基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探析桃紅四物湯治療滑膜炎的潛在作用機(jī)制

龍 剛，劉 炯，付興前

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，貴州 貴陽(yáng) 550002；2.貴陽(yáng)市第四人民醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，貴州 貴陽(yáng) 550007）

滑膜炎（synovitis）是指滑膜組織受到多種關(guān)節(jié)損傷或慢性勞損等引起的非感染性病變[1]，多表現(xiàn)為滑膜增厚或關(guān)節(jié)積液[2]。研究表明[3]，滑膜炎發(fā)生在50%的關(guān)節(jié)炎患者中?；ぱ谆颊咝栝L(zhǎng)期忍受疼痛的折磨，特別是肩負(fù)著家庭責(zé)任和社會(huì)的中青年患者，這已成為影響其工作和生活質(zhì)量的重要因素之一。目前，尚無(wú)治療滑膜炎的特效藥物，治療主要是緩解疼痛和減輕癥狀，治療不當(dāng)還可能出現(xiàn)不良反應(yīng)。同時(shí)，該病存在治療后易復(fù)發(fā)、治療時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用高昂、關(guān)節(jié)活動(dòng)度降低等特點(diǎn)，且部分患者尚不能完全治愈。長(zhǎng)期以來(lái)，研究關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的研究人員主要集中關(guān)注關(guān)節(jié)軟骨和軟骨細(xì)胞的病理變化，對(duì)滑膜的炎性變化關(guān)注較少[4，5]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，滑膜炎的主癥為疼痛，故歸屬于“痹證”范疇，治療宜活血化瘀，消腫通絡(luò)。桃紅四物湯首載于吳謙的《醫(yī)宗金鑒》，具有養(yǎng)血、活血、行氣、祛邪之效[6]。中藥治療疾病具有多成分的特點(diǎn)，但具體作用機(jī)制不明,故本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，初步探析桃紅四物湯治療滑膜炎的潛在靶點(diǎn)、信號(hào)通路以及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 桃紅四物湯的有效成分和靶點(diǎn)篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索桃紅四物湯中六味中藥（桃仁、紅花、當(dāng)歸、熟地黃、川芎、白芍）的所有活性成分，根據(jù)類(lèi)藥性（drug-likeness，DL）≥0.18、口服生物利用度（oral bioavilability，OB）≥30%的參數(shù)進(jìn)行中藥活性成分篩選，然后在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中收集桃紅四物湯的有效成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)，將獲取到的靶點(diǎn)蛋白輸入U(xiǎn)niprot（http：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中轉(zhuǎn)換為官方的基因符號(hào)。

1.2 滑膜炎疾病基因獲取 將關(guān)鍵詞“Synovitis”輸入到Genecards 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://www.genecards.org）、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.omim.org）、Drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.drugbank.ca）和TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd）中，挖掘滑膜炎的潛在靶點(diǎn)。利用Excel 合并上述4 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘到的基因靶點(diǎn)并去重，刪除重復(fù)值后獲得滑膜炎的靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖 將中藥、成分和靶點(diǎn)用Excel 表格制作文件，再導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中，構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)圖。利用Cytoscape3.7.2 軟件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，得到連接度Degree值，并根據(jù)該值篩選藥物的主要活性成分。

1.4 桃紅四物湯-滑膜炎靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線工具對(duì)桃紅四物湯作用的靶基因與滑膜炎疾病靶基因取交集，并繪制韋恩圖。將獲得的交集基因輸入STRING11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org）構(gòu)建蛋白質(zhì)互作（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，分析設(shè)置為默認(rèn)值，隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開(kāi)連接的蛋白。導(dǎo)出PPI 網(wǎng)絡(luò)的tsv 文件，并將此文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件中，利用該軟件對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并根據(jù)該網(wǎng)絡(luò)的度值參數(shù)篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 KEGG 通路富集分析 使用Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://metascape.org/gp/index.html）對(duì)桃紅四物湯與滑膜炎的共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，采用bioinformatics 在線工具（http://www.bioinformatics.com.cn）繪制KEGG 富集氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 桃紅四物湯活性成分及潛在靶點(diǎn) 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中按照DL≥0.18 和OB≥30%的標(biāo)準(zhǔn)篩選，得到活性成分69 種，去除重復(fù)化合物后得到61 種活性成分。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到61 種化合物潛在靶點(diǎn)740 個(gè)、并轉(zhuǎn)換為基因，刪除重復(fù)基因后得到191 個(gè)。

