疫苗佐劑單磷酸脂質(zhì)A的合成及在疫苗中應(yīng)用進(jìn)展

汪緒龍， 李 雪， 馬曉雪， 周成凱， 隋 強(qiáng)*

疫苗佐劑單磷酸脂質(zhì)A的合成及在疫苗中應(yīng)用進(jìn)展

汪緒龍1,2， 李 雪2， 馬曉雪1， 周成凱1， 隋 強(qiáng)1*

（1. 上海工程技術(shù)大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，上海 201620；2. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海 201203）

簡(jiǎn)單介紹了單磷酸脂質(zhì)A（monophosphoryl lipid A）的來(lái)源及化學(xué)結(jié)構(gòu)，單磷酸脂質(zhì)A是革蘭氏陰性菌外膜上脂多糖內(nèi)層脂質(zhì)A的部分結(jié)構(gòu)?？偨Y(jié)了單磷酸脂質(zhì)A常用的兩條合成路線(xiàn)并分析優(yōu)缺點(diǎn)，指出路線(xiàn)2為最佳的合成方法，其巧妙的選取Nap作為保護(hù)基，用DDQ干凈高效地脫除了Nap保護(hù)基，避免使用催化氫化，相比路線(xiàn)1更加適合工藝放大研究?；瘜W(xué)合成與生物提取相比，避免了糖異質(zhì)及純度低的問(wèn)題。最后總結(jié)了單磷酸脂質(zhì)A作為佐劑在各類(lèi)疫苗中的應(yīng)用，為其進(jìn)一步研究提供參考。

單磷酸脂質(zhì)A；脂多糖；合成；Nap；佐劑；疫苗

單磷酸脂質(zhì)A（Monophosphoryl Lipid A）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）中的最內(nèi)層脂質(zhì)A部分[1]。LPS是一個(gè)復(fù)雜分子，由三個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域組成：脂質(zhì)A（Lipid A，內(nèi)毒素）、非重復(fù)核心寡糖和-抗原（圖1左），可以有效地引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致各種生理病理效應(yīng)[2-4]。LPS結(jié)構(gòu)中的疏水部分脂質(zhì)A是一種很強(qiáng)的免疫刺激劑，含有數(shù)條脂肪?；?，能被Toll樣受體4（TLR4）和髓樣分化因子（MD-2）蛋白受體所識(shí)別，從而刺激相應(yīng)的免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞等，產(chǎn)生免疫反應(yīng)[5-7]。脂質(zhì)A的骨架結(jié)構(gòu)為-D-GlcN-(1→6)-D-GlcN，并含有1,4?-二--磷酸基團(tuán)，會(huì)過(guò)度激活先天性免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致敗血性休克等癥狀，副反應(yīng)強(qiáng)烈。研究表明，去掉1位的磷酸基團(tuán)，即為單磷酸脂質(zhì)A（圖1右），其毒性降低且保留了免疫活性[8-11]。Ribi等研究了單磷酸脂質(zhì)A的致死性，發(fā)現(xiàn)其毒性?xún)H為L(zhǎng)PS的0.08%，證明了單磷酸脂質(zhì)A的低毒性與安全性，很大程度上避免了由LPS引起的副反應(yīng)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，單磷酸脂質(zhì)A能刺激免疫細(xì)胞并產(chǎn)生細(xì)胞因子，如TNF-（腫瘤壞死因子-）、IFN-（干擾素-）、IL-6（白細(xì)胞介素-6）等，進(jìn)一步證明單磷酸脂質(zhì)A作為佐劑的有效性，為其作為疫苗佐劑奠定 基礎(chǔ)[13]。

目前，單磷酸脂質(zhì)A在疫苗治療中已作為佐劑投入市場(chǎng)，與疫苗配合使用能夠顯著增強(qiáng)抗體反應(yīng)和T細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[14]。上文已簡(jiǎn)單介紹了單磷酸脂質(zhì)A的來(lái)源和結(jié)構(gòu)，下文將重點(diǎn)分析總結(jié)單磷酸脂質(zhì)A的化學(xué)合成方法，最后介紹單磷酸脂質(zhì)A作為佐劑在疫苗中的應(yīng)用，為單磷酸脂質(zhì)A類(lèi)化合物作為佐劑在其他疫苗中的應(yīng)用提供參考。

