基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討活血化瘀方治療糖尿病足的作用機(jī)制

賀偉平，黃春

萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院，江西 萍鄉(xiāng) 337055

糖尿病是世界上最普遍的疾病之一，并且與高死亡率指數(shù)相關(guān)，其主要并發(fā)癥之一是糖尿病足［1］。糖尿病足臨床表現(xiàn)為糖尿病患者下肢缺血或下肢神經(jīng)病變，產(chǎn)生足部潰瘍或組織病變，感染或不感染，嚴(yán)重者需要截肢或者導(dǎo)致死亡［2］。古籍最早記載糖尿病足為“脫癰”，后更名為“脫疽”［3］。發(fā)病通常在足趾，呈赤黑色。在中國，50 歲以上的糖尿病人中有8.1%患有糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer,DFU），截肢率和死亡率據(jù)估計為22%和11%［4］。針對此病，西醫(yī)采用手術(shù)或非手術(shù)的方式治療，比如：控制血糖、調(diào)節(jié)代謝、增加足部血液微循環(huán)，減少感染等等［5］，但效果不佳，且治療費(fèi)用高昂，對患者家庭的經(jīng)濟(jì)造成一定的困難。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，關(guān)于DFU 的研究和中醫(yī)診療取得了很大的進(jìn)展。中醫(yī)治療DFU 主要從以下幾個方面入手：中藥外治、針灸推拿和按摩、中藥內(nèi)服等［5］。中藥外治包括外洗、膏藥貼敷、藥粉箍圍、中藥濕敷等。有學(xué)者通過數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)對于糖尿病足的外治方法多為活血祛瘀類、祛風(fēng)除濕類以及清熱消腫等藥物［4,6］。

本研究采用的活血化瘀方是綜合歷代中醫(yī)多年臨床經(jīng)驗，在黃芪桂枝五物湯基礎(chǔ)上加減而成，含黃芪30 g、桂枝10 g、三七30 g、丹參20 g、雞血藤20 g、牛膝15 g、桑枝10 g 和甘草10 g 八味藥。黃芪是補(bǔ)益類中藥，可利水消腫，托毒生肌。桂枝溫通經(jīng)脈，助陽化氣。有研究證明黃芪和桂枝配伍可以降低糖尿病足患者的血糖，降低機(jī)體炎癥［7］。三七化瘀止血，活血定痛，常治療跌打損傷，瘀血腫痛。研究表明三七總甙對糖尿病足患者具有很好的改善作用，可改善缺血病況，提高患者的康復(fù)速度［8］。丹參活血祛瘀，涼血消癰，臨床研究表明丹參注射液對糖尿病足的治療具有較好的療效［9］。雞血藤具有活血補(bǔ)血，舒筋活絡(luò)之功效，有研究表明，雞血藤水提物能改善糖尿病足大鼠模型的潰瘍，降低炎癥因子水平［10］。藥典記載牛膝可以逐瘀通經(jīng)，補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨；桑枝可以祛風(fēng)濕，利關(guān)節(jié)；甘草可調(diào)和諸藥，并能預(yù)防糖尿病并發(fā)癥。

雖然目前尚無其他已發(fā)表的研究關(guān)注本活血化瘀方對糖尿病足的治療效果，但是該方是經(jīng)萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院（以下簡稱我院）專家協(xié)定而成，又經(jīng)我院小樣本臨床實踐證明其對DFU 的作用效果良好，所以該方具有很好的研究價值。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，探討本組方對糖尿病足的藥理機(jī)制?；凇俺煞?靶點-疾病”的互作網(wǎng)絡(luò)揭示藥物和疾病之間的聯(lián)系，活性成分和疾病之間的聯(lián)系，通過分子對接技術(shù)驗證成分靶點之間的作用力，為后續(xù)復(fù)方制劑的進(jìn)一步開發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。

1 方法

1.1 活性成分收集和靶點篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）分別檢索黃芪、桂枝、三七、丹參、雞血藤、牛膝、桑枝和甘草的化學(xué)成分。根據(jù)一定條件進(jìn)行篩選，即口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18，得到該組方的有效成分，然后在數(shù)據(jù)庫里得到有效成分相對應(yīng)的靶點，在Uniprot 數(shù)據(jù)庫將靶點轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的基因靶點。

