黃獨微型塊莖環(huán)阿屯醇合酶基因克隆與序列分析

柯維忠 曾曉健 徐婷 劉霞霞 胡品書 游檢

摘要：獲取黃獨皂苷合成途徑關(guān)鍵酶環(huán)阿屯醇合酶（CAS）的基因全長 cDNA 序列，并進(jìn)行序列分析。通過黃獨微型塊莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選得到 CAS基因的核心片段，利用RT-PCR 技術(shù)獲得CAS 基因保守片段，采用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)獲得CAS 基因的 3′及 5′末端序列，并采用生物信息學(xué)方法進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明，黃獨微型塊莖CAS基因編碼序列長2 280 bp，編碼814 bp的氨基酸序列，相對分子量為86 665.17 u，等電點為 6.21。CAS蛋白主要是由α螺旋（3366%）、延伸鏈（21.62%）以及無規(guī)則卷曲（44.72%）構(gòu)成。CAS蛋白為親水性蛋白，無信號肽，三級結(jié)構(gòu)為單體，含有CAS所必需的功能結(jié)構(gòu)域，具有PLN03012多元結(jié)構(gòu)域。CAS蛋白主要存在于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可能為膜蛋白。黃獨CAS蛋白與其他植物的CAS 蛋白同源性較高，其中與菊葉薯蕷的CAS蛋白氨基酸相似性為9605%。從黃獨微型塊莖中首次獲得 CAS 基因 cDNA 全長序列，該基因具有 CAS 同源基因的典型特征。

關(guān)鍵詞：黃獨;微型塊莖;環(huán)阿屯醇合酶;基因克隆;序列分析

中圖分類號： R282;S188文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）04-0029-07

收稿日期：2021-05-26

基金項目：江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究一般項目（編號：GJJ190877）;國家自然科學(xué)基金（編號：31360072）;上饒市科技局平臺載體建設(shè)項目（編號：2019I017、2020I001、2020J001）。

作者簡介：柯維忠（1976—），男，江西上饒人，實驗師，主要從事植物生物技術(shù)研究。E-mail：258536862@qq.com。

黃獨（Dioscorea bulbifera L.）為薯蕷科薯蕷屬纏繞草質(zhì)藤本植物[1]。黃獨地下塊莖（俗稱黃藥子）藥性寒、味苦，有小毒，能清熱解毒、涼血止血、化痰消癭[2-3]。黃藥子生物活性廣泛[4]，臨床上多用于治療甲狀腺腫等疾病，療效顯著[5]。黃藥子化學(xué)成分豐富，其特有的成分為黃獨總皂苷[6-7]。研究表明，甾醇皂苷是由異戊二烯途徑合成的。環(huán)阿屯醇合酶（cycloartenol synthase，CAS）可將鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SE）催化成為環(huán)阿屯醇，這個反應(yīng)是異戊二烯代謝途徑中進(jìn)一步合成甾醇皂苷的必經(jīng)步驟[8]。因此，CAS 是植物甾醇及甾體類物質(zhì)生物合成的第一個關(guān)鍵酶，其基因的克隆和序列分析受到了專家和學(xué)者重視。因此，研究黃獨環(huán)阿屯醇合酶的基因克隆與序列分析具有現(xiàn)實意義。

