抗病毒核苷酸類(lèi)似物磷酸化修飾研究進(jìn)展

梁星星 王佳 許文濤

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與健康系，北京 100091；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

核苷（酸）是構(gòu)成生命遺傳信息的基礎(chǔ)物質(zhì)，參與細(xì)胞內(nèi)生物大分子DNA和RNA的合成，同時(shí)還以不同形態(tài)參與人體內(nèi)大量的生化反應(yīng)過(guò)程，如細(xì)胞的信號(hào)傳遞，能量代謝，以及各種酶的調(diào)節(jié)與表達(dá)等。核苷（酸）類(lèi)似物是一類(lèi)合成的、經(jīng)化學(xué)修飾的，模仿核苷（酸）生理學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)，它們可以參與到細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程，嵌入到DNA及RNA中阻斷其延伸復(fù)制，從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖［1］。核苷（酸）類(lèi)似物已廣泛應(yīng)用于抗病毒治療，如由人類(lèi)免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、皰疹病毒（herpes virus，HPV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）等引起的疾?。?-3］，并且，瑞德西韋（remdesivir，一種腺嘌呤核苷類(lèi)似物前藥）對(duì)治療最近爆發(fā)的SARS CoV-2感染表現(xiàn)出很好的治療前景［4］。

核苷（酸）類(lèi)似物通過(guò)與內(nèi)源核苷（酸）相同的代謝機(jī)制而被激活，其首先通過(guò)細(xì)胞膜上特定的核苷（酸）載體（如一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白載體、有機(jī)陰離子和陽(yáng)離子交換蛋白等）進(jìn)入細(xì)胞［5］，隨后在細(xì)胞內(nèi)激酶的作用下逐步磷酸化，生成具有生物活性的核苷三磷酸類(lèi)似物，這些活化后的核苷酸類(lèi)似物可競(jìng)爭(zhēng)性抑制病毒編碼的DNA或RNA聚合酶的作用，如HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、HCV編碼的RNA聚合酶等；也可直接參與病毒內(nèi)DNA/RNA的合成，嵌入其中并導(dǎo)致鏈延伸的終止，從而發(fā)揮抗病毒作用［3，6］。由于核苷（酸）類(lèi)似物的第一步（或第二步）磷酸化是由病毒編碼的激酶催化完成的，這也保證了這些藥物只作用在被病毒感染的細(xì)胞中［7］。接下來(lái)的磷酸化步驟由宿主細(xì)胞內(nèi)的激酶催化完成，由于核苷（酸）類(lèi)似物的性質(zhì)不同，其細(xì)胞內(nèi)的磷酸化過(guò)程可能需要一種、兩種、三種甚至更多酶來(lái)催化完成，不同核苷（酸）類(lèi)似物與激酶的親和力也各不相同，激酶在細(xì)胞內(nèi)的含量和有效性也各不相同［8-9］。因此，激酶催化是整個(gè)反應(yīng)的限速步驟，其催化過(guò)程經(jīng)常不充分，導(dǎo)致最后生成的核苷三磷酸類(lèi)似物在細(xì)胞內(nèi)的含量偏低，降低了藥物的生物活性。因此，開(kāi)發(fā)高度磷酸化的核苷酸類(lèi)似物是很有必要的，它們可以避開(kāi)細(xì)胞內(nèi)的限速步驟（即激酶催化），提高細(xì)胞內(nèi)生成的核苷三磷酸類(lèi)似物的濃度，從而提高抗病毒治療效果。然而，未修飾的核苷酸類(lèi)似物在生理?xiàng)l件下帶負(fù)電荷從而顯示出極性，使其不易穿過(guò)細(xì)胞膜；其次，核苷酸類(lèi)似物在體內(nèi)易受磷酸酶的降解而脫磷酸［10］。為改善和解決上述問(wèn)題，研究人員開(kāi)發(fā)了多種合成方法，如通過(guò)在核苷酸類(lèi)似物上修飾親脂性基團(tuán)，以確保其不易被血液中的磷酸酶降解，同時(shí)增強(qiáng)被細(xì)胞攝取吸收的能力，最終實(shí)現(xiàn)高效的抗病毒作用［11-13］。根據(jù)磷酸化程度的不同以及核苷酸類(lèi)似物的發(fā)展過(guò)程，可將核苷酸類(lèi)似物分為3種：核苷單磷酸、雙磷酸和三磷酸類(lèi)似物。

