瑤藥?kù)铒L(fēng)活絡(luò)噴霧劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及微生物限度檢查方法研究

邱瓊?cè)A，李雋永，韋倩，張新林，毛桂福

柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州 545001

祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑是由四方藤、黃鎖梅根、續(xù)斷、鐵包金、五指毛桃、大鉆、雞血藤、石南藤等壯瑤藥組方而成,經(jīng)55%乙醇滲漉制成的外用制劑，具有通經(jīng)活絡(luò)，消腫止痛等功效。該處方在柳州市中醫(yī)醫(yī)院使用多年，臨床主要用于風(fēng)濕痹痛，腰肌勞損。該制劑中原料藥物四方藤［1］在瑤醫(yī)學(xué)中具有祛風(fēng)除濕，舒筋通絡(luò)的作用，可用于崩閉悶（風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎），錐碰江悶（坐骨神經(jīng)痛），改悶（腰痛、腰肌勞損），播沖（跌打損傷）等，是祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑中主要起效的藥味，其指標(biāo)成分巖白菜素具有鎮(zhèn)痛抗炎的作用［2］；續(xù)斷則能強(qiáng)筋骨，續(xù)折傷，是骨傷科常用中藥，其活性成分川續(xù)斷皂苷Ⅵ在現(xiàn)代藥理學(xué)研究中顯示了對(duì)骨組織的保護(hù)作用，同時(shí)也有一定鎮(zhèn)痛作用［3-4］。所以本研究在考慮該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定時(shí)，重點(diǎn)研究了上述兩味藥物的定性與定量的檢驗(yàn)方法。此外，開展制劑的微生物檢驗(yàn)方法研究，是保證制劑安全性的前提［5］，故本研究同時(shí)對(duì)制劑的微生物檢驗(yàn)方法適用性進(jìn)行試驗(yàn)，為祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑的質(zhì)量檢驗(yàn)提供依據(jù)，也為其他民族制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 設(shè)備與試劑

1.1 設(shè)備

1260 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；AL204 分析天平（德國(guó)梅特勒托利多公司）；KQ-800DE 超聲器（昆山市超聲儀器有限公司）；SQP 電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）。ZF-1 型三用紫外分析儀（杭州齊威儀器有限公司）；DNP-9162BS-Ⅲ型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；MJX-100B-Z 型霉菌培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；YRH-150 型生化培養(yǎng)箱（上海姚氏儀器設(shè)備廠）；XG1.C 型臥式壓力滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；VS-1300L-U 型凈化工作臺(tái)、BSL-1004 ⅡA2 型生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥

祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑3 批（20220101、20220201、20220202，均由柳州市中醫(yī)醫(yī)院制劑室生產(chǎn)）；巖白菜素對(duì)照品（批號(hào)：MUST-21060907，純度99.65%），川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品（批號(hào)：MUST-21012211，純度98.95%）均購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)：1105831），胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號(hào)：1105271），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB，批號(hào)：1101551），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，批號(hào)：1105071）等，均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌的CMCC 號(hào)分別是［CMCC（B）26003、CMCC（B）63501、CMCC（B）10 104、CMCC（F）98001、CMCC（F）98003、CMCC（B）44102、CMCC（B）50094］，試驗(yàn)所用菌株均為第3 代，均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 四方藤、續(xù)斷的定性鑒別

2.1.1 四方藤 取樣品20 mL，加石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（2∶1）混合溶液30 mL，振搖，取下層溶液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。另取巖白菜素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。同時(shí)制備相應(yīng)的缺四方藤陰性樣品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)［6］，吸取上述三種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇（2∶2.5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%鐵氰化鉀-2%三氯化鐵（1∶1）的混合溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果如圖1，顯示該方法可行且無(wú)陰性干擾。

圖1 祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑中四方藤的薄層色譜圖

2.1.2 續(xù)斷 取樣品20 mL，用乙醚振搖提取2 次，每次20 mL，棄去乙醚液，再用水飽和的正丁醇提取2 次，每次20 mL，合并正丁醇液，再用氨試液、正丁醇飽和的水各洗滌2 次，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。另取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含2 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。同時(shí)制備相應(yīng)的缺續(xù)斷的陰性樣品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%磷鉬酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果見圖2，顯示該方法可行且無(wú)陰性干擾。