圖1 LPS（左）和單磷酸脂質(zhì)A（右）的一般結(jié)構(gòu)

1 單磷酸脂質(zhì)A合成路線(xiàn)綜述

1.1 單磷酸脂質(zhì)A合成所存在的問(wèn)題

目前大部分單磷酸脂質(zhì)A來(lái)源依靠于生物發(fā)酵提取，即先從細(xì)菌中提取，后經(jīng)化學(xué)酸解得到。該方法的缺點(diǎn)是成本高，同時(shí)，通過(guò)培養(yǎng)的革蘭氏陰性菌分離得到的單磷酸脂質(zhì)A具有糖異質(zhì)性問(wèn)題[15]。例如：SJ-19a類(lèi)脂質(zhì)A在酸水解步驟中，會(huì)發(fā)生化學(xué)降解從而導(dǎo)致脂質(zhì)A的異質(zhì)性[16]。因此，采用化學(xué)合成的方法獲得明確結(jié)構(gòu)的單磷酸脂質(zhì)A是十分必要的。

1.2 單磷酸脂質(zhì)A的逆合成分析及目標(biāo)化合物的合成

圖2為單磷酸脂質(zhì)A的逆合成分析圖。

圖2 單磷酸脂質(zhì)A的逆合成分析

由圖2可知，單磷酸脂質(zhì)A類(lèi)化合物的合成可概括為：1）糖受體與糖供體的制備，2）糖苷化形成二糖并連接相應(yīng)的脂肪鏈，3）脫除保護(hù)基得到終產(chǎn)物。

單磷酸脂質(zhì)A的合成路線(xiàn)1和合成路線(xiàn)2如圖3所示。單磷酸脂質(zhì)A兩種合成路線(xiàn)對(duì)比如表1所示。

圖3 單磷酸脂質(zhì)A的合成路線(xiàn)1和合成路線(xiàn)2

表1 單磷酸脂質(zhì)A兩種合成路線(xiàn)對(duì)比

由圖3與表1可知，對(duì)比分析了兩種單磷酸脂質(zhì)A的合成路線(xiàn)。路線(xiàn)1：糖供體1和糖受體2經(jīng)糖苷化反應(yīng)、Alloc保護(hù)、選擇性開(kāi)環(huán)、安裝磷酸基團(tuán)、脫除Troc保護(hù)基、連接脂肪鏈、脫除Alloc和TDS保護(hù)基，最后氫化脫除Bn得到目標(biāo)化合物7[17]。該路線(xiàn)使用Bn為永久性保護(hù)基，需采用Pd/C在氫氣條件下脫除，此步雜質(zhì)多，后三步收率僅為68%。而且因?yàn)閱瘟姿嶂|(zhì)A為兩親性結(jié)構(gòu)，氫化脫除時(shí)會(huì)形成膠束使得芐基脫除較為困難，從而導(dǎo)致終產(chǎn)物純化方式復(fù)雜，如需要使用多個(gè)不同組分的混合溶劑作為流動(dòng)相才能沖出產(chǎn)物[18]。

路線(xiàn)2：糖供體8和糖受體9經(jīng)糖苷化反應(yīng)、脫Troc保護(hù)基、連接脂肪鏈、脫Fmoc保護(hù)基、連接脂肪鏈、脫TDS和Allyl保護(hù)基，最后用DDQ將Nap脫除得到目標(biāo)化合物12[19]。路線(xiàn)2采用了Nap代替Bn來(lái)保護(hù)糖環(huán)上的羥基和脂肪鏈上羥基，改用DDQ氧化脫除Nap，避免了催化氫化[20-21]。此方法大幅度提高了收率，且后處理較為簡(jiǎn)單。路線(xiàn)2反應(yīng)步驟較少，能耗少、收率高，反應(yīng)條件溫和、易于操作，相比路線(xiàn)1更加適合工藝放大研究。

2 單磷酸脂質(zhì)A在疫苗中的應(yīng)用

2.1 含單磷酸脂質(zhì)A的AS佐劑系統(tǒng)

由于單一佐劑有其使用的局限性，因此現(xiàn)有疫苗中大多會(huì)添加兩種以上的佐劑組成佐劑系統(tǒng)[22-23]。目前含有單磷酸脂質(zhì)A的AS佐劑系統(tǒng)見(jiàn)表2。

