ADAM12 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義

陳 銳，楊侃侃，江 兵，李啟信

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院胃腸外科，安徽 巢湖 238000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是目前世界上最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均在各類(lèi)惡性腫瘤中排名第3[1]。盡管近年來(lái)通過(guò)外科手術(shù)、放化療及靶向治療結(jié)直腸癌取得了一定的效果，但進(jìn)展期結(jié)直腸癌的5 年生存率僅為50%左右，患者預(yù)后較差，尋找結(jié)直腸癌診斷和治療的新的靶向分子尤為重要[2]。既往研究發(fā)現(xiàn)，ADAM12 在多種實(shí)體腫瘤中異常高表達(dá)，包括肝癌[3，4]、胃癌[5，6]、子宮頸癌[7]、乳腺癌[8，9]、胰腺癌[10，11]等。但目前ADAM12 在結(jié)直腸癌中相關(guān)研究較少。為此，本研究收集徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院胃腸外科2020 年4 月-2021 年2 月行手術(shù)治療的83 例臨床樣本，利用免疫組化方法檢測(cè)ADAM12 在結(jié)直腸癌及鄰近癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平，并分析其與臨床病理特征的相關(guān)性，探究ADAM12 在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院胃腸外科2020 年4 月-2021 年2 月行手術(shù)治療的83例患者的癌組織和癌旁組織標(biāo)本，所有患者均行腹腔鏡或開(kāi)腹行結(jié)直腸癌根治性切除術(shù)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者術(shù)前通過(guò)腸鏡活檢病理、影像學(xué)檢查及術(shù)后病理均證實(shí)為結(jié)直腸惡性腫瘤；②所有標(biāo)本收集均在術(shù)后半小時(shí)內(nèi)放入10%福爾馬林液體中保存直至石蠟包埋；③所有患者癌組織均取自腫瘤全層并剔除壞死組織，癌旁組織取自距癌組織5 cm 以上的正常腸上皮組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者術(shù)前未進(jìn)行任何治療（放療、化療），無(wú)重大心肺疾病等；②患者既往無(wú)其他部位惡性腫瘤治療史或結(jié)直腸惡性腫瘤手術(shù)后復(fù)發(fā)。本研究獲得安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)，實(shí)驗(yàn)所收集標(biāo)本均經(jīng)患者或患者家屬同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 羊抗人ADAM12 多克隆抗體為abcam 公司產(chǎn)品，通用型二抗試劑盒、山羊二抗試劑盒、DAB 顯色試劑盒均為Zsbio 公司產(chǎn)品。

1.2.2 免疫組化染色 將石蠟包埋的標(biāo)本切為厚度為5 μm 的切片，依次經(jīng)過(guò)3 道二甲苯和3 道100%、95%、80%乙醇進(jìn)行脫蠟和脫水處理后抗高壓修復(fù)20 min，固定組織放在孵育盒上加3%雙氧水室溫孵育20 min，PBS 沖洗后加一抗ADAM12（1∶200），37 ℃孵育60 min 后再次PBS 沖洗，加DAB 顯色劑（顯微鏡下控制顯色時(shí)間，有陽(yáng)性終止顯色時(shí)間），最后常規(guī)水洗、脫水、透明、封片。

1.3 免疫組化結(jié)果判定 通過(guò)免疫組化方法判定ADAM12 在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平。ADAM12 在結(jié)直腸癌細(xì)胞中染色強(qiáng)陽(yáng)性結(jié)果為棕褐色或棕黃色，染色部位主要位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，細(xì)胞核幾乎不染色。根據(jù)顯微鏡下細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分為：無(wú)色（0 分）、淡黃色（1 分）、棕黃色（2 分）、棕褐色（3 分）；細(xì)胞著色細(xì)胞數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0～25%（1 分）、25%～50%（2 分）、50%～75%（3 分）、75%～100%（4 分）。評(píng)分結(jié)果由染色強(qiáng)度×著色細(xì)胞數(shù)進(jìn)行綜合評(píng)判，對(duì)染色強(qiáng)度得分和著色細(xì)胞數(shù)得分乘積＜4 分為ADAM12 低表達(dá)，對(duì)染色強(qiáng)度得分和著色細(xì)胞數(shù)得分乘積≥4 分為ADAM12 高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果由兩位病理科主治醫(yī)師復(fù)核后綜合判定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0 軟件和GraphPad Prism8 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，ADAM12基因在結(jié)直腸腫瘤及癌旁組織中的表達(dá)水平之間比較采用GraphPad Prism8 配對(duì)t檢驗(yàn)，ADAM12 基因在結(jié)直腸腫瘤及癌旁組織中的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的病理參數(shù)之間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADAM12 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平ADAM12主要在結(jié)直腸癌的胞漿和細(xì)胞膜中表達(dá)，呈棕褐色或棕黃色，在正常組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)，見(jiàn)圖1。ADAM12 蛋白在結(jié)直腸癌中異常高表達(dá)，高于癌旁組織中的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。83 例結(jié)直腸癌患者中ADAM12 高表達(dá)有56 例，低表達(dá)27 例，癌旁組織中高表達(dá)13 例，低表達(dá)70，結(jié)直腸癌患者中ADAM12 高表達(dá)占比高于低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=45.860，P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 ADAM12 基因在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)[n（%）]