2.2 滑膜炎相關(guān)靶點(diǎn)篩選 從Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得滑膜炎靶點(diǎn)858 個(gè)，并從OMIM、Drugbank、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)中補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)，合并刪除重復(fù)后獲得904 個(gè)滑膜炎相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 桃紅四物湯中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 使用Cytoscape3.7.2 軟件構(gòu)建中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，利用該軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并根據(jù)該網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)篩選關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。Cytoscape 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，槲皮素連接度（Degree）為129，其次為β-谷甾醇（Degree 為112）、山柰酚（Degree 為102），見(jiàn)圖1。

圖1 中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 桃紅四物湯-滑膜炎靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將獲取的桃紅四物湯靶點(diǎn)與滑膜炎疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集，得到桃紅四物湯成分-滑膜炎共同靶點(diǎn)81 個(gè)。進(jìn)一步將交集靶點(diǎn)輸入至STRING11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2。圖中包含81 個(gè)節(jié)點(diǎn)（其中隱藏3 個(gè)斷開(kāi)連接的節(jié)點(diǎn)）、321 條邊。將PPI 網(wǎng)絡(luò)tsv 文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件中并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)其Degree 值篩選前3 的靶點(diǎn)，分別為T(mén)NF、JUN、IL-6（Degree≥23）。

圖2 桃紅四物湯-滑膜炎靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.5 KEGG 通路富集分析結(jié)果 利用Metascape 平臺(tái)對(duì)81 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 分析，并借助bioinformatics 在線工具對(duì)結(jié)果可視化。KEGG 通路富集得到279 個(gè)信號(hào)通路，其中富集分析具有代表性的通路為癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、PI3K-AKT 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路等，見(jiàn)圖3。

圖3 KEGG 通路富集氣泡圖

3 討論

骨性關(guān)節(jié)炎是一類(lèi)涉及關(guān)節(jié)軟骨退變與軟骨下骨硬化性疾病[7]。有研究表明[8]，滑膜炎在我國(guó)的患病率約為7.6%。而膝關(guān)節(jié)滑膜炎在臨床上治療方法頗多，常見(jiàn)的治療方法有中藥內(nèi)服及外用、針灸、理筋手法、藥物注射等[9]。研究表明[10，11]，骨關(guān)節(jié)炎形成的主要因素為滑膜炎分泌的炎性因子（如IL-6、TNF-α、IL1-β）通過(guò)影響關(guān)節(jié)軟骨分解代謝速度而成。李寧等[12]指出桃紅四物湯的療效與吲哚美辛相似，能降低滑膜的炎性滲出、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的退變和抑制膠原蛋白，從而達(dá)到對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用。也有研究發(fā)現(xiàn)[13]，桃紅四物湯能明顯改善患者關(guān)節(jié)的腫脹、疼痛和功能障礙。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，滑膜炎多因慢性勞損、外傷等，導(dǎo)致經(jīng)絡(luò)損傷，血不循經(jīng)，溢于脈外，瘀血阻滯，氣血運(yùn)行遲滯不暢，故出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及屈伸不利[14]。桃紅四物湯功擅活血化瘀，是骨傷科治療骨性關(guān)節(jié)炎的常用方劑?；谥嗅t(yī)辨證論治的基礎(chǔ)上，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對(duì)桃紅四物有效成分減輕滑膜炎癥作用的分子機(jī)制展開(kāi)探討。