表2 常用的AS佐劑系統(tǒng)

QS21：從皂樹(shù)樹(shù)皮中提取的三萜糖苷類(lèi)物質(zhì)；CpG：TLR樣9配體

佐劑系統(tǒng)不同的配伍會(huì)影響到佐劑的免疫應(yīng)答效果和副作用。Burny等[24]對(duì)部分佐劑系統(tǒng)的免疫原性進(jìn)行比較，將AS系列、鋁佐劑分別與HBV抗原結(jié)合后接種于人體，其適應(yīng)性和體內(nèi)免疫反應(yīng)的效果為：AS01＞AS03＞AS04＞Alum，與四價(jià)HPV疫苗組合接種于人體后，AS01系統(tǒng)的特異性免疫抗體濃度最高[25]。

2.2 已上市含單磷酸脂質(zhì)A的疫苗

另外在已上市的疫苗中，單磷酸脂質(zhì)A也展現(xiàn)出了其強(qiáng)大的免疫增強(qiáng)效應(yīng)（見(jiàn)表3）。

表3 已上市的含MPLA佐劑疫苗

FendrixTM：GSK研制的乙肝疫苗，該疫苗由乙肝病毒（HBV）表面抗原和AS04佐劑系統(tǒng)組成，用于預(yù)防和治療由感染乙型肝炎病毒（HBV）引起的乙型肝炎。相比于傳統(tǒng)鋁佐劑乙肝疫苗，注射FendrixTM可以快速誘導(dǎo)更高水平的抗體滴度并且長(zhǎng)時(shí)間維持保護(hù)機(jī)體的狀態(tài)。注射部位出現(xiàn)嚴(yán)重疼痛、腫脹和發(fā)紅的人數(shù)相對(duì)減少了5%[27]。

CervarixTM與 GardasilTM：宮頸癌主要是由感染兩種高危型病毒株（HPV-16/18型）導(dǎo)致的，CervarixTM是由GSK研制的宮頸癌二價(jià)疫苗，由HPV L1表位的病毒樣顆粒（VLP）與AS04系統(tǒng)組成；GardasilTM是由默克研發(fā)的宮頸癌四價(jià)疫苗，也含有AS04佐劑，除含有HPV-16/18型外，還含有HPV-6/11型，這兩種疫苗均用于預(yù)防人類(lèi)乳頭狀瘤病引起的子宮頸癌等疾病[28]。

ShingrixTM：由GSK研制的帶狀皰疹疫苗，使用AS01佐劑系統(tǒng)[29]。在沒(méi)有廣泛接種痘疫苗時(shí)，北美近90%的人群得過(guò)水痘帶狀皰疹（VZV），約 20%的成年人會(huì)在其一生中發(fā)展為帶狀皰疹。2018年，VZV糖蛋白E佐劑亞單位疫苗（ShingrixTM）被批準(zhǔn)用于成年人預(yù)防帶狀皰疹[27]。

MosquirixTM（RTS，S/AS01）：由GSK研制的瘧疾疫苗，其組分包括重組惡性瘧原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白（RTS）、乙型肝炎表面抗原（S）和AS01。在針對(duì)兒童（5至17個(gè)月）和嬰兒（6至12周）的III期研究中，疫苗對(duì)兒童的有效性高于嬰兒，是第一個(gè)針對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)的疫苗[29-30]。

3 總結(jié)與展望

本文簡(jiǎn)單介紹了單磷酸脂質(zhì)A類(lèi)化合物的來(lái)源、結(jié)構(gòu)以及含單磷酸脂質(zhì)A的AS佐劑系統(tǒng)。單磷酸脂質(zhì)A具有比傳統(tǒng)鋁鹽佐劑更強(qiáng)的免疫活性、有效性和安全性，列舉了其作為佐劑在上市疫苗中的應(yīng)用。重點(diǎn)分析了兩條化學(xué)合成單磷酸脂質(zhì)A的路線(xiàn)，其中路線(xiàn)2更適于工藝研究，選取Nap作為保護(hù)基，最后用 DDQ 干凈高效地脫除了Nap保護(hù)基，避免使用催化氫化，大幅提高了收率。但是，目前單磷酸脂質(zhì)A的全合成依舊停留在毫克級(jí)別，還未大規(guī)模生產(chǎn)以商業(yè)化應(yīng)用。因此，希望本文分析總結(jié)的單磷酸脂質(zhì)A的合成方法，對(duì)其今后合成工藝研究以及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考和幫助。

[1] Johnson D A, Sowell C G, Keegan D S,. Chemical synthesis of the major constituents of salmonella minnesota monophosphoryl lipid A[J]. Journal of Carbohydrate Chemistry, 1998, 17(9): 1421-1426.