圖2 祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑中續(xù)斷的薄層色譜圖

2.2 巖白菜素、川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量測(cè)定［7-8］

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（見表1）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為212 nm；進(jìn)樣量10 μL。

表1 祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑含量測(cè)定梯度洗脫表

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取巖白菜素、川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL 分別含巖白菜素51.07 μg、川續(xù)斷皂苷Ⅵ207.60 μg 的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取樣品（批號(hào)：20220101）5 mL，置25 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 分別制備缺四方藤與缺續(xù)斷的陰性樣品，并按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性和專屬性試驗(yàn) 按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件對(duì)上述三種溶液進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖3。

圖3 HPLC圖：A.混合對(duì)照品；B.祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑樣品；C.缺四方藤陰性樣品；D.缺續(xù)斷陰性樣品

結(jié)果顯示巖白菜素、川續(xù)斷皂苷Ⅵ與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且無(wú)陰性干擾，表明該方法具有較好的專屬性。

2.2.6 線性關(guān)系考察 取巖白菜素對(duì)照品配制成質(zhì)量濃度分別為12.77、25.54、51.07、76.61、102.14、127.68 μg/mL；川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品配制成質(zhì)量濃度分別為51.90、103.80、207.60、311.40、415.19、518.99 μg/mL 的系列混合對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，巖白菜素和川續(xù)斷皂苷Ⅵ分別在12.77～127.68 μg/mL 和51.90～518.99 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。回歸方程分別為巖白菜素Y=4.11×10X+45.725，r=0.999 7；川續(xù)斷皂苷ⅥY=1.75X+0.178，r=0.999 9。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，以巖白菜素和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的峰面積計(jì)算，RSD 分別為2.88%、1.58%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在0、2、4、6、8、12 h 分別進(jìn)樣，以巖白菜素、川續(xù)斷皂苷Ⅵ的峰面積計(jì)算，RSD 分別為2.81%、0.41%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑（批號(hào)：20220101），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示巖白菜素、川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量的RSD 分別為1.29%、0.32%，說(shuō)明該方法具有良好重復(fù)性。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑（批號(hào)：20220101）6 份各2.5 mL，每份分別加入巖白菜素對(duì)照品510.71 μg、川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品556.98 μg，用50%甲醇定容至25 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率及RSD。詳見表2、表3。結(jié)果顯示巖白菜素、川續(xù)斷皂苷Ⅵ 的平均加樣回收率分別為100.30%、101.04%，RSD分別為0.77%、0.51%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度較高。

表2 巖白菜素加樣回收率試驗(yàn)

表3 川續(xù)斷皂苷Ⅵ加樣回收率試驗(yàn)

2.2.11 樣品的含量測(cè)定 取祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑樣品3批，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4，巖白菜素和川續(xù)斷皂苷的平均含量分別為244.9 μg/mL、789.0 μg/mL，RSD 分別為1.41%、3.56%。

表4 三批祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑的含量測(cè)定結(jié)果

3 微生物計(jì)數(shù)方法學(xué)試驗(yàn)

3.1 微生物檢查常規(guī)法

3.1.1 菌懸液的制備 按《中國(guó)藥典》2020 年版方法，把金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉制成菌落數(shù)不大于104cfu/mL的菌懸液。

3.1.2 供試品溶液的制備 以pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制備1∶10 供試品溶液。試驗(yàn)組：供試品溶液（9.9 mL）5 份，分別加入“3.1.1”項(xiàng)下5 種菌懸液0.1 mL，混勻，各取1 mL 注皿，平行制備2份。供試品對(duì)照組：取供試品溶液（9.9 mL），分別加入試驗(yàn)組對(duì)應(yīng)的稀釋液0.1 mL，混勻，各取1 mL注皿，平行制備2 份。菌液對(duì)照組：分別取“3.1.1”項(xiàng)下5種菌懸液0.1 mL，并用試驗(yàn)組對(duì)應(yīng)的稀釋液9.9 mL 混勻，各取1 mL 注皿，平行制備2 份。

