麩金櫻子中沒食子酸的提取工藝優(yōu)化

余中霞，李振興，何亞芬，方文超，黃道明

1.上饒市檢驗檢測認證院，江西 上饒 334000；2.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006

金櫻子為薔薇科植物金櫻子Rosa laevigata Michx的干燥成熟果實，別名糖罐、山雞頭子、金罌子。10～11 月果實成熟變紅時采收；干燥，除去毛刺。具有固精縮尿、固崩止帶、澀腸止瀉的作用［1］。分布于江西、福建、安徽、江蘇、貴州、臺灣、湖南等地，在江西分布廣泛，主要在九江、樟樹、新余、南昌、上饒等地。金櫻子的藥用價值高，近年國內(nèi)對金櫻子成分和藥理活性成分的研究成果不斷涌現(xiàn)，果肉中有效成分包括黃酮、多糖、酚酸、三萜類等，三萜類具有抗阿爾茨海默病作用［2］，總多酚有降脂作用［3］，多糖具抗氧化活性［4］，有研究表明金櫻子、牛磺酸、枳椇子聯(lián)合用藥對小鼠酒精性肝損傷有保護作用［5］。沒食子酸為金櫻子總酚酸的主要成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒等多種生物活性，可為神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、肝纖維化、糖尿病和腫瘤等的輔助治療［6-8］。但對于麩制金櫻子質(zhì)量標準的研究較少。本實驗采用正交試驗優(yōu)選麩金櫻子的提取工藝，為麩金櫻子的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（配DAD 檢測器，沃特斯科技上海有限公司）；DZKW-S-C 電熱恒溫水浴鍋；Sartorius MSE125P-1CE-DU 型 電 子天 平；普力菲爾FST-IV-10 型超純水機。

1.2 試藥

麩金櫻子飲片，用金櫻子藥材（由江西瑞康堂中藥飲片有限公司提供，經(jīng)上饒市檢驗檢測認證院副主任藥師黃道明鑒定為正品）麩炒；沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110831-201906,純度：91.5 %）；乙腈和甲醇均為HPLC 級（國藥集團化學試劑有限公司），乙醇、磷酸為分析純，超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制工藝

取金櫻子肉100 g,加麥麩10 g，160 ℃炒制3 min［9］，取出，篩去麥麩。

2.2 供試品溶液中沒食子酸含量的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Cyan-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸溶液-乙腈（97∶3）；檢測波長：272 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：28 ℃。

2.2.2 溶液的制備 （1）沒食子酸對照品溶液的配制：精密稱取沒食子酸對照品10.87 mg，置50 mL 量瓶中，加70%甲醇超聲使沒食子酸溶解，定容，搖勻，沒食子酸對照品溶液的濃度為0.198 9 mg/mL(按純度折算)，過濾，即得。（2）供試品溶液的配制：取按“2.1”方法麩制的金櫻子飲片，粉碎，過4 號篩，精密稱取0.5 g，置圓底燒瓶中，加70%甲醇50 mL，稱重，置75 ℃水浴30 min，取出，放冷，補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 正交試驗設計 參照文獻［10-13］，以水浴溫度（A）、甲醇濃度（B）和提取時間（C）為三因素，進行L9（34）正交試驗，以沒食子酸含量為評價性指標，優(yōu)選出對沒食子酸提取顯著的因素，正交設計因素水平見表1，正交試驗設計及沒食子酸含量測定結(jié)果見表2，正交試驗方差分析表3。由表2和表3 可見，水浴溫度（A）和甲醇濃度（B）對提取結(jié)果有顯著影響，即A＞B＞C（水浴溫度＞甲醇濃度＞提取時間），最佳工藝為A2B2C1，即以70%的甲醇為提取溶劑，75 ℃水浴回流30 min。

表1 因素水平表

表2 正交試驗設計與沒食子酸含量結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.2.4 驗證試驗 取麩金櫻子飲片，粉碎，過4 號篩，按最佳工藝進行提取，平行操作3 次，結(jié)果沒食子酸的含量分別為265.43、263.89、264.11 μg/g，平均為264.48 μg/g，RSD 為0.31%，表明該提取工藝穩(wěn)定可靠。

2.2.5 方法學考察 （1）系統(tǒng)適用性試驗：取“2.2.2”項下的溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，進樣量為10 μL，記錄色譜圖。結(jié)果，供試品溶液色譜圖在與對照品溶液色譜圖相應的位置上有相同的色譜峰。沒食子酸峰與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按沒食子酸計不低于3 000。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖：A.對照品溶液，B.供試品溶液

（2）線性關(guān)系考察：精密量取“2.2.2 ”項下沒食子酸對照品溶液0.25 mL，0.50 mL，1.0 mL，2.0 mL，3.0 mL 分別置10 mL 容量瓶中，用70%甲醇稀釋，定容，搖勻，過濾，測定。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制備標準曲 線。得回歸方程Y=3×10-5X-0.007 5，r=0.999 3，沒食子酸在0.497 5 μg/mL～5.970 0 μg/mL 范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系。

（3）精密度試驗：取“2.2.2 ”項下沒食子酸對照品溶液，按“2.2.1”項下方法測定峰面積，連續(xù)進樣測定6 次，記錄主峰面積，計算RSD 為0.25%（n=6），結(jié)果表明儀器精密度良好。

（4）重復性試驗：稱取同一批供試品按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6 份，測得沒食子酸的峰面積的RSD 為1.42%。結(jié)果顯示方法重復性良好。

（5）穩(wěn)定性試驗：取“2.2.2”項下的供試品溶液，室溫放置24 h,每隔2 h 測定一次，沒食子酸RSD為0.45%。表明供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

（6）加樣回收率試驗：取已知含量的供試品，精密稱定6 份，分別精密加入“2.2.2 ”項下沒食子酸對照品溶液0.4 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下方法測定峰面積，計算，得回收率為93.78%，RSD=1.08%。見表4。

3 討論

經(jīng)高效液相色譜儀的DAD 檢測器掃描200～400 nm 范圍內(nèi)的光譜圖，結(jié)果沒食子酸在214 nm和272 nm 波長處有最大吸收；流動相分別比較了不同比例的乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-水；柱溫比較了室溫、28 ℃、35 ℃；當波長為272 nm，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（97∶3）,柱溫 28 ℃時主峰與其他雜質(zhì)峰分離度較好，可用于麩金櫻子中沒食子酸含量測定。

本研究采用正交試驗法，研究了多因素、多水平的常用試驗設計方法［14］。本次試驗數(shù)據(jù)顯示影響因素為水浴溫度＞甲醇濃度＞提取時間，且水浴溫度和甲醇的濃度對沒食子酸的提取影響顯著。本次實驗比較了水浴回流和超聲提取，超聲提取不能很好地控制溫度，故采用水浴回流。比較了乙醇和甲醇作為溶劑，甲醇提取液的目標物質(zhì)濃度更大，雜質(zhì)更少，故采用不同濃度的甲醇提取，結(jié)果表明70%甲醇提取效果最好。經(jīng)工藝驗證，本次研究所制定的提取工藝穩(wěn)定性較好，可操作性強。

目前，《中國藥典》只有金櫻子多糖的含量測定，對其他主要成分未做相關(guān)規(guī)定，且鮮有文獻報道麩制金櫻子的質(zhì)量標準研究。本次試驗主要通過優(yōu)化麩制后金櫻子中沒食子酸的提取工藝，為麩金櫻子的總酚酸測定提供參考。