[2] 張曉音, 吳旻, 李雨萌, 等. 脂多糖的效應(yīng)及其機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2015, 36(12): 133-136.

[3] Rietschel E T. Bacterial endotoxin: Chemical constitution, biological recognition, host response, and immunological detoxification[J]. Curr Top Microbiol Immunol, 1996, 216: 39-81.

[4] 何明洪, 朱德康, 陳華萍, 等. 脂質(zhì)A參與免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)研究進(jìn)展[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2011, 27(001): 112-114.

[5] Alexander C, Zhringer U. Chemical structure of lipid A. The primary immunomodulatory center of bacterial lipopolysaccharides[J]. Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 2010, 14(76): 69-86.

[6] Park B S, Dong H S, Kim H M,. The structural basis of lipopolysaccharide recognition by the TLR4-MD-2 complex[J]. Nature, 2009, 458(7242): 1191-1195.

[7] 劉興, 馮文莉, 康格非. 脂多糖受體的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2001, 22(3): 134-135.

[8] 趙虎, 孔憲濤. 單磷酸類(lèi)脂A的免疫調(diào)節(jié)作用[J]. 國(guó)際免疫學(xué)雜志, 1992, (1): 1-4.

[9] Jiang Z H, Budzynski W A, Qiu D,. Monophosphoryl lipid A analogues with varying 3-O-substitution: Synthesis and potent adjuvant activity[J]. Carbohydrate Research, 2007, 342(6): 784-796.

[10] Salkowski C A, Detore G R, Vogel S N. Lipopolysaccharide and monophosphoryl lipid A differentially regulate interleukin-12, gamma interferon, and interleukin-10 mRNA production in murine macrophages[J]. Infection & Immunity, 1997, 65(8): 3239-3247.

[11] 郭忠武, 王千里, 唐壽初. 單磷酸化的脂質(zhì)a衍生物: CN,102596220[P]. 2012-07-18.

[12] Qureshi N, Takayama K, Ribi E. Purification and structural determination of nontoxic lipid A obtained from the lipopolysaccharide of Salmonella typhimurium[J]. Journal of Biological Chemistry, 1982, 257(19): 11808-11815.

[13] Evans J T, Cluff C W, Johnson D A,. Enhancement of antigen-specific immunity via the TLR4 ligands MPL adjuvant and Ribi.529[J]. expert review of vaccines, 2003, 2(2): 219-229.

[14] Casella C R, Mitchell T C. Putting endotoxin to work for us: Monophosphoryl lipid A as a safe and effective vaccine adjuvant[J]. Cellular & Molecular Life Sciences, 2008, 65(20): 3231-3240.

[15] Pieretti G, Cipolletti M, D D’Alonzo,A combined fermentative-chemical approach for the scalable production of pure E. coli monophosphoryl lipid A[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2014, 98(18): 7781-7791.

[16] Almostafa M, Allehyane B, Egli S,. Tandem mass spectrometry determination of the putative structure of a heterogeneous mixture of Lipid As isolated from the lipopolysaccharide of the gram-negative bacteria aeromonas liquefaciens SJ-19a[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2016, 30(8): 1043-1058.

[17] Maiti K K, De Castro M, El‐Sayed A B M A,. Chemical synthesis and proinflammatory responses of monophosphoryl lipid A adjuvant candidates[J]. European Journal of Organic Chemistry, 2010, 2010(1): 80-91.

[18] Zamyatina, A, Sekljic H, Brade H,. Synthesis and purity assessment of tetra- and pentaacyl lipid A of chlamydia containing (R)-3-hydroxyicosanoic acid[J]. Tetrahedron, 2004, 60(52): 12113-12137.

[19] Verpalen E, Brouwer A J, Boons G J. Synthesis of monophosphoryl lipid A using 2-naphtylmethyl ethers as permanent protecting groups[J]. Carbohydrate Research, 2020, 498(108152): 1-8.