試驗(yàn)菌加樣回收測(cè)定：上述各組，按藥典方法進(jìn)行培養(yǎng)?；厥毡戎?（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù)）/菌液對(duì)照組菌落數(shù)，其范圍應(yīng)為0.5～2.0。結(jié)果見表5，由結(jié)果可知，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌回收比均小于0.5，不滿足加樣回收的要求，表明本樣品1∶10 供試品溶液對(duì)需氧菌、酵母菌有一定的抑制作用，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

表5 常規(guī)法試驗(yàn)菌株回收比（n=3）

3.2 薄膜過(guò)濾法

3.2.1 菌懸液的制備 方法同“3.1.1”項(xiàng)，但制備為各菌落數(shù)不大于100 cfu/mL 的菌懸液。

3.2.2 供試品溶液的制備 先以pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制成1∶10 供試品溶液；再取1∶10供試品溶液1 mL，用100 mL pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋，搖勻，備用。試驗(yàn)組：取混勻的備用供試品溶液進(jìn)行薄膜過(guò)濾，用200 mL pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液分2 次進(jìn)行沖洗，并在末次沖洗中分別加入“3.2.1”項(xiàng)下各菌懸液1 mL。每種菌株平行制備2 張濾膜，菌面朝上，置于相應(yīng)的瓊脂平皿中。供試品對(duì)照組：取混勻的備用供試品溶液進(jìn)行薄膜過(guò)濾，沖洗方法同上述試驗(yàn)組，但無(wú)須加入菌懸液。菌液對(duì)照組：用200 mL pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液分2 次進(jìn)行沖洗，并在末次沖洗液中分別加入各菌懸液1 mL，各平行制備2份進(jìn)行培養(yǎng)。

試驗(yàn)菌加樣回收測(cè)定：分別按需氧菌總數(shù)以及霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)的試驗(yàn)條件進(jìn)行培養(yǎng)，并計(jì)算加樣回收比值。結(jié)果見表6，由結(jié)果可知，使用薄膜過(guò)濾法消除了制劑的抑菌作用，各菌株的回收比均大于0.5，滿足加樣回收的要求，表明該方法適用于祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑的微生物計(jì)數(shù)。

表6 薄膜過(guò)濾法試驗(yàn)菌株回收比（n=3）

3.3 控制菌檢查法的適用性試驗(yàn)

3.3.1 金黃色葡萄球菌 （1）試驗(yàn)組：取“3.2.2”項(xiàng)下1∶10 供試品溶液3 份各10 mL，分別置于100、200、300 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）中，并分別加入“3.2.1”項(xiàng)下含有菌落數(shù)不大于100 cfu/mL的金黃色葡萄球菌懸液1 mL，混勻。（2）菌液對(duì)照組：以10 mL 稀釋液替代供試品溶液加入不同體積TSB 中，其余操作方法與試驗(yàn)組相同。（3）供試品組：取“3.2.2”項(xiàng)下1∶10 供試品溶液10 mL，并以稀釋液代替菌懸液，其余操作方法與試驗(yàn)組相同。（4）稀釋液組：以10 mL 稀釋液代替供試品溶液，不加菌液，其余操作方法與試驗(yàn)組相同。

3.3.2 銅綠假單胞菌 實(shí)驗(yàn)方法同“3.2.1”，所加菌懸液為菌落數(shù)不大于100 cfu/mL 的銅綠假單胞菌按2020 版《中國(guó)藥典》（通則1106）規(guī)定方法培養(yǎng)并劃線，觀察結(jié)果。

結(jié)果顯示，以100、200、300 mL TSB 為培養(yǎng)基體積時(shí)，試驗(yàn)組、菌液對(duì)照組均檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，稀釋液組與供試品組則都無(wú)菌生長(zhǎng)，提示祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌均無(wú)抑菌作用，可用常規(guī)法進(jìn)行該控制菌檢查，且TSB 的培養(yǎng)體積為100 mL。