目前，已通過(guò)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）或歐洲藥品管理局（EMA）的核苷（酸）藥物有替諾福韋酯（tenofovir dipivoxil）、司他夫定（stavudine）、伐昔洛韋（valacyclovir）、西多福韋（cidofovir）等，并且已被批準(zhǔn)用于治療人類(lèi)疾?。?4］。本文總結(jié)概述了核苷酸類(lèi)似物在抗病毒藥物領(lǐng)域的研究進(jìn)展，以磷酸化修飾為主，重點(diǎn)介紹了核苷單磷酸、雙磷酸和三磷酸類(lèi)似物的發(fā)展，并分析了核苷酸類(lèi)似物在臨床藥物應(yīng)用中存在的局限和未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)，以期為開(kāi)發(fā)新型、高效的核苷酸藥物提供有益參考。

1 核苷單磷酸類(lèi)似物

核苷單磷酸類(lèi)似物是在核苷類(lèi)似物基礎(chǔ)上修飾單磷酸基團(tuán)得到的核苷酸類(lèi)似物，它能避開(kāi)細(xì)胞內(nèi)的第一步磷酸化步驟，在一定程度上提高抗病毒效果。然而由于其生理電負(fù)性和脫磷酸化作用，極大地限制了該類(lèi)物質(zhì)的應(yīng)用。因此，為保證藥物能順利進(jìn)入細(xì)胞，并不易被血液中的磷酸酶降解，需要對(duì)磷酸基團(tuán)上帶的負(fù)電荷進(jìn)行掩蔽，常見(jiàn)的修飾基團(tuán)有bisPOM-、SATE-、CycloSal-和氨基磷酸酯等［15-16］，通過(guò)這些方法制備的中性親脂性核苷單磷酸三酯能通過(guò)被動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞并在酶解或者化學(xué)水解作用下生成相應(yīng)的具有生物活性的核苷單磷酸類(lèi)似物。

早在1983年，F(xiàn)arquhar等［17］就報(bào)道了雙-碳氧甲基修飾的磷酸酯衍生物在肝酯酶和血漿中具有很好的穩(wěn)定性。隨后，該團(tuán)隊(duì)又利用中性雙-酰氧基甲基修飾核苷單磷酸，其能有效提高藥物的親脂性，結(jié)構(gòu)如圖1所示。該藥物易于進(jìn)入細(xì)胞，并能在羧酸酯酶作用下裂解產(chǎn)生羥甲基核苷單磷酸中間體，該中間體繼續(xù)發(fā)生裂解，生成核苷單磷酸［18］。雙-酰氧基甲基修飾的核苷單磷酸具有很好的穩(wěn)定性，因此其在體內(nèi)循環(huán)過(guò)程中不易被降解，提高了其到達(dá)細(xì)胞內(nèi)的有效濃度。利用雙-新戊酰氧基甲基［bis（pivaloyloxymethyl），bis（POM）］修飾的無(wú)環(huán)核苷單磷酸類(lèi)似物具有廣譜的抗病毒活性［19］，對(duì)bis（POM）修飾的5-疊氮基甲基2′-脫氧尿苷（AmdU）的代謝合成進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其可以高效地活化為核苷三磷酸形式從而合成到DNA中，且在細(xì)胞培養(yǎng)基中展示了較高的穩(wěn)定性［20］。

