基于生物信息學(xué)檢測(cè)NSUN2 基因在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義

張 群，田秋思，唐鋮鋮，馮 光，路宏朝

（1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.三二〇一醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 漢中 723000）

人腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，預(yù)后差，其中以多形性膠質(zhì)瘤（glioblastoma multiforme，GBM）惡性程度最高，患者總生存時(shí)間僅10～15 個(gè)月[1]。人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，具體機(jī)制仍不清楚。相關(guān)基因表達(dá)異常在人腦膠質(zhì)瘤尤其是NSUN2 的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[2]。因此，篩選人腦膠質(zhì)瘤特異且敏感的差異表達(dá)基因有助于認(rèn)識(shí)人腦膠質(zhì)瘤，同時(shí)有利于人腦膠質(zhì)瘤的早期診斷和精準(zhǔn)治療。5-甲基細(xì)胞嘧啶（m5C）通過(guò)RNA 代謝調(diào)節(jié)，特別是RNA 穩(wěn)定性、RNA 導(dǎo)出RNA、mRNA 翻譯和RNA 處理參與腫瘤的發(fā)生[3，4]。NOP2/Sun 結(jié)構(gòu)域家族成員2（NSUN2）也被稱為MYC 誘導(dǎo)的SUN 結(jié)構(gòu)域含蛋白（Misu），是催化m5C 形成的主要m5C 修飾酶。根據(jù)免疫組化學(xué)（IHC）分析，NSUN2 在各種腫瘤中均高度表達(dá)，包括食管、肝臟、胰腺、子宮頸、腎、胃、甲狀腺和乳腺癌[5-8]。研究表明[4]，NSUN2 通過(guò)與其3'-UTR 中的m5C 修飾位點(diǎn)結(jié)合穩(wěn)定HDGF癌基因的mRNA 來(lái)促進(jìn)膀胱癌的進(jìn)展。然而，關(guān)于NSUN2 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用的研究還很少。本研究使用癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)集分析NSUN2 基因在正常腦組織與GBM 中的表達(dá)差異，以及NSUN2 與GBM 患者臨床病理特征的相關(guān)性，旨在為深入研究GBM 的靶向治療提供思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 從TCGA（https:/lcancergenome.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載GBM 的mRNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)，包含1150 例正常腦組織和689 例GBM 組織，同時(shí)下載對(duì)應(yīng)的患者臨床資料，采用R 軟件和Perl 語(yǔ)言預(yù)處理數(shù)據(jù)。

1.2 數(shù)據(jù)集篩選和差異表達(dá)分析 剔除TCGA 數(shù)據(jù)集中臨床病理參數(shù)不完整及缺乏預(yù)后隨訪資料的樣本，僅保留同時(shí)包含臨床參數(shù)和生存數(shù)據(jù)的樣本，利用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)確定NSUN2 基因在正常腦組織和GBM 組織中的表達(dá)差異，采用R 軟件（3.5.2）的“l(fā)imma”軟件包完成差異分析并繪制差異散點(diǎn)圖[9]。

1.3 生存分析與臨床相關(guān)性分析 根據(jù)樣本中NSUN2 基因表達(dá)的中位值將NSUN2 分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，采用R 軟件的“survival”軟件包進(jìn)行生存分析，采用“survminer”軟件包繪制生存曲線，單因素和多因素Cox 風(fēng)險(xiǎn)模型分析臨床參數(shù)與GBM 預(yù)后的關(guān)系，并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）。

1.4 基因集富集分析 采用CSEA 軟件（4.0.2）（http:/lsoftware.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）進(jìn)行富集分析。采用CSEA 網(wǎng)站的MsigDB 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 數(shù)據(jù)集，設(shè)置分析置換次數(shù)為1000 次，顯著富集基因集需滿足以下條件：錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rates，F(xiàn)DR）＜0.25，P＜0.05。

1.5 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 選取符合納入和排除標(biāo)準(zhǔn)9 例膠質(zhì)瘤組織與癌旁正常組織標(biāo)本作為本實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：在西安交通大學(xué)附屬三二〇一醫(yī)院明確診斷為GBM 的患者；IBM為18.5～25 kg/m2；年齡20～65 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在嚴(yán)重的心、肺、腎等嚴(yán)重的內(nèi)科合并癥；臨床資料不完整。按照Trizol 試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA 后，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Accurate）進(jìn)行RNA 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA 用于進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)驗(yàn)，以小鼠GAPDH 作為內(nèi)參。同時(shí)，選取的5 例患者標(biāo)本所制作的5 組GBM 組織和癌旁組織的石蠟切片，將5 組患者膠質(zhì)瘤與癌旁標(biāo)本通過(guò)三步法進(jìn)行NSUN2 作為一抗的免疫染色，觀察免疫染色后的陽(yáng)性結(jié)果的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)采用DAB 染色，陽(yáng)性結(jié)果顯色為黃褐色。其中一抗采用Cell Signaling Technology 的NSUN2 兔源多克隆抗體。引物序列見(jiàn)表1。

表1 各蛋白基因引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（）表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，采用單因素和多因素Cox 回歸分析挑選預(yù)后相關(guān)因子，相關(guān)性分析采用皮爾森相關(guān)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSUN2 在GBM 組織中的表達(dá)情況 NSUN2 在GBM 組織中的表達(dá)高于正常腦組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）﹐見(jiàn)圖1。