3.4 微生物限度檢查

根據(jù)上述試驗(yàn)的結(jié)果，需氧菌、霉菌和酵母菌按薄膜過(guò)濾法，控制菌按100 mL TSB 培養(yǎng)體積對(duì)祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑的微生物限度進(jìn)行檢查，結(jié)果見表7。三批樣品均符合2020 年版《中國(guó)藥典》四部對(duì)不含藥材原粉的中藥液體口服制劑及局部給藥制劑的限度要求。

表7 三批樣品微生物限度檢查結(jié)果

4 討論

4.1 薄層鑒別研究

由于四方藤與續(xù)斷均是祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑組方中的主要藥味，故開展定性鑒別研究。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，四方藤的供試品溶液制備時(shí)，單獨(dú)使用甲醇、乙酸乙酯、石油醚（60～90 ℃）去除雜質(zhì)，樣品的斑點(diǎn)均出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，而使用乙酸乙酯-石油醚（60～90 ℃）（1∶2）去除雜質(zhì)，樣品斑點(diǎn)清晰，無(wú)其他干擾。此外，考察了不同溫度（4 ℃、25 ℃），不同濕度（33%、60%、88%）對(duì)樣品中四方藤、續(xù)斷藥材薄層鑒別的影響，發(fā)現(xiàn)溫濕度不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4.2 含量測(cè)定方法研究

本研究摸索了祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑中指標(biāo)成分巖白菜素和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的HPLC 含量測(cè)定方法，預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)巖白菜素和川續(xù)斷皂苷Ⅵ分別在190～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行了紫外掃描，結(jié)果巖白菜素在220 nm 和275 nm 處有最大吸收，川續(xù)斷皂苷Ⅵ在近紫外端212 nm 下具有較強(qiáng)吸收，且這兩個(gè)成分在212 nm處均有較強(qiáng)吸收，故選取212 nm 作為本實(shí)驗(yàn)的吸收波長(zhǎng)。其次，因含量測(cè)定中兩個(gè)待測(cè)指標(biāo)成分極性差異較大［9-10］，故采用梯度洗脫模式達(dá)到分離要求。對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行考察時(shí)，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2%磷酸溶液體系分離效果好，故選擇其為流動(dòng)相。本實(shí)驗(yàn)還對(duì)樣品稀釋溶劑（50%甲醇、70%甲醇、甲醇）進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用70%甲醇或甲醇稀釋時(shí)，巖白菜素的色譜峰出現(xiàn)分叉，可能由于樣品溶劑與流動(dòng)相極性相差較大導(dǎo)致；而用50%甲醇稀釋時(shí)，巖白菜素色譜峰未出現(xiàn)分叉情況。

4.3 微生物檢驗(yàn)方法學(xué)研究

本研究中祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑為使用乙醇滲漉制備的外用制劑，按非無(wú)菌不含藥材原粉的中藥制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)檢查。選擇微生物計(jì)數(shù)方法時(shí)，由于常規(guī)法具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、成本較低的優(yōu)點(diǎn)，故首先采用常規(guī)法試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常規(guī)法對(duì)需氧菌、酵母菌均有一定的抑制作用，故使用薄膜過(guò)濾法消除其抑菌效力，結(jié)果顯示各菌株回收比值滿足具體的要求，所以最終選擇薄膜過(guò)濾法作為該制劑微生物計(jì)數(shù)的方法。分析祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑的抑菌作用，其原料藥物當(dāng)歸［11］、雞血藤［12］、茜草［13-14］、五指毛桃［15］等在現(xiàn)代研究中均顯示了對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用；千斤拔［16］則被發(fā)現(xiàn)對(duì)白色念珠菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌等致病菌均有抑制作用；黑老虎［17］對(duì)枯草芽孢桿菌有一定抑制作用，推測(cè)祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑提取工藝可以提出原料藥物的主要抑菌成分，使該制劑有一定的抑菌作用。

瑤醫(yī)藥是中華民族傳統(tǒng)醫(yī)藥的一部分，在治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕等疾病方面有自己獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，本研究中的祛風(fēng)活絡(luò)噴霧劑處方在臨床使用三十多年，組方亦體現(xiàn)了瑤醫(yī)學(xué)“風(fēng)打”結(jié)合的特征，臨床運(yùn)用患者均反饋良好。本研究為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供了依據(jù)，可用于該制劑的日常檢驗(yàn)。