圖1 雙-酰氧基甲基核苷單磷酸Fig. 1 Bis-acyloxymethyl nucleoside monophosphate［18］

與雙-酰氧基甲基修飾類(lèi)似，S-?；?2-硫乙基（S-acyl-2-thioethyl，SATE）基團(tuán)修飾的核苷單磷酸類(lèi)似物的水解也是依賴(lài)酯酶激活，接著發(fā)生自發(fā)裂解。根據(jù)酸堿理論，對(duì)于巰基乙醇取代的磷酸衍生物，巰基會(huì)進(jìn)攻β-C進(jìn)而使巰基乙醇從磷酸上水解下來(lái)，形成核苷酸?；诖?，Peyrottes等［21］采用SATE基團(tuán)作為核苷單磷酸的保護(hù)基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)如圖2所示（R表示烷基或者芳基，Nu表示核苷類(lèi)似物），SATE基團(tuán)在細(xì)胞外基質(zhì)中有很好的穩(wěn)定性，而在細(xì)胞內(nèi)可以快速地降解，這有利于在細(xì)胞內(nèi)選擇性地釋放核苷單磷酸藥物，從而提高抗病毒效果。作為一個(gè)生物可裂解的磷酸保護(hù)基團(tuán)，該雙-SATE-核苷單磷酸在細(xì)胞內(nèi)酯酶的介導(dǎo)下水解生成不穩(wěn)定的磷酸三酯，接著發(fā)生自發(fā)裂解，最后得到具有生物活性的核苷單磷酸。體外實(shí)驗(yàn)表明，雙-SATE-磷酸三酯衍生物的抗病毒活性均高于未修飾的核苷。SATE法可廣泛用于核苷單磷酸類(lèi)似物的修飾，如雙-（叔丁基-SATE）-阿糖胞苷（bis（tBuSATE）-araC）［22］，雙-（叔丁基SATE）-7-芳基取代的7-脫氮雜腺苷［23］等。

圖2 Bis-（SATE）-核苷磷酸三酯的結(jié)構(gòu)Fig. 2 Structure of bis-（SATE）-nucleoside phosphotriester［21］

除了依靠酶解產(chǎn)生活化的核苷酸藥物外，還可以依賴(lài)化學(xué)裂解來(lái)激活核苷單磷酸藥物。CycloSal-核苷酸是由水楊醇與核苷單磷酸反應(yīng)形成的三酯化合物，由苯基酯鍵和芐基酯鍵組成環(huán)化雙功能基團(tuán)，以2′，3′-雙脫氫-2′，3′-雙脫氧胸腺嘧啶核苷單磷酸（d4TMP）為例，其結(jié)構(gòu)如圖3所示，CycloSal-核苷酸在細(xì)胞內(nèi)的裂解完全依賴(lài)pH驅(qū)動(dòng)的化學(xué)裂解。由于水楊醇的修飾掩蔽了磷酸基團(tuán)上的單鍵氧，因此得到的CycloSal-核苷酸呈中性，且親脂性大大提高。相比于2′，3′-雙脫氫-2′，3′-雙脫氧胸腺嘧啶核苷（d4T），CycloSal-d4TMP能夠通過(guò)被動(dòng)運(yùn)輸穿過(guò)細(xì)胞膜，并且成功地避開(kāi)了第一步磷酸化，使得最終活化后的d4TTP的濃度顯著提高［24］。利用CycloSal的亞氯酸鹽與核苷反應(yīng)可生成相應(yīng)的CycloSal修飾的核苷單磷酸，基于此方法，Kamata等［25］合成了CycloSal修飾的4′-乙炔基-2′-脫氧腺苷（EdA）磷酸酯衍生物，其可有效地抑制HBV的復(fù)制，且對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)毒。CycloSal-核苷酸的抗病毒活性不僅與核苷及取代基團(tuán)的種類(lèi)有關(guān)，其立體構(gòu)象也顯著影響著抗病毒活性。以甲基-取代的CycloSal-d4TMP為例，其抗病毒活性強(qiáng)烈依賴(lài)于磷酸基團(tuán)及CycloSal基團(tuán)中甲基的手性，不同立體構(gòu)象的CycloSal-d4TMP的抗病毒活性可以相差7-20倍［26］。

圖3 CycloSal-d4TMP的結(jié)構(gòu)Fig. 3 Structure of CycloSal-d4TMP［24］

此外，氨基磷酸酯也是一類(lèi)常用的核苷單磷酸修飾基團(tuán)，以P-N鍵代替P-O鍵，結(jié)合氨基酸側(cè)鏈修飾，不僅能有效穩(wěn)定磷酸基團(tuán)，同時(shí)有助于增強(qiáng)藥物的抗病毒活性［27］。例如，芳香基和氨基磷酸甲酸酯修飾的無(wú)環(huán)核苷單磷酸對(duì)DNA病毒有很好的抗性［28］；通過(guò)氨基磷酸酯修飾合成的2′-β-甲基-2′-α-氟尿苷單磷酸（sofosbuvir，索非布韋）可用于治療丙型肝炎病毒（HCV）引起的疾?。?9］；最近研究較多的瑞德西韋（remdesivir）是一種氨基磷酸酯修飾的單磷酸前藥，研究表明，其可有效地抑制SARSCoV-2在人肺細(xì)胞培養(yǎng)物中的復(fù)制［30］。