1.2 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“1.1”方法中收集到的成分和靶點構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)以了解活血化瘀湯活性成分和對應(yīng)靶點之間的關(guān)系。利用Cytoscape 3.9.0 軟件制作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 疾病靶點收集

以“diabetic foot ulcer”或“diabetic foot”為關(guān)鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫中搜索糖尿病足的相關(guān)靶點。刪除重復(fù)的靶點，在Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶點轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的基因靶點。

1.4 共同靶點的篩選

利用Venny 2.1.0 在線平臺分析“1.1”方法中收集到的成分靶點和“1.3”方法中收集到的疾病靶點，取交集，即為活血化瘀方作用于疾病的共同靶點。

1.5 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心作用蛋白的篩選

將交集靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。將網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cystoscope 軟件進(jìn)行結(jié)果分析，根據(jù)度值排名統(tǒng)計，得到藥物與疾病交互靶點中的核心關(guān)鍵靶點。

1.6 關(guān)鍵靶點GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

為了研究活血化瘀方治療DFU 的潛在分子機(jī)制，運(yùn)用Metascape 數(shù)據(jù)庫，對上述獲得的關(guān)鍵靶點進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路分析。GO功能富集分析主要包括生物過程、細(xì)胞組成和分子功能三個方面。

1.7 “藥物-有效成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape 軟件，對活性成分、靶點與通路的結(jié)果進(jìn)行綜合性分析，構(gòu)建“藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.8 分子對接

根據(jù)“1.5”方法中得到的度值排名前3 的核心靶點蛋白及度值排名前3 的成分運(yùn)用AutoDock軟件對兩者進(jìn)行分子對接驗證。首先在PDB 數(shù)據(jù)庫中下載核心靶點蛋白的pdb 格式結(jié)構(gòu)文件。在AutoDock 軟件中進(jìn)行一定的操作，如加氫、去水等修飾該蛋白。然后在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中下載化學(xué)成分的mol2 文件，利用AutoDock 軟件對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。然后在AutoDock 軟件中進(jìn)行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 活血化瘀方活性成分及靶點的獲取

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索黃芪、桂枝、三七、丹參、雞血藤、牛膝、桑枝和甘草的化合物，并按照“1.1”方法中的篩選條件收集化合物，共收集到212 個化合物，其中黃芪20 個，桂枝7 個，三七8個，丹參65 個，牛膝20 個，雞血藤24 個，桑枝3個，甘草92 個。剔除重復(fù)成分后共計212 個，重復(fù)成分如下表1。然后依次收集212 個成分對應(yīng)的靶點，再合并去除重復(fù)的靶點，獲得290 個靶點，運(yùn)用Uniprot 數(shù)據(jù)庫將相關(guān)靶點轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的基因信息。

表1 活血化瘀湯共同有效成分及對應(yīng)靶點數(shù)目

2.2 成分-靶點相互作用

利用Cystoscope 軟件構(gòu)建活血化瘀湯活性成分和靶點網(wǎng)絡(luò)，一共得到483 個節(jié)點，3 246 條邊。通過軟件計算所有節(jié)點度值，我們發(fā)現(xiàn)排名前三的成分為槲皮素，山柰酚和木犀草素。

2.3 糖尿病足的疾病相關(guān)靶點獲取

用“diabetic foot ulcer”或“diabetic foot”分別檢索Genecards、OMIM、TDD 數(shù)據(jù)庫獲得疾病靶點，在OMIM 數(shù)據(jù)庫以“diabetic foot ulcer”為檢索詞獲得595 個靶點，以“diabetic foot”為檢索詞獲得601 個靶點，合并剔除重復(fù)靶點后共624 個。在TDD 數(shù)據(jù)庫分別用兩個檢索詞檢索到靶點20 個。在Genecard 數(shù)據(jù)庫以“diabetic foot ulcer”為檢索詞獲得2 550 個靶點，以“diabetic foot”為檢索詞獲得4 839 個靶點。合并3 個數(shù)據(jù)庫的疾病靶點并剔除重復(fù)靶點后獲得5 349 個靶點。