圖1 NSUN2 在GBM 組織中的表達(dá)情況

2.2 NSUN2 表達(dá)情況與GBM 患者臨床病理特征的關(guān)系 NSUN2 表達(dá)與GBM 患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，見(jiàn)圖2。不同年齡、臨床分期、TP53 分型的GBM 患者NSUN2 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不同性別的GBM 患者NSUN2 表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3。單因素Cox 回歸分析顯示，NSUN2 mRNA 的高表達(dá)、WHO 分級(jí)、應(yīng)答深度、1p/19q 雜合性缺失以及IDH1 基因野生型可降低患者的總生存期，性別與患者預(yù)后無(wú)關(guān)；將上述有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入多因素的Cox 回歸模型分析，結(jié)果顯示治療結(jié)果、IDH1 基因野生型和年齡是患者總生存期的獨(dú)立影響因素，見(jiàn)表2。

表2 GBM 預(yù)后影響因素的單因素、多因素Cox 回歸分析

圖2 NSUN2 基因mRNA 表達(dá)與GBM 患者預(yù)后的相關(guān)性

圖3 NSUN2 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 基因集富集分析 GSEA 分析結(jié)果表明，NSUN2基因高表達(dá)組GBM 樣本主要富集于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、合成蛋白、整合素、反應(yīng)性膠原形成信號(hào)通路，見(jiàn)圖4。

圖4 NSUN2 相關(guān)富集基因集

2.4 NSUN2 mRNA 在GBM 組織中的表達(dá)情況q-PCR實(shí)驗(yàn)顯示，NSUN2 mRNA 的表達(dá)在GBM 組織中上調(diào)，見(jiàn)圖5，其中NSUN2 mRNA 在GBM 組織中的表達(dá)量高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IHC 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NSUN2 在GBM 組織呈中等程度的胞核陽(yáng)性，且NSUN2 mRNA 在GBM 組織的表達(dá)水平高于癌旁組織，見(jiàn)圖6。

圖5 NSUN2 mRNA 在GBM 組織和癌旁組織的表達(dá)比較

圖6 NSUN2 蛋白在GBM 組織和癌旁組織的表達(dá)比較

3 討論

本研究顯示，NSUN2 在GBM 中的表達(dá)高于癌旁組織組，NSUN2 高表達(dá)組的總生存期低于低表達(dá)組（P＜0.05），提示NSUN2 高表達(dá)是GBM 患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。另外，本研究采用qPCR 技術(shù)和IHC 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了膠質(zhì)瘤組織中NSUN2 表達(dá)上調(diào)。有報(bào)道顯示，包括NSUN2 在內(nèi)的幾種RNMT 的表達(dá)在DNA拷貝數(shù)和mRNA 表達(dá)之間具有正相關(guān)性，并且與乳腺癌患者的更高級(jí)別侵襲性亞型和不良預(yù)后相關(guān)[10]。在皮膚癌中，NSUN2 的表達(dá)缺失與惡性腫瘤的增加相關(guān)[11]。在卵巢癌中，NSUN2 低表達(dá)和IGF2 高表達(dá)的患者具有較差的總體和無(wú)疾病進(jìn)展生存率，因此NSUN2/IGF2 信號(hào)已被確定具有預(yù)后生存價(jià)值[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，NSUN2 在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）中的表達(dá)上調(diào)約2 倍，這與患者的總生存期縮短和較高的死亡率風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[13]。此外，NSUN2 高表達(dá)與HNSCC 中的T 細(xì)胞活化相關(guān)，NSUN2 低表達(dá)患者的T 細(xì)胞活化評(píng)分與死亡率之間存在正相關(guān)，這表明HNSCC 中NSUN2 表達(dá)可作為免疫檢查點(diǎn)的標(biāo)志物[14]。有研究明確了NSUN2 在胃癌中的作用，發(fā)現(xiàn)NSUN2 通過(guò)以m5C 依賴的方式抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶p57Kip2，在體外和體內(nèi)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[15]。這些研究均證明了NSUN2 在腫瘤中的重要作用，但NSUN2 在膠質(zhì)瘤中的作用還需要進(jìn)一步闡明。

本研究中，單因素和多因素Cox 的分型顯示，NSUN2 和病理分級(jí)在GBM 中是兩個(gè)獨(dú)立預(yù)后因子。在與GBM 患者臨床特征關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，不同年齡、病理分級(jí)﹑性別以及腫瘤分期的GBM 患者NSUN2 表達(dá)均有差異。進(jìn)一步對(duì)NSUN2 高低表達(dá)組進(jìn)行差異分析，并對(duì)所得的差異基因進(jìn)行功能富集﹐發(fā)現(xiàn)差異基因主要和整合素及蛋白聚糖相關(guān)通路有關(guān)，這也提示蛋白代謝可能參與GBM 的發(fā)生發(fā)展。蛋白質(zhì)合成是所有細(xì)胞的基本過(guò)程，但其在發(fā)育、干細(xì)胞和癌癥中的精確調(diào)控作用尚不清楚。研究顯示，NSUN2 在m5C 轉(zhuǎn)錄后甲基化轉(zhuǎn)移RNA（TRNA）是一種新的抑制蛋白質(zhì)合成的機(jī)制[16，17]。NSUN2 的缺失導(dǎo)致tRNA 的低甲基化，使血管生成素能夠內(nèi)切tRNA，并積累5'tRNA 片段[16-19]，這些片段可抑制帽依賴的蛋白質(zhì)翻譯[20-22]，這與GSEA 富集的結(jié)果一致。還有研究顯示[23]，NSUN2 基因雙等位基因功能的缺失變異與青少年白內(nèi)障或腦異常疾病相關(guān)，提示NSUN2 與GBM 存在的相關(guān)性。GSEA 分析顯示，NSUN2 高表達(dá)組在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)通路中有顯著富集。

綜上所述，GBM 組織中NSUN2 基因呈高表達(dá)狀態(tài)，并且與患者的臨床病理特征密切相關(guān)，可以為GBM 診斷和治療的提供新思路。