目前，對環(huán)阿屯醇合酶基因克隆與序列分析的研究主要集中在葫蘆巴（Trigonella foenum-graecum L.）[9]、丹參（Salvia miltiorrhiza）[10]、滇重樓[Paris polyphylla Smith var. yunnanensis （Franch.） Hand.-Mazz.][11]和盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis C.H.Wright）[8]等植物上，而關(guān)于黃獨環(huán)阿屯醇合酶基因的克隆與序列分析未見報道。近年來，黃獨的藥用價值愈加得到人們重視，黃獨的市場需求較為旺盛，造成黃獨資源的缺乏。因此，采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對其進(jìn)行育苗，是提高黃獨種苗的有效途徑。目前，對黃獨的莖尖脫毒快繁[12]、種質(zhì)超低溫保存[13]以及微型塊莖誘導(dǎo)形成[14]等方面已經(jīng)開展研究，今后利用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法提高總皂苷的產(chǎn)量，也是總皂苷生產(chǎn)的一個總方向[15]。因此，對黃獨環(huán)阿屯醇合酶基因進(jìn)行克隆與序列分析可以為黃獨細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)總皂苷提供靶向篩選選擇。本研究擬以黃獨微型塊莖為材料，采用CDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)克隆其皂苷合成代謝途徑中的黃獨環(huán)阿屯醇合酶（CAS）基因，并對其進(jìn)行序列分析，為進(jìn)一步研究黃獨總皂苷合成代謝機(jī)制和利用次生代謝工程的手段提高黃獨品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃獨試管苗微型塊莖由上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室提供。試驗時間：2016年10月至2017年3月。試驗地點：上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 以從黃獨微型塊莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選的CAS基因中間序列為基礎(chǔ)，利用Primer 5軟件設(shè)計引物：RC190-CAS-1F（A A C A Y A T W C A T T A T G A A G A T G A G A A C A）;RC190-CAS-1R（C C A W G C A C C T T T W G A A A T G T G A C）;RC190-CAS-1R1（C C A R C C A C C W G A A G G W A G C T S T）。接頭引物：3′adaptor（G C T G T C A A C G A T A C G C T A C G T A A C G G C A T G A C A G T G T T T T T T T T T T T T T T T T T T）;5.3′outer（G C T G T C A A C G A T A C G C T A C G T A A C）;5.3′inner（G C T A C G T A A C G G C A T G A C A G T G）;AUAP（G G C C A C G C G T C G A C T A G T A C）;AAP（G C C A C G C G T C G A C T A G T A C G G G G G G G G G G）。3′RACE 特異性引物：RC190-CAS-F3（G A T G C A A A A C G G C T T T A T G A T G C T G T C）;RC190-CAS-F4（G G C T T T G C C A C T T A T G A A C T G A C A C G A T）;RC190-CAS-F4i（G A G A T C C A A A A C C A T T G C A T）。5′RACE 特異性引物：RC190-CAS-R10（T G T G A C C C T C G A T G T G T A A A C C C C A A）;RC190-CAS-R9（G C C C C A T C T C C T C C T T C A G C T T C T T）;RC190-CAS-R6（G C A G G T G C A A C T T A A A G G C C T C T G A A T T）;RC190-CAS-R5（G G C T G C C A T T A T A A C C C T G C A T T T T C A T）;RC190-CAS-RT1（C C A C C A T C T T C A T T C A T G A G G G A A A G G A T）。

1.2.2 RNA抽提與純化 RNA抽提與純化采用柱式Trizol總RNA提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司的試劑盒SK1312]。采用1.5%瓊脂糖進(jìn)行電泳，經(jīng)1×TAE電泳緩沖液，在紫外透射光下進(jìn)行觀察并對其拍照。

1.2.3 cDNA第一鏈合成 在0.2 mL PCR管中加入total RNA（10 μL）和 3′adaptor（1 μL）。70 ℃溫浴 5 min，然后冰浴2 min，加入 5× First-Strand Buffer 4.0 μL、10 mmol dNTP 2 μL、RNase抑制劑1 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶2 μL進(jìn)行離心（總體積 20.0 μL）。離心后42 ℃溫浴60 min，再72 ℃溫浴10 min。

1.2.4 基因調(diào)取 PCR反應(yīng)體系（總體積25 μL）：2×GC Buffer Ⅰ 12.5 μL、10 μmol/L RC190-CAS-1F 0.5 μL、10 μmol/L RC190-CAS-1R/RC190-CAS-1R1 0.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 4 μL、ddH2O 6.3 μL、cDNA模板1 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL。PCR循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，33個循環(huán);72 ℃修復(fù)延伸7 min。利用柱式DNA膠回收試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司試劑盒B518131]進(jìn)行PCR電泳與回收。經(jīng)1%糖凝膠電泳觀察結(jié)果后，對PCR產(chǎn)物膠進(jìn)行回收測序。