2.4 交集靶點收集和PPI 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系

利用Venny 2.1.0 在線平臺分析對復(fù)方靶點和疾病靶點取交集，如圖1 所示。205 個共有靶點或為活血化瘀湯治療DFU 疾病的靶點。將205 個交集靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。將205 個交集靶點和“2.1”收集到的活性成分相互關(guān)聯(lián)，剔除沒有交集靶點的成分，得到179個有效成分。將179 個成分和205 個交集靶點用Cystoscope 軟件進(jìn)行分析，得出“成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)互作圖（圖3），根據(jù)度值排名，統(tǒng)計前10 的共表達(dá)基因靶點（表2）。

表2 度值排名前10的活性成分和交集靶點列表

圖1 活血化瘀湯活性成分靶點與DFU疾病靶點的共同靶點韋恩圖

圖2 活血化瘀方治療糖尿病足的靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 活血化瘀方活性成分與糖尿病足的交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 活血化瘀方治療DFU 的分子機(jī)制

利用Metascape 數(shù)據(jù)庫將“2.1”獲得的205 個共有基因靶點進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析。GO功能富集分析依照P 值大小排名繪制條形圖（圖4）。這些結(jié)果表明活血化瘀湯治療DFU 與細(xì)胞對氮化合物的反應(yīng)、對無機(jī)物的反應(yīng)和對異種生物刺激的反應(yīng)活性等相關(guān)。KEGG 通路富集分析依照P 值大小排名繪制氣泡圖（圖5）。結(jié)果表明活血化瘀湯治療DFU 與調(diào)控脂質(zhì)和動脈粥樣硬化，P13K-Akt信號等通路有關(guān)。

圖4 GO功能富集分析

圖5 KEGG信號通路富集分析結(jié)果

2.6 “藥物-有效成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將含有活性成分、交集靶點、富集通路的excel數(shù)據(jù)表導(dǎo)入Cytoscape 軟件，構(gòu)建“藥物-有效成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。見圖6。

圖6 “藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對接驗證

將“2.4”結(jié)果中表2 里面度值居前3 位的活性成分槲皮素，山柰酚，木犀草素與關(guān)鍵靶點PTGS2、ESR1、HSP90AA1 對接，對接得分見表3。最低結(jié)合能越低說明靶蛋白與活性成分之間結(jié)合能力越好。以上結(jié)果表明ESR1、HSP90AA1 與槲皮素，山柰酚，木犀草素之間具有較強(qiáng)的結(jié)合能。PTGS2與槲皮素，山柰酚之間的結(jié)合較弱。以HSP90AA1為例，展示HSP90AA1 與3 個成分之間的結(jié)合如圖7。

圖7 HSP90AA1與槲皮素，山柰酚，木犀草素的分子對接圖

表3 度值排名前3的化合物與主要靶點對接情況 kcal/mol

3 討論

隨著我國人民生活水平的提高，我國糖尿病的流行趨勢不斷攀升，據(jù)《糖尿病流行病學(xué)調(diào)查研究》分析，成人糖尿病患者約占人口11%，嚴(yán)重加重了醫(yī)療負(fù)擔(dān)和患者的痛苦［11］。糖尿病足是糖尿病常見的并發(fā)癥，已發(fā)展成一個非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題［12］。自身的代謝管理、下肢運(yùn)動康復(fù)治療及手術(shù)等方式是目前控制糖尿病足的主要方案［13］，但進(jìn)程并不理想。近年來，隨著中醫(yī)藥不斷進(jìn)步發(fā)展，國家也在出臺政策不斷鼓勵中醫(yī)藥的創(chuàng)新。有不少研究學(xué)者認(rèn)為應(yīng)用中藥治療糖尿病足有很好的治療前景。Zhou 等［14］研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方及相關(guān)藥理活性成分對于促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合有積極作用。

DFU 屬于中醫(yī)的“脫疽”范疇?！懊摼摇逼涿涊d在南齊龔慶宣《劉涓子鬼遺方》沿用至今［3］。脫疽常見“苦渴、數(shù)飲、身熱”等為特征，其病機(jī)多以陰虛燥熱為主，漸至痰瘀內(nèi)結(jié)。如《證治準(zhǔn)繩》曰:“飲食起居，一失其宜，皆能使血瘀滯不行，故百病由瘀血者多”［15］。因此，采用活血化瘀療法可以 “截斷扭轉(zhuǎn)”，阻截疾病的惡化。對于不同類型的DFU 另可輔以清熱解毒、化痰軟堅、溫補(bǔ)脾腎等法，遵照脫疽的分期，根據(jù)疾病的主次側(cè)重，繼而調(diào)和臟腑功能，通暢氣血運(yùn)行，扶正祛邪，從而起到治療作用［16］。

