Caspase-9基因mRNA表達(dá)量隨濃度升高而顯著增加(P<0.01)，當(dāng)濃度為200 μg/mL時(shí)，LNCap細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9基因mRNA表達(dá)量分別為(340.42±16.61)%和(225.92±8.98)%。由結(jié)果可知，PCL-2通過(guò)上調(diào)Bax、Caspase-3及Caspase-9基因mRNA表達(dá)，下調(diào)Bcl-2基因mRNA表達(dá)水平誘導(dǎo)人前列腺癌LNCap細(xì)胞凋亡。

圖4 PCL-2對(duì)人前列腺癌LNCap細(xì)胞中Bax,Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9基因mRNA表達(dá)的影響 s，n ≥ 3)Fig.4 The effect of PCL-2 on the mRNA expression of Bax,Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 genes in human prostate cancer LNCap s,n ≥ 3)注：與空白組相比，** P <0.01，*** P <0.001。Note:Compared with control,** P <0.01,*** P <0.001.

2.2.4.2 Western blot法檢測(cè)PCL-2對(duì)LNCap細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖5A、5B所示，與空白組相比，當(dāng)PCL-2濃度為10、100 μg/mL，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)并呈一定的濃度依賴性(P<0.01)，陽(yáng)性組Bcl-2蛋白表達(dá)水平為最低。PCL-2顯著上調(diào)Bax蛋白表達(dá)水平且Bax/Bcl-2比值顯著增加(P<0.01)，當(dāng)濃度為100 μg/mL時(shí)，Bax/Bcl-2比值相比于空白組增加了77.18%。在10～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，PCL-2顯著上調(diào)活化Caspase-3和活化Caspase-9蛋白表達(dá)量(P<0.01)，當(dāng)PCL-2濃度為100 μg/mL時(shí)，活化Caspase-3和活化Caspase-9蛋白表達(dá)量分別為空白組的3.19倍和2.06倍。由結(jié)果可知，PCL-2可通過(guò)下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax、活化Caspase-3和活化Caspase-9蛋白表達(dá)誘導(dǎo)人前列腺癌LNCap細(xì)胞凋亡。

圖5 PCL-2對(duì)人前列腺癌LNCap細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of PCL-2 on the expression of related proteins in human prostate cancer LNCap s，n ≥ 3)注：與空白組相比，** P <0.01，***P <0.001。Note:Compared with control,** P <0.01,*** P <0.001.

3 討論與結(jié)論

前列腺癌在我國(guó)發(fā)病率逐年升高，是引起男性死亡的第二大腫瘤殺手[8]。目前，國(guó)內(nèi)外在前列腺癌研究方面已經(jīng)做了大量的工作，研究表明前列腺癌LNCap細(xì)胞系廣泛用于前列腺癌發(fā)展轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制、藥物篩選及藥物評(píng)價(jià)等研究，已成為目前研究前列腺癌最常用的細(xì)胞系[9]。黃精凝集素PCL-2為從黃精鮮藥材中提取所得的一種糖蛋白類成分，PCL-2對(duì)前列腺癌LNCap細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制未見(jiàn)有深入研究。本研究中WST-1實(shí)驗(yàn)和集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PCL-2顯著抑制LNCap細(xì)胞增殖并呈濃度依賴性。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞維持穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境的機(jī)制之一，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)，同時(shí)也是評(píng)價(jià)抗癌藥物有效性的重要指標(biāo)之一[10]。細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)控，是一個(gè)復(fù)雜且涉及多條通路的過(guò)程。ROS是由氧直接或間接轉(zhuǎn)變的氧自由基及其衍生物，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、維持機(jī)體平衡起重要的作用。線粒體為ROS產(chǎn)生的主要部位，ROS累積引起線粒體膜電位的崩解進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞凋亡，ROS聚集被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中最早發(fā)生的事件之一[11,12]。Bcl-2蛋白家族是一個(gè)特殊的蛋白家族，其中Bad、Bid及Bax具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，而B(niǎo)cl-2、Bcl-w具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2是一種內(nèi)膜蛋白，在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，可通過(guò)阻止細(xì)胞色素C的釋放，增強(qiáng)線粒體膜電位，抑制鈣離子釋放，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡作用；Bax的作用與 Bcl-2相反，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活細(xì)胞凋亡效應(yīng)因子Caspase，改變細(xì)胞膜通透性進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，研究表明細(xì)胞中Bcl-2 和Bax比例的改變可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[13,14]。Caspase家族與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路，其中Caspase-3是凋亡的執(zhí)行因子，該蛋白的活化是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志[15,16]。有研究發(fā)現(xiàn)ROS誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡最常見(jiàn)的方式是由Caspases家族誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡，除此之外，ROS可通過(guò)下調(diào)Bcl-2以及上調(diào)Bax和Bad誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[17,18]。研究發(fā)現(xiàn)利妥昔單抗通過(guò)抑制Bcl-2蛋白表達(dá)和激活p38-MAPK信號(hào)通路導(dǎo)致ROS的累積進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。本研究采用2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)熒光探針?lè)y(cè)定細(xì)胞中ROS水平，研究表明PCL-2能顯著促進(jìn)LNCap細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生和積累，并呈明顯的劑量依賴性。LNCap細(xì)胞經(jīng)PCL-2作用后，隨著給藥濃度升高，Bax基因mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2基因mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，活化Caspase-3和活化Caspase-9蛋白表達(dá)量增加。由此可見(jiàn)，LNCap細(xì)胞中ROS累積引起B(yǎng)ax和Bcl-2蛋白水平變化，進(jìn)而啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase-9和Caspase-3，從而誘導(dǎo)LNCap細(xì)胞凋亡。

黃精在我國(guó)資源豐富，主要分布于陜西、云南、貴州、四川等地，為陜西省道地藥材之一。黃精凝集素PCL-2提取分離純化方法簡(jiǎn)單且得率高，可用于大量制備樣品。由本研究結(jié)果可知黃精凝集素PCL-2具有顯著誘導(dǎo)人前列腺癌LNCap細(xì)胞凋亡作用，具有開(kāi)發(fā)為抗前列腺癌藥物的潛力，本研究為臨床應(yīng)用黃精凝集素治療前列腺癌提供了新的線索。本文僅在體外細(xì)胞水平對(duì)PCL-2抗人前列腺癌活性及機(jī)制進(jìn)行了初步探索，其具體作用機(jī)制以及在體內(nèi)動(dòng)物水平抗腫瘤活性還需要進(jìn)一步研究。