1.2.5 3′RACE 第一輪巢氏PCR反應(yīng)體系（以3′adaptor為反轉(zhuǎn)引物的cDNA為模版）（總體積 25 μL）：2×GC Buffer Ⅰ 12.5 μL、10 μmol/L RC190-CAS-F3 0.5 μL、10 μmol/L 5.3′outer 0.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 4 μL、ddH2O 6.3 μL、模板（cDNA）1 μL、5 U/μL Taq 酶0.2 μL。第二輪巢氏PCR反應(yīng)體系（以3′adaptor為反轉(zhuǎn)引物的cDNA為模版）（總體積50 μL）：2×GC Buffer Ⅰ 25 μL、10 μmol/L RC190-CAS-F4 1 μL、10 μmol/L 5.3′inner 1 μL、2.5 mmol/L dNTP 8 μL、ddH2O 12.5 μL、模板（第一輪PCR稀釋產(chǎn)物） 1 μL、5 U/μL Taq酶 0.5 μL。第一輪PCR循環(huán)條件：95 ℃ 預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，33個循環(huán);72 ℃修復(fù)延伸7 min。第二輪PCR循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，33個循環(huán);72 ℃修復(fù)延伸7 min。利用柱式DNA膠回收試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司試劑盒B518131]進(jìn)行PCR電泳與回收。經(jīng)1%糖凝膠電泳觀察結(jié)果后，對PCR產(chǎn)物膠進(jìn)行回收測序。

1.2.6 5 ′RACE 第一輪巢氏PCR反應(yīng)體系（末端加C法，以特異性引物RC190-CAS-RT1反轉(zhuǎn)，得到cDNA，經(jīng)核糖核酸酶H（RNase H）和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）處理后，進(jìn)行巢氏PCR，操作步驟見Invitrogen 5′ RACE系統(tǒng)手冊）（總體積25 μL）：2×GC Buffer Ⅰ 12.5 μL、10 μmol/L AAP 0.5 μL、10 μmol/L RC190-CAS-R5/RC190-CAS-R9 05 μL、25 mmol/L dNTP 4 μL、ddH2O 6.3 μL、模板（cDNA） 1 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL。第二輪巢氏PCR反應(yīng)體系（末端加C法，以特異性引物RC190-CAS-RT1反轉(zhuǎn)，得到cDNA，經(jīng)RNase H 和TdT處理后，進(jìn)行巢氏PCR，操作步驟見Invitrogen 5′ RACE系統(tǒng)手冊）（總體積50 μL）：2×GC Buffer Ⅰ 25 μL、10μmol/L AUAP 1 μL、10 μmol/L RC190-CAS-R6/RC190-CAS-R10 1 μL、2.5 mmol/L dNTP 8 μL、ddH2O 12.5 μL、模板（第一輪PCR稀釋產(chǎn)物）1 μL、5 U/μL Taq酶 05 μL。第一輪PCR循環(huán)條件：95 ℃ 預(yù)變性 3 min;94 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸 60 s，33個循環(huán);72 ℃修復(fù)延伸7 min。第二輪PCR循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，33個循環(huán);72 ℃修復(fù)延伸7 min。按照柱式DNA膠回收試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司試劑盒B518131]進(jìn)行PCR電泳與回收。經(jīng)1%糖凝膠電泳觀察結(jié)果后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序。

1.2.7 序列拼接 利用 DNAMAN 軟件將中間序列及RACE試驗得到的序列進(jìn)行拼接，得到基因全長序列。

1.2.8 分析方法 測序獲得的基因cDNA序列經(jīng)NCBI的ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）服務(wù)器，進(jìn)行開放閱讀框分析。此外，借助ProtParam pI/Mw（http：//web.expasy.org/compute_pi）、GOR IV（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）、SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）軟件預(yù)測目標(biāo)序列一、二、三級結(jié)構(gòu);再依次利用 SigalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和 ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）軟件預(yù)測基因編碼氨基酸的信號肽和疏水性/親水性;最后使用Blastp 工具在NCBI 上查找基因同源氨基酸序列，并運用MEGA 4.0軟件中的近鄰相接法（nerghbor-joining，NJ）（1 000次Bootstrap）構(gòu)建同源進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 提取

黃獨微型塊莖總RNA的電泳圖見圖1。左側(cè)泳道可清晰觀察到28S和18S 2條區(qū)帶，表明提取的RNA較為完整，質(zhì)量較高，可用于RT-PCR。

2.2 黃獨微型塊莖CAS基因克隆

通過RACE技術(shù)（圖2），得到全長為2 280 bp的cDNA序列（圖3），G+C含量為45.70%，A+T含量為54.30%，堿基組成見圖4。經(jīng)NCBI的ORF finder進(jìn)行開放閱讀框分析，得到814 bp的氨基酸序列（圖5）。