圖1 ADAM12 在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)

圖2 結(jié)直腸癌中ADAM12 的表達(dá)

2.2 ADAM12 蛋白與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性 不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小、分化程度、脈管侵犯以及神經(jīng)侵犯的患者ADAM12表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期的患者ADAM12 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 ADAM12 與結(jié)直腸癌患者病理參數(shù)間的關(guān)系（n）

3 討論

ADAM12 是ADAM 家族的重要成員之一，位于染色體10q26 上，主要包括膜結(jié)合型ADAM12（ADAM12-L）和分泌型ADAM12（ADAM12-S）兩種形式。正常情況下，ADAM12 在人足月胎盤(pán)中表達(dá)豐富[12]。目前研究發(fā)現(xiàn)，ADAM12 在多個(gè)實(shí)體腫瘤中均出現(xiàn)表達(dá)異常上調(diào)并通過(guò)驅(qū)動(dòng)腫瘤進(jìn)展中的多個(gè)過(guò)程，包括腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[13，14]、細(xì)胞凋亡[15]、EMT 過(guò)程[16，17]、細(xì)胞黏附[18]等。

ADAM12 在多種實(shí)體腫瘤中過(guò)度表達(dá)且與預(yù)后不良相關(guān)。張揚(yáng)等[3]發(fā)現(xiàn)有超過(guò)68%的肝癌患者存在ADAM12 高表達(dá)。也有研究報(bào)道[5]，ADAM12-L mRNA 及蛋白質(zhì)在胃癌組織中過(guò)表達(dá)，提示ADAM12-L 能促進(jìn)胃癌的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)[6]，ADAM12 在胃癌中的表達(dá)量明顯上調(diào)，且與胃癌細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)有關(guān)，其可能是通過(guò)與粘附分子的相互作用或信號(hào)分子的蛋白水解脫落以及其受體的反式激活引起的。在乳腺癌中，ADAM12 不僅呈現(xiàn)高表達(dá)，當(dāng)敲除乳腺癌細(xì)胞系中的ADAM12 時(shí)可促進(jìn)EMT 過(guò)程，抑制乳腺癌癌細(xì)胞的侵襲和遷徙[16]。Roy R 等[8]研究報(bào)道，ADAM12 的表達(dá)與乳腺癌的進(jìn)展呈正相關(guān)。總之，ADAM12 在惡性腫瘤中的過(guò)度表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為了探究ADAM12 在結(jié)直腸癌組織和正常的癌旁組織中表達(dá)水平，本研究中利用免疫組化的方法檢測(cè)結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織和癌旁正常組織中ADAM12 蛋白的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADAM12 在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)量高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與吉冰等[19]的研究結(jié)果基本一致，表明在ADAM12 在結(jié)直腸癌中異常高表達(dá)可能促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)[20]，ADAM12 異常高表達(dá)不僅可以增加腫瘤的增殖，而且可以引起腫瘤轉(zhuǎn)移。據(jù)報(bào)道[17，20]，ADAM12 在促進(jìn)腫瘤的遷徙和侵襲過(guò)程可能與EGFR/ERK 通路相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，ADAM12 通過(guò)調(diào)控肝癌細(xì)胞EMT，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲，并且抑制ADAM12 可降低肝細(xì)胞增殖、侵襲能力；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中ADAM12 的高表達(dá)與腫瘤的TNM分期顯著相關(guān)[3]。本研究中，ADAM12 高表達(dá)與結(jié)直腸癌的TNM 分期相關(guān)。白璐等[7]研究表明，子宮頸癌患者異常高表達(dá)的ADAM12 與腫瘤侵襲、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這些都提示ADAM12的異常高表達(dá)參與了腫瘤侵襲和遷徙并最終增強(qiáng)了腫瘤的轉(zhuǎn)移。本研究顯示，ADAM12 高表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度相關(guān)，這也說(shuō)明ADAM12 具有向周?chē)M織侵襲和遷移的能力；同時(shí)，高表達(dá)的ADAM12 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期相關(guān)，說(shuō)明高表達(dá)的ADAM12 能夠增強(qiáng)腫瘤向周?chē)M織轉(zhuǎn)移的能力。

總之，ADAM12 在結(jié)直腸癌中呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)，而過(guò)表達(dá)的ADAM12 與結(jié)直腸癌患者的腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期密切相關(guān)，說(shuō)明ADAM12 在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起到促癌的作用并與結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，為ADAM12 作為結(jié)直腸癌診斷和預(yù)防的重要腫瘤學(xué)標(biāo)志物以及作為結(jié)直腸癌的一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。此外，本研究結(jié)果也存在一定不足之處，研究樣本相對(duì)較少，且研究結(jié)果尚未進(jìn)行細(xì)胞功能試驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。