[20] Xia J, Abbas S A, Locke R D,. Use of 1,2-dichloro 4,5-dicyanoquinone (DDQ) for cleavage of the 2-naphthylmethyl (NAP) group[J]. Tetrahedron Letters, 2000, 41(2): 169-173.

[21] Gaunt M J, Yu J, Spencer J B. Rational design of benzyl-type protecting groups allows sequential deprotection of hydroxyl groups by catalytic hydrogenolysis[J]. Cheminform, 1998, 29(46): 4172-4173.

[22] 全文靜, 徐靜, 李樹(shù)香. 含單磷酸脂質(zhì)A及其類(lèi)似物佐劑的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際生物制品學(xué)雜志, 2021, 44(2): 109-114.

[23] 于永利. AS系列佐劑[J]. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展, 2017, 45(1): 1-6.

[24] Wivine B, Andrea C, Viviane B.. Different adjuvants induce common innate pathways that are associated with enhanced adaptive responses against a model antigen in humans[J]. Frontiers in Immunology, 2017, 8(943): 1-17.

[25] Damme P V, Leroux-Roels G, Simon P,. Effects of varying antigens and adjuvant systems on the immunogenicity and safety of investigational tetravalent human oncogenic papillomavirus vaccines: Results from two randomized trials[J]. Vaccine, 2014, 32(29): 3694-3705.

[26] Lindemann M, Zaslavskaya M, Fiedler M,. Humoral and cellular responses to a single dose of fendrix in renal transplant recipients with non-response to previous hepatitis B vaccination[J]. Scandinavian Journal of Immunology, 2017, 85(1): 51-57.

[27] Reed S G, Carter D, Casper C,. Correlates of GLA family adjuvants? activities[J]. Seminars in Immunology, 2018, 39: 22-29.

[28] Einstein M H, Levin M J, Chatterjee A,Comparative humoral and cellular immunogenicity and safety of human papillomavirus (HPV)-16/18 AS04-adjuvanted vaccine and HPV-6/11/16/18 vaccine in healthy women aged 18-45 years: Follow-up through Month 48 in a Phase III randomized study[J]. Human Vaccines & Immunotherapeutics, 2014, 10(12): 3455-3465.

[29] Lacaille-Dubois M A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review[J]. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology, 2019, 60: 1-12.

[30] RTS S C T P. Efficacy and safety of RTS,S/AS01 malaria vaccine with or without a booster dose in infants and children in Africa: Final results of a phase 3, individually randomised, controlled trial[J]. The Lancet, 2015, 386(9988): 31-45.

Progress in the Synthesis of Vaccine Adjuvant Monophosphoryl Lipid A and Its Application in Vaccines

WANG Xu-long1,2, LI Xue2, MA Xiao-xue1, ZHOU Cheng-kai1, SUI Qiang1*

（1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shanghai University of Engineering Science, Shanghai 201620, China;2. China State Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 201203, China）

This paper briefly introduced the source and chemical structure of monophosphoryl lipid A, which is part of the structure of lipopolysaccharide inner layer lipid A on the outer membrane of Gram-negative bacteria. Two common synthetic routes of monophosphoryl lipid A were summarized, and their advantages and disadvantages were analyzed. It is pointed out that route 2 is the best synthetic method, which cleverly selected Nap as the protecting group. The Nap protective group was removed cleanly and efficiently with DDQ to avoid the use of catalytic hydrogenation, which was more suitable for process amplification research than route 1. Compared with biological extraction, chemical synthesis avoided the problems of sugar heterogeneity and low purity. Finally, the application of monophosphoryl lipid A as adjuvant in various vaccines was summarized, so as to provide reference for the further research of monophosphoryl lipid A.

monophosphoryl lipid A; lipopolysaccharide; synthesis; 2-naphtylmethyl; adjuvant; vaccine

2021-12-20

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2013ZX09301302-X-5）。

汪緒龍（1995～），男，安徽六安人，碩士；主要從事藥物合成研究。

隋強(qiáng)（1977～），男，研究員，碩士生導(dǎo)師；主要從事糖疫苗佐劑研究。

R186.3

A

1009-220X(2022)03-0001-07

10.16560/j.cnki.gzhx.20220308