2.3 CAS基因預(yù)測氨基酸的一級結(jié)構(gòu)分析

Protparam預(yù)測顯示該蛋白由759個氨基酸組成，分子量為86 665.17 u，等電點為6.21，為親水性蛋白。氨基酸的組成和比例為49個丙氨酸 （Ala），占6.5%;40個精氨酸 （Arg），占5.3%;31個天冬酰胺 （Asn），占4.1%;36個天冬氨酸（Asp），占47%;19個半胱氨酸（Cys），占2.5%;24個谷氨酰胺 （Gln），占3.2%;50個谷氨酸（Glu），占6.6%;59個甘氨酸 （Gly），占7.8%;27個組氨酸 （His），占3.6%;42個異亮氨酸（Ile），占5.5%;79個亮氨酸（Leu），占10.4%;35個賴氨酸 （Lys），占 4.6%;22個甲硫氨酸 （Met），占2.9%;28個苯丙氨酸 （Phe），占3.7%;41個脯氨酸 （Pro），占5.4%;47個絲氨酸 （Ser），占6.2%;33個蘇氨酸 （Thr），占4.3%;27個色氨酸 （Trp），占3.6%;33個酪氨酸 （Tyr），占4.3%;37個纈氨酸 （Val），占4.9%。負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為86;正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為75;原子總數(shù)為12 058個，具體組成如下：碳原子3 917個，氫原子5 950個，氮原子1 050個，氧原子1 100個，硫原子41個。

2.4 CAS蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

由GOR IV軟件預(yù)測（圖6和表1）得知，CAS蛋白主要是由α螺旋（圖6中藍(lán)色部分，占33.66%）、延伸鏈（圖6中紅色部分，占21.62%）以及無規(guī)則卷曲（圖6中黃色部分，占44.72%）構(gòu)成，該蛋白質(zhì)可能不含β折疊結(jié)構(gòu)。

2.5 CAS蛋白親水性/疏水性預(yù)測

通過ProtScale軟件預(yù)測分析，從圖7可知，圖中的高峰值（正值）的區(qū)域表示疏水的區(qū)域，而負(fù)值的低谷區(qū)域是親水區(qū)域。 由親疏水性分析可知，該蛋白為親水性蛋白質(zhì)。

2.6 CAS蛋白信號肽預(yù)測與分析

SignalP 4.0 Server軟件預(yù)測結(jié)果（表2）顯示，CAS編碼蛋白的第25位苯丙氨酸殘基可能是信號肽原始剪切位點，其最高預(yù)測分值及最高的信號肽分值分別僅為0.168、0.277，第35位丙氨酸殘基的最高綜合剪切位點分值0.201，綜合分析結(jié)果表明CAS蛋白無信號肽。

2.7 CAS蛋白三級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果顯示，CAS蛋白質(zhì)主要由α螺旋、延伸鏈以及無規(guī)則卷曲構(gòu)成，與二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致。SWISS-MODEL預(yù)測結(jié)果顯示其三級結(jié)構(gòu)為單體。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，CAS蛋白包含有CAS所必需的功能結(jié)構(gòu)域（圖8）。

2.8 CAS蛋白功能預(yù)測

通過CAS氨基酸序列比對KEGG數(shù)據(jù)庫，得到直系同源KEGG號：K01853（http：//www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？K01853）（圖9）。參與 2，3-環(huán)氧角鯊烯生成環(huán)阿屯醇的酶促反應(yīng)過程。

2.9 CAS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

經(jīng)軟件分析，該蛋白屬于 IDOPREN_C2_like superfamily，具有PLN03012多元結(jié)構(gòu)域。

2.10 CAS蛋白亞細(xì)胞定位

采用 Psort在線軟件對CAS基因的表達(dá)部位進(jìn)行預(yù)測結(jié)果（圖10）表明，定位于質(zhì)膜（plas）中的數(shù)量為6，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（E.R.）中的數(shù)量為4，葉綠體（chlo）中的數(shù)量為1，細(xì)胞核（nucl）中的數(shù)量為1，細(xì)胞質(zhì)（cyto）中的數(shù)量為1，線粒體（mito）中的數(shù)量為1，表明CAS蛋白主要存在于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。該蛋白可能為膜蛋白。