核苷單磷酸類(lèi)似物胞內(nèi)傳遞的實(shí)現(xiàn)推動(dòng)了核苷酸類(lèi)似物在體內(nèi)的應(yīng)用，通過(guò)在磷酸基上修飾親脂性基團(tuán)，提高了核苷單磷酸類(lèi)似物的穩(wěn)定性和膜穿透性。雙-酰氧基甲基修飾的核苷單磷酸藥物中有兩種已用于臨床治療，替諾福韋酯（tenofovir dipivoxil）和阿德福韋酯（adefovir dipivoxil），可分別用于治療HIV和HBV感染。bis（SATE）修飾雖然可以提高核苷單磷酸藥物的親脂性，但是SATE基團(tuán)裂解的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物硫化乙烯，該物質(zhì)對(duì)機(jī)體有毒性，因此bis（SATE）修飾的核苷單磷酸藥物的使用劑量應(yīng)盡可能降低，以減小對(duì)機(jī)體的傷害。CycloSal-法合成的核苷單磷酸類(lèi)似物的脫磷酸化過(guò)程是pH依賴(lài)型的，無(wú)需酶的參與，且只需要一個(gè)激活步驟，由于CycloSal-基團(tuán)的雙功能性，合成過(guò)程中CycloSal-基團(tuán)與核苷酸分子的比率為1∶1，從而沒(méi)有副產(chǎn)物的產(chǎn)生［12］，是修飾核苷酸類(lèi)似物常用的一種方法。氨基酸側(cè)鏈修飾得到的核苷單磷酸前藥的抗病毒潛力與氨基酸種類(lèi)有關(guān)，通過(guò)使用不同的氨基酸側(cè)鏈，可以調(diào)整核苷單磷酸前藥的生物活性。此外，CycloSal-法也可用于合成核苷雙磷酸類(lèi)似物［16，31］，氨基磷酸酯修飾的核苷單磷酸前藥大部分也實(shí)現(xiàn)了在臨床上的應(yīng)用［32-33］，因此，近幾年關(guān)于CycloSal法和氨基磷酸酯修飾的研究報(bào)道也較多。目前用于臨床研究或治療的核苷單磷酸藥物除了阿德福韋酯和替諾福韋酯外，還有帕拉德福韋（pradefovir）、索菲布韋（sofosbuvir）、CMX-001（brincidofovir）、貝西福韋（besifovir）、ODE（HDP）-（S）-HPMPA、MCC-478和USC-087等［34］。

2 核苷雙磷酸類(lèi)似物

核苷單磷酸類(lèi)似物雖然避開(kāi)了細(xì)胞內(nèi)的第一步磷酸化，但對(duì)于某些核苷酸類(lèi)似物來(lái)說(shuō)，第二步的磷酸化仍是限速步驟，所以對(duì)于核苷雙磷酸藥物的研究是很有必要的。例如，第一個(gè)通過(guò)的抗HIV藥物AZT，在AZT磷酸化為核苷三磷酸AZT-TP的過(guò)程中，由于第二步磷酸化（即AZT-DP的形成）仍是限速步驟，導(dǎo)致了AZT-MP的累積，因此產(chǎn)生了一些不良副作用［35］。然而，由于磷酸酐鍵的不穩(wěn)定性，且磷酸基團(tuán)只有在帶負(fù)電荷的狀態(tài)下才可以阻止親核攻擊而不裂解，因此核苷雙磷酸類(lèi)似物的穩(wěn)定性較差，易被血清內(nèi)非特異性磷酸酶水解而發(fā)生脫磷酸；另外，帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)具有極性，這就導(dǎo)致核苷雙磷酸類(lèi)似物不易穿過(guò)細(xì)胞膜［36］。早期有許多關(guān)于核苷雙磷酸類(lèi)似物的研究，如利用雙甘油酯［37-38］、肉豆蔻酸［39-40］和CycloSal［41］來(lái)修飾β-磷酸上的單鍵氧，這些方法在一定程度上提高了核苷雙磷酸類(lèi)似物的跨膜能力和穩(wěn)定性，但其裂解的最終產(chǎn)物大部分都是核苷單磷酸，且伴隨著一些副產(chǎn)物的產(chǎn)生，使細(xì)胞內(nèi)有效的核苷雙磷酸產(chǎn)物的濃度降低。