本次研究結(jié)果顯示，Degree 值位居前3 位的為槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚。研究顯示[15]，槲皮素通過(guò)抑制MAPK/TLR4 信號(hào)通路降低IL-17 和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減少Th17 的極化，從而發(fā)揮抗炎作用。有研究發(fā)現(xiàn)[16]，β-谷甾醇-SLNs 的抗炎作用可能與其抗炎和抗氧化作用有關(guān)；這可能與抑制STAT3等基礎(chǔ)基因、降低細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)水平以及清除ROS 有直接關(guān)系。據(jù)報(bào)道[17]，山柰酚具有廣泛的藥理活性，包括抗炎和抗氧化作用。已有研究認(rèn)為[18，19]，山柰酚的抗關(guān)節(jié)炎活性可以調(diào)節(jié)炎癥酶的活性、破骨細(xì)胞的形成。桃紅四物湯治療滑膜炎癥病變存在多靶點(diǎn)、多成分的特點(diǎn)，機(jī)制復(fù)雜，與中醫(yī)整體觀念、辨證論治的原則相吻合。

PPI 是蛋白質(zhì)之間相互作用的關(guān)系，本研究中PPI 分析TNF、JUN、IL-6 位居前3，均與滑膜炎癥相關(guān)。研究表明，成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞中Cadherin-11的表達(dá)與滑膜炎的程度呈正相關(guān)，且TNF-α 在成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞中Cadherin-11 的上調(diào)中起著至關(guān)重要的作用[20，21]。JUN 是一種轉(zhuǎn)錄因子，由蛋白1激活，介導(dǎo)分解代謝轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞凋亡；它在TNF 信號(hào)通路和IL-17 中發(fā)揮重要作用[22]。研究表明[23]，IL-6 誘導(dǎo)TRIM27 表達(dá)增加，TRIM27 參與IL-6/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)。

靶基因的KEGG 通路富集分析掲示了桃紅四物湯活性成分主要通過(guò)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和炎癥相關(guān)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)滑膜炎癥的作用。

炎癥相關(guān)通路：①產(chǎn)生IL-17 的促炎性RORcTh17 細(xì)胞可以同時(shí)轉(zhuǎn)錄FoxP3，從而實(shí)現(xiàn)共同產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子IL-10 的能力[24]；②MAPK（JNK、ERK和p38）通路是關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中與炎性反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[25]；MAPK 在軟骨形成中起重要作用，ERK 介導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖和基因表達(dá)，JNK和p38 在關(guān)節(jié)軟骨的炎癥和破壞中起重要作用[26]；③最近發(fā)現(xiàn)的TNF 介導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成和炎癥性骨吸收的內(nèi)在抑制機(jī)制改變了炎癥性破骨細(xì)胞生成的范式[27]；④Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR）信號(hào)由其配體激活，最終通過(guò)不同途徑產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子、趨化因子和干擾素；TLR 的激活主要與通過(guò)產(chǎn)生免疫信使分子誘導(dǎo)炎癥過(guò)程和激發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有關(guān)[28]；⑤NF-κB 的激活是由兩種典型的信號(hào)通路介導(dǎo)的，即典型信號(hào)通路和非典型信號(hào)通路；這些途徑主要由促炎信號(hào)或參與發(fā)育的因子激活[29]。

細(xì)胞周期相關(guān)通路：PI3K-AKT 信號(hào)通路介導(dǎo)的信號(hào)在細(xì)胞增殖、分化、凋亡中是最關(guān)鍵的途徑之一，并且PI3K 途徑通過(guò)抑制下游分子Akt 來(lái)抑制細(xì)胞周期進(jìn)程[30，31]。有研究發(fā)現(xiàn)[32]，miR-34a 的下調(diào)可以促進(jìn)大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，可能的機(jī)制是通過(guò)激活PI3K-Akt 通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，桃紅四物湯通過(guò)多種成分、通路及靶點(diǎn)治療滑膜炎，這些靶點(diǎn)可能成為治療滑膜炎的新方法。