2.11 CAS蛋白的氨基酸同源性分析

應(yīng)用NCBI中的BlastP程序，對CAS蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析（圖11）發(fā)現(xiàn)，該蛋白與菊葉薯蕷（Dioscorea composite，AIW81530.1）的CAS蛋白氨基酸相似性為96.05%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析也顯示，該蛋白與菊葉薯蕷CAS蛋白（AIW81530.1）親緣關(guān)系較近。

3 討論

薯蕷皂苷廣泛存在于藥用植物中，如薯蕷科、百合科、石竹科和薔薇科等，尤其在薯蕷屬植物根莖中含量豐富[16-17]，具有抑瘤、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等多種藥用活性[9]。薯蕷皂苷為糖綴合物，1個或多個糖鏈連接于非極性三萜或類固醇苷骨架，化學(xué)結(jié)構(gòu)類似甾體激素[18]。因此，薯蕷皂苷廣泛用于激素類藥物的合成，是醫(yī)藥工業(yè)中僅次于抗生素的世界第二大類藥物，被譽為“激素之母”，我國薯蕷皂苷年產(chǎn)量約為3 500 t，占全世界年需求總量的70%[19]。研究表明，膽固醇或 β-谷甾醇是薯蕷皂素的合成前體，而薯蕷皂素合成的必經(jīng)中間體是環(huán)阿屯醇[20]。氧化鯊烯環(huán)化酶家族中一個重要成員是CAS，它可以催化2，3-氧化鯊烯轉(zhuǎn)化為環(huán)阿屯醇[21]，CAS基因是環(huán)阿屯醇合成的關(guān)鍵調(diào)控基因，也是甾醇及甾體類物質(zhì)生物合成的重要環(huán)化酶[22]。環(huán)阿屯醇為植物甾醇類化合物，是甾醇類化合物生物合成的關(guān)鍵前體物質(zhì)，可抗炎、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)膽固醇等。目前，CAS基因已從葫蘆巴（Trigonella foenum-graecum L.）[9]、丹參（Salvia miltiorrhiza）[10]、滇重樓[Paris polyphylla Smith var. yunnanensis （Franch.） Hand.-Mazz.][11]和盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis C.H.Wright）[8]等多種植物中分離和克隆，并對其序列特征進(jìn)行了分析。

微型塊莖別稱“零余子”“小塊莖”“珠芽”，是腋芽形成的地上變態(tài)小塊莖顆粒，特指薯蕷屬植物組培試管苗腋芽處極易誘導(dǎo)形成且附生較多氣生根的小型變態(tài)塊莖[23]，可以在黑暗和低溫處長期保存且可恢復(fù)活力萌芽，具有體積小、便于儲存和運輸?shù)葍?yōu)點[23]，不僅可作為薯蕷屬植物田間繁殖的生產(chǎn)種子，也可作為薯蕷皂苷提取和生產(chǎn)的重要來源[24]。本試驗通過對黃獨微型塊莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選到CAS基因的中間序列核心片段，利用RACE 技術(shù)獲取該基因全長cDNA序列，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，CAS基因編碼序列長2 679 bp，編碼814 bp的氨基酸序列，相對分子量為 92 703.04 u，等電點為 621。這是在黃獨中首次分離得到該基因，研究結(jié)果對下一步利用該基因構(gòu)建表達(dá)載體，分析其在微型塊莖誘導(dǎo)形成過程中所具有的功能具有重要意義。同時，也為進(jìn)一步研究黃獨總皂苷合成代謝機(jī)制和利用次生代謝工程的手段提高黃獨品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]巫圣乾，張 璐，龔夢鵑，等. 黃獨素B致小鼠急性肝損傷的代謝組學(xué)研究[J]. 中國藥房，2018，29（22）：3046-3050.

[2]杜樂梅，付淑軍，吳增光，等. 黃獨素B的體外代謝通路及其代謝產(chǎn)物研究[J]. 中草藥，2019，50（23）：5760-5766.

[3]劉勁松，高衛(wèi)娜，鄭 娟，等. 黃獨鮮塊根化學(xué)成分研究[J]. 中國中藥雜志，2017，42（3）：510-516.