為保證磷酸酐鍵在最初的裂解反應(yīng)中不受影響，采用酶解法取代化學(xué)裂解法來(lái)產(chǎn)生核苷雙磷酸（NDPs）［41］。Weinschenk等［36］采用DiPPro法合成核苷雙磷酸類(lèi)似物，在β-磷酸上修飾兩個(gè)一樣的酰氧芐基酯，α-磷酸不修飾任何基團(tuán)，因此核苷二磷酸類(lèi)似物整體仍帶負(fù)電荷，從而阻止磷酸酐鍵的裂解，保持焦磷酸酐的穩(wěn)定，且不影響細(xì)胞吸收。其結(jié)構(gòu)和水解途徑如圖4所示（R為烷基或者烯基），其中，第一步在細(xì)胞內(nèi)酯酶的催化下，修飾基團(tuán)的酯基發(fā)生裂解產(chǎn)生負(fù)電荷，接著其內(nèi)部繼續(xù)發(fā)生裂解，從而生成單酰氧基芐基修飾的核苷雙磷酸，最后，再通過(guò)同樣的機(jī)制生成最終產(chǎn)物NDPs。由于第一步酶催化的裂解不涉及磷酸酐鍵，因此可以成功地得到NDPs。

圖4 DiPPro-藥物的結(jié)構(gòu)及水解路徑Fig. 4 DiPPro-drug’s structure and hydrolysis path［36］

由于細(xì)胞內(nèi)酯酶含量高，因此核苷雙磷酸類(lèi)似物的裂解活化主要發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)部。此法可用于合成一系列的核苷雙磷酸藥物，通過(guò)使用不同的取代基來(lái)調(diào)節(jié)核苷雙磷酸類(lèi)似物的穩(wěn)定性和親脂性［36-42］。但是，裂解產(chǎn)物中除了目標(biāo)核苷雙磷酸外，也檢測(cè)到了少量的核苷單磷酸。因此，Weinschenk等［43］發(fā)展了第二代DiPPro-藥物，利用兩個(gè)不同的酰氧芐基酯來(lái)修飾β-磷酸，其中一個(gè)修飾基團(tuán)是較短的烷烴鏈取代的酰氧芐基酯，酶解速度較快；另一個(gè)是較長(zhǎng)的烷烴鏈取代的酰氧芐基酯或者苯基取代的酰氧芐基酯，以提高分子的親脂性，此DiPPro-藥物可以快速地裂解掉第一個(gè)修飾基團(tuán)，從而使副反應(yīng)產(chǎn)物NMPs減少，提高了藥物的選擇性。該方法有許多應(yīng)用，如利用DiPPro法合成的T-1105核糖核苷雙磷酸類(lèi)似物抑制RNA病毒合成的效果要優(yōu)于T-1105，因此提高了其抗病毒效果［44］；除了用于抗病毒外，DiPPro法還可用于合成腺苷二磷酸核糖（ADPR）的前體物質(zhì)，作為瞬時(shí)受體電位褪黑素2（TRPM2）的激活劑，DiPPro合成的ADPR衍生物可提高其激活效果，有望成為研究TRPM2的新方法［45］。