活血化瘀方是我院經(jīng)過多年實踐探討的寶貴結(jié)晶，綜合多年臨床經(jīng)驗在黃芪桂枝五物湯基礎(chǔ)上，去白芍、生姜、大棗加三七、丹參、雞血藤、牛膝、桑枝、甘草，從而創(chuàng)立益氣活血、通絡(luò)化瘀的“活血化瘀方”。在臨床上已應(yīng)用于糖尿病足的治療，該方在延緩潰瘍進(jìn)程和促進(jìn)潰瘍愈合方面都有良好的進(jìn)展。本次研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接等現(xiàn)代科學(xué)方法，深入探討活血化瘀方在DFU 方面的療效。中醫(yī)治療代謝性疾病具有多成分、多靶點的特點，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的特點不謀而合。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)如今已成為研究中醫(yī)藥藥理基礎(chǔ)及其中藥作用疾病的作用機(jī)制研究的一個熱門工具，在中藥活性成分篩選、中醫(yī)藥多成分、多靶點、多通路的作用機(jī)制闡釋等方面得到了廣泛的應(yīng)用［17］。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選活血化瘀方有效活性成分179 個，可作用于糖尿病足的治療靶點205個。排名靠前有效成分分別是槲皮素、山柰酚和木犀草素這3 種黃酮類化合物，提示這些化合物可能是活血化瘀方干預(yù)糖尿病足的核心藥效成分。有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以加快糖尿病大鼠難愈性傷口愈合，其機(jī)制與促進(jìn)傷口部位血管新生、肉芽組織增生、膠原纖維沉積，減輕傷口炎癥反應(yīng)有關(guān)［18］。含有槲皮素殼多糖納米粒在修復(fù)皮膚方面也有功效［19］。研究表明，山柰酚和木犀草素對糖尿病及其并發(fā)癥的改善作用也很明顯。

根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)PTGS2、ESR1、HSP90AA1 等為關(guān)鍵靶點。PTGS2 蛋白在前列腺素生物合成、脂肪酸生物合成、細(xì)胞運(yùn)動性、生理過程、血壓調(diào)控、環(huán)氧酶途徑、角化細(xì)胞分化、調(diào)控炎癥應(yīng)答等方面發(fā)揮了重要作用。Estrogen receptor 是一種雌激素受體，研究發(fā)現(xiàn)它與女童糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［20］。其中，PTGS2 和HSP90AA1 也是中藥復(fù)方益糖康防治糖尿病腎病的關(guān)鍵靶點［21］。而糖尿病腎病與DFU 病是糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中的重要的并發(fā)癥。本研究表明，活血化瘀方干預(yù)DFU 的核心靶點與PTGS2、ESR1、HSP90AA1 有關(guān)。

GO 功能富集和KEGG 通路富集結(jié)果顯示活血化瘀湯治療DFU 與細(xì)胞對氮化合物的反應(yīng)、對無機(jī)物的反應(yīng)和對異種生物刺激的反應(yīng)活性等相關(guān)，可能與脂質(zhì)和動脈粥樣硬化，P13K-Akt 信號等通路有關(guān)。糖尿病病人中發(fā)生脂質(zhì)和動脈粥樣硬化的概率明顯高于非糖尿病人，P13K-Akt 信號通路在糖尿病的治療機(jī)制中研究甚多。在糖尿病腎病的研究中，P13K 的表達(dá)是增多的［22］。綜合以上研究，我們可以得出活血化瘀方通過槲皮素、山柰酚和木犀草素等活性成分調(diào)控PTGS2、ESR1、HSP90AA1 等靶點基因，進(jìn)而調(diào)控脂質(zhì)和動脈粥樣硬化，P13KAkt 信號通路起到治療DFU 的效果。本研究中，分子對接表示槲皮素、山柰酚和木犀草素對ESR1、HSP90AA1 靶點的結(jié)合較好，木犀草素對PTGS2 的結(jié)合較好，為后續(xù)進(jìn)一步實驗驗證和處方開發(fā)提供了方向。