[4]李 軍，劉 晨，王君明，等. 黃藥子黃獨素B活性、毒性及配伍減毒[J]. 中國老年學(xué)雜志，2019，39（15）：3846-3848.

[5]付淑軍，袁 圓，石小娜，等. 黃獨中二萜內(nèi)酯類成分的LC-MS/MS分析方法的建立[J]. 中藥材，2019，42（10）：2335-2338.

[6]李春紅，梅志強，田 吉，等. 黃獨總皂苷的含量測定研究[J]. 瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，35（6）：577-579.

[7]李春紅，梅志強，田 吉，等. 大孔樹脂對黃獨總皂苷的分離純化工藝優(yōu)選[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（16）：27-29.

[8]涂碧夢，陳永勤，楊之帆. 盾葉薯蕷環(huán)阿屯醇合酶全長基因的克隆與分析[J]. 西北植物學(xué)報，2010，30（1）：8-13.

[9]劉夢迪，李長福，章焰生. 葫蘆巴環(huán)阿屯醇合酶基因的分離及其對薯蕷皂素合成的影響[J]. 植物科學(xué)學(xué)報，2019，37（1）：87-92.

[10]李 珍，王東浩，姚 偉，等. 丹參環(huán)阿屯醇合酶基因克隆及表達(dá)分析[J]. 西北植物學(xué)報，2013，33（7）：1285-1291.

[11]袁夢求，丁春邦，陶 亮，等. 滇重樓環(huán)阿屯醇合酶基因的克隆及序列分析[J]. 中草藥，2012，43（11）：2250-2256.

[12]尹明華，洪森榮. 黃獨脫毒苗快繁技術(shù)的研究[J]. 中草藥，2009，40（12）：1975-1980.

[13]Yin M H，Hong S R.A simple cryopreservation protocol of Dioscorea bulbifera L. embryogenic calli by encapsulation-vitrification[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2010，101（3）：349-358.

[14]洪森榮，尹明華，夏瑾華. 植物生長調(diào)節(jié)劑對黃獨試管苗微型塊莖誘導(dǎo)形成的影響[J]. 中草藥，2014，45（13）：1928-1937.

[15]袁麗紅，周海霞，于 瀟，等. 盾葉薯蕷懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長及薯蕷皂苷元合成[J]. 生物加工過程，2008，6（2）：43-47.

[16]陳亞琴，曹擁軍.薯蕷皂苷的現(xiàn)代藥理學(xué)研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2019，28（23）：2613-2617.

[17]徐 梅，魏怡冰，杜富強，等. 10種黔產(chǎn)薯蕷屬植物葉表皮微形態(tài)特征及分類學(xué)意義[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（24）：82-87.

[18]Ulbricht C，Basch E，Sollars D，et al. Wild yam （Dioscoreaceae）[J]. Journal of Herbal Pharmacotherapy，2003，3（4）：77-91.

[19]楊鵬飛，朱燁婷，方 旭，等. 加壓提取法制備盾葉薯蕷根莖中薯蕷皂苷元[J]. 中成藥，2019，41（11）：2745-2747.

[20]Sonawane P D，Pollier J，Panda S，et al. Plant cholesterol biosynthetic pathway overlaps with phytosterol metabolism[J]. Nature Plants，2017，3：16205.

[21]Stohs S J，Sabatka J J，Rosenberg H.Incorporation of 4-14C-22，23-3H-sitosterol into diosgenin by Dioscorea deltoidea tissue suspension cultures[J]. Phytochemistry，1974，13（10）：2145-2148.

[22]喬 晶，崔晟榕，石宏武，等. 羅漢果環(huán)阿屯醇合酶的同源建模、分子對接及催化環(huán)化的機(jī)理推測[J]. 生物技術(shù)通報，2019，35（2）：101-108.

[23]李俊華，劉世宇，李成龍，等. 鐵棍山藥微型塊莖遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 植物學(xué)報，2019，54（1）：72-80.

[24]李明軍，劉欣英，李 萍，等. 山藥微型塊莖誘導(dǎo)形成的影響因子研究[J]. 中草藥，2008，39（6）：905-910.

[25]李明軍，劉世宇，劉 雯，等. 懷山藥微型塊莖形成過程中的生理生化變化[J]. 植物生理學(xué)報，2017，53（5）：807-814.

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