與核苷單磷酸藥物不同的是，發(fā)展核苷雙磷酸藥物的關(guān)鍵在于保持磷酸酐鍵的穩(wěn)定性。利用DiPPro-法合成核苷雙磷酸類(lèi)似物，僅對(duì)β-磷酸進(jìn)行修飾，α-磷酸帶的負(fù)電荷可穩(wěn)定磷酸酐鍵，基于酯酶裂解發(fā)生脫磷酸化，由于細(xì)胞內(nèi)的酯酶含量高且該藥物在生理pH下可以保持很高的穩(wěn)定性，因此可以保證NDPs只有在細(xì)胞內(nèi)被釋放。通過(guò)選擇合適的取代基R，可以調(diào)節(jié)藥物的穩(wěn)定性和親脂性，合成具有親脂性的、帶部分電荷的核苷雙磷酸類(lèi)似物，從而實(shí)現(xiàn)核苷雙磷酸藥物的傳遞。核苷雙磷酸類(lèi)似物適用于前兩步磷酸化為限速步驟的核苷類(lèi)似物，對(duì)于缺乏核苷雙磷酸激酶活性的靶細(xì)胞來(lái)說(shuō)，核苷雙磷酸藥物的抗病毒效果就會(huì)大大降低，因此只有傳遞核苷三磷酸類(lèi)似物才可以解決此問(wèn)題。

3 核苷三磷酸類(lèi)似物

核苷單磷酸和雙磷酸類(lèi)似物的開(kāi)發(fā)逐步實(shí)現(xiàn)了磷酸化形式核苷的遞送，成功地避開(kāi)了一步或兩步磷酸化限速步驟，但釋放的核苷酸仍需要通過(guò)細(xì)胞激酶進(jìn)一步磷酸化成為核苷三磷酸才可發(fā)揮作用［46］。因此，直接開(kāi)發(fā)核苷三磷酸藥物具有重大優(yōu)勢(shì)和意義，它既能提高到達(dá)細(xì)胞內(nèi)的活性藥物濃度，也能減少細(xì)胞磷酸化過(guò)程中副產(chǎn)物的生成，從而有效提高治療效果。然而，由于三磷酸基團(tuán)帶有4個(gè)負(fù)電荷，不易穿過(guò)細(xì)胞膜；且三磷酸基含有兩個(gè)不穩(wěn)定的磷酸酐鍵，其化學(xué)穩(wěn)定性差，易被磷酸酶水解；同時(shí)，化學(xué)法合成核苷三磷酸藥物也比較困難［47］。因此，核苷三磷酸類(lèi)似物的發(fā)展極具挑戰(zhàn)。

1995年，Bonnaffé等［48］首次提出制備?；揎椀暮塑杖姿幔ㄟ^(guò)?；黾悠溆H脂性，從而更易跨越細(xì)胞膜。以抗HIV的胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物d4T和AZT為研究對(duì)象，利用?；慕沽姿崤c核苷磷酰嗎啉反應(yīng)制得了?；腘TPs。此外，Kreimeyer等［49］利用肉豆蔻酸與氯甲酸乙酯反應(yīng)生成的酸酐與ADP或GDP反應(yīng)，制備了嘌呤核苷三磷酸類(lèi)似物。然而，通過(guò)以上兩種方法制得的核苷三磷酸類(lèi)似物產(chǎn)量極低，且易被水解。

隨后，研究人員嘗試僅對(duì)NTPs上的γ-磷酸進(jìn)行酯化修飾，保留α-，β-磷酸的負(fù)電荷，在提高三磷酸基團(tuán)的穩(wěn)定性的同時(shí)，增加了NTPs的親脂性，有利于其穿過(guò)細(xì)胞膜，使用不同的?；タ梢哉{(diào)節(jié)NTPs的親脂性、膜穿透性和穩(wěn)定性［46，50］。Warnecke等［31］提出通過(guò)酯化反應(yīng)合成酰氧芐基修飾的NTPs（TriPPPro法），利用不同的取代基團(tuán)來(lái)調(diào)節(jié)核苷三磷酸類(lèi)似物的親脂性和化學(xué)穩(wěn)定性，當(dāng)該核苷三磷酸類(lèi)似物進(jìn)入細(xì)胞后，在酯酶作用下形成核苷三磷酸。該研究團(tuán)隊(duì)以d4T為研究對(duì)象，首先利用CycloSal技術(shù)合成了d4TDP，隨后，此d4TDP與一系列含有兩個(gè)相同的酰氧芐基修飾的亞磷酰胺單體反應(yīng)，最后制得酰氧芐基修飾的d4TTP藥物，其結(jié)構(gòu)如圖5所示（R為烷基、烯基、氧烷基和氨基烷基）［46］。

圖5 酰氧芐基修飾的d4TTPFig. 5 Acyloxybenzyl modified d4TTP［46］

但是，該方法中核苷三磷酸類(lèi)似物的最終產(chǎn)量仍然受到NDPs合成產(chǎn)率的限制。鑒于NMPs的制備相對(duì)NDPs較容易，該團(tuán)隊(duì)又研究了基于NMP和P，P-雙-（4-壬酰氧芐基）修飾的焦磷酸反應(yīng)生成TriPPPro-核苷酸類(lèi)似物［9］。首先，采用CycloSal-法合成核苷單磷酸類(lèi)似物［31］，接著與P，P-雙-（壬酰氧芐基）修飾的焦磷酸反應(yīng)從而制得TriPPPro-核苷三磷酸類(lèi)似物。利用此方法，Weising等［51］合成了抗HIV藥物阿巴卡韋（abacavir，ABC）的親脂三磷酸前藥，活化后的ABCTP可作為dATP的競(jìng)爭(zhēng)者參與DNA合成。

由于含碳酸酯的TriPPPro-核苷類(lèi)似物的化學(xué)穩(wěn)定性要高于含酰氧基的TriPPPro-核苷類(lèi)似物，因此，Meier等［52］分別合成了酰氧芐基（acyloxybenzyl，AB，含酯基）和碳酸酯芐基（alkoxycarbonyloxybenzyl，ACB，含碳酸酯）修飾的核苷三磷酸類(lèi)似物。通過(guò)研究γ-AB-ACB-d4TTPs和γ-ACB-ACB-d4TTPs在PBS溶液中的水解情況發(fā)現(xiàn)，γ-ACB-d4TTP的半衰期顯著高于γ-AB-d4TTP，表明含碳酸酯修飾基團(tuán)的藥物具有更高的化學(xué)穩(wěn)定性。此外，在γ-磷酸上修飾親脂性的、生物可降解的ACB基團(tuán)，增加核苷三磷酸的親脂性，便于其穿過(guò)細(xì)胞膜。與γ-（AB，ACB）-d4TTPs不同，用兩個(gè)不同長(zhǎng)度的酰氧芐基修飾的d4TTPs在磷酸鹽緩沖液和CEM細(xì)胞提取物中的水解速率并無(wú)差別［53］；除了在γ-磷酸上修飾可降解的酰氧芐基外，還可修飾非裂解的烷基（alkyl），合成的γ-（AB，alkyl）-d4TTP在酯酶的作用下生成γ-alkyl-d4TTP，其可選擇性地作為HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的底物合成到DNA鏈中終止病毒復(fù)制，這種選擇性使γ-（AB，alkyl）-核苷三磷酸特異性地作用于感染病毒的細(xì)胞中［54］。

雖然TriPPPro前藥的磷酸基團(tuán)仍帶負(fù)電荷，但通過(guò)在γ-磷酸上修飾親脂的、生物可降解的基團(tuán)，以提供足夠的親脂性從而跨越細(xì)胞膜，并生成高含量的核苷三磷酸。通過(guò)在γ-磷酸上進(jìn)行非對(duì)稱(chēng)的修飾，不僅可以同時(shí)提高TriPPPro前藥的穩(wěn)定性和親脂性，而且可以實(shí)現(xiàn)修飾基團(tuán)的逐步裂解，得到目標(biāo)中間體。TriPPPro法合成的核苷三磷酸類(lèi)似物可以完全避開(kāi)細(xì)胞內(nèi)磷酸化限速步驟，極大地提高了核苷酸藥物的抗病毒效果，并且可以將無(wú)活性的核苷轉(zhuǎn)化為有效的核苷酸類(lèi)似物，在抗病毒和抗腫瘤應(yīng)用中均有很好的應(yīng)用前景，近幾年的研究也主要集中在非對(duì)稱(chēng)修飾的TriPPPro前藥［53-55］，未來(lái)還需要進(jìn)一步研究更加穩(wěn)定、親脂的核苷三磷酸前藥，增強(qiáng)非天然的NTPs的在體內(nèi)的傳遞效果，從而提高抗病毒核苷酸藥物的治療效果。

4 總結(jié)與展望

核苷酸類(lèi)似物有很好的應(yīng)用前景，本文概述了近幾十年來(lái)抗病毒核苷酸類(lèi)似物前藥的研究進(jìn)展，分別介紹了三類(lèi)核苷酸類(lèi)似物及其合成修飾方法，其主要通過(guò)對(duì)核苷酸進(jìn)行磷酸化修飾各種親脂性基團(tuán)，合成可穿膜的具有活性的核苷酸類(lèi)似物，在實(shí)現(xiàn)藥物穿膜進(jìn)入細(xì)胞的同時(shí)有效地緩解了血液中酶的脫磷酸作用，從而提高了進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)核苷酸藥物的濃度，最終生成具有活性的核苷三磷酸，從而發(fā)揮抗病毒作用。與核苷類(lèi)似物不同，磷酸化修飾的核苷酸類(lèi)似物可以避開(kāi)細(xì)胞內(nèi)的磷酸化限速步驟，有效地彌補(bǔ)了核苷類(lèi)似物在應(yīng)用中的局限性，提高了核苷酸藥物的抗病毒效果，在一定程度上可以減少抗病毒藥物的使用劑量，從而降低了機(jī)體對(duì)藥物的敏感性?？偟膩?lái)說(shuō)，核苷酸類(lèi)似物具有高效的抗病毒應(yīng)用潛力。

核苷酸藥物的開(kāi)發(fā)可以結(jié)合不同修飾基團(tuán)的特點(diǎn)，如氨基磷酸酯基的穩(wěn)定性和芐基的親脂性，利用不同修飾基團(tuán)對(duì)核苷酸進(jìn)行磷酸化修飾，以提高核苷酸類(lèi)似物的治療效果。目前對(duì)于核苷酸類(lèi)似物的開(kāi)發(fā)研究比較多，但對(duì)于核苷酸類(lèi)似物的細(xì)胞吸收機(jī)制以及吸收數(shù)量的研究還較少，修飾基團(tuán)的種類(lèi)對(duì)于抗病毒活性的影響也需要進(jìn)一步的研究，通過(guò)不斷優(yōu)化修飾基團(tuán)以達(dá)到更好的治療效果。目前大多數(shù)的核苷酸類(lèi)似物的裂解主要依靠酶解，核苷酸類(lèi)似物在細(xì)胞內(nèi)和血液中穩(wěn)定性的差別大小決定了核苷酸類(lèi)似物是否可以成功應(yīng)用于體內(nèi)，或許需要開(kāi)發(fā)新的激活機(jī)制以提高核苷酸藥物在血液中的穩(wěn)定性和細(xì)胞內(nèi)的裂解活性。另外，為了降低核苷酸藥物對(duì)機(jī)體的毒副作用，核苷酸藥物的使用劑量與抗病毒活性的關(guān)系還需要不斷探索。

由于長(zhǎng)期使用抗病毒藥物會(huì)引起病毒的耐藥性，同時(shí)為了降低機(jī)體對(duì)藥物的敏感性，未來(lái)不僅需要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新型的、具有更高藥效的抗病毒核苷酸類(lèi)似物，更重要的是聚焦藥物的低毒性、高水溶性和高特異性，開(kāi)發(fā)具有低細(xì)胞毒性的藥物遞送系統(tǒng)，降低抗病毒藥物的使用劑量，以減小機(jī)體對(duì)藥物的敏感性。根據(jù)體內(nèi)病毒水平選擇不同強(qiáng)效的核苷酸藥物，在病毒產(chǎn)生耐藥性前換用另一種核苷酸藥物，或者通過(guò)聯(lián)合使用核苷酸藥物，以降低病毒的耐藥性，當(dāng)然，規(guī)范用藥，選擇適當(dāng)?shù)暮塑账崴幬镆彩潜苊獠《井a(chǎn)生耐藥性重要措施。目前，超過(guò)100種抗病毒藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，但是大多數(shù)只針對(duì)一種病毒感染，新型的核苷酸藥物還應(yīng)具有針對(duì)多種病毒類(lèi)型的廣譜性。最后，要實(shí)現(xiàn)核苷酸類(lèi)似物的廣泛應(yīng)用還需要進(jìn)一步研究，如毒性試驗(yàn)，藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，臨床試驗(yàn)以及如何實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)等。