煙嘧磺隆降解菌Chryseobacterium sp. LAM-M5的分離、鑒定及其降解機(jī)理研究

馬青云 江旭 李情情 宋金龍 周義清 阮志勇，4，5

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/CAAS-CIAT可持續(xù)農(nóng)業(yè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京100081；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京100081；3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100141；4. 西藏農(nóng)牧學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，林芝 860000；5. 煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺 264005）

化學(xué)除草劑在保障糧食產(chǎn)量和質(zhì)量方面發(fā)揮了重要的支撐作用。然而，中國作為除草劑生產(chǎn)和使用大國，每公頃農(nóng)田中除草劑的平均使用量為世界平均水平的 1.5-4 倍［1］，除草劑殘留正成為限制中國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的瓶頸問題之一［2］。磺酰脲類除草劑屬于高效、低毒、高選擇性的新型除草劑，被廣泛應(yīng)用于水稻、玉米、小麥、大豆等田間雜草的防控，其用量也逐年遞增［3］。2015 年全世界磺酰脲類除草劑的銷售額已達(dá)20.19億美元，占整個(gè)除草劑市場的11.0%［4］。煙嘧磺隆是磺酰脲類除草劑的代表性品種（圖1），年銷售額達(dá)2.82億美元［5］，由于其淋溶性較強(qiáng)，易對土壤及地下水造成污染，對生態(tài)環(huán)境和人類健康存在潛在的威脅［6-8］，同時(shí)影響輪作和后茬敏感作物，并危害水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。

圖1 煙嘧磺隆化學(xué)結(jié)構(gòu)式［3］Fig.1 Chemical structural formula of nicosulfuron

煙嘧磺隆在自然環(huán)境中可通過化學(xué)水解［9］、微生物代謝［10］和光催化實(shí)現(xiàn)降解［11］。微生物代謝降解是實(shí)現(xiàn)煙嘧磺隆從環(huán)境中去除的最主要過程，也是最有效和環(huán)境友好的途徑。迄今為止，已經(jīng)從農(nóng)田土壤、工廠排污口、河流、活性污泥等多個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中分離出了多個(gè)煙嘧磺隆降解菌株。Zhao 等［12］從磺酰脲類除草劑污染的農(nóng)田土壤中分離得到的糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis）ZWS11，在6 d內(nèi)對初始質(zhì)量濃度為 500 mg/L的煙嘧磺隆的降解率達(dá) 80% 以上。代鵬飛等［13］從農(nóng)藥廠的活性污泥中分離到一株能以煙嘧磺隆為唯一碳源生長的假單胞菌（Pseudomonas）YN-8，在7 d內(nèi)對100 mg/L 的煙嘧磺隆降解率為65.4%。張國民等［14］從玉米田土壤中分離到一株紅假單胞菌（Rhodopseudomonas），在7 d內(nèi)對400 mg/L的煙嘧磺隆降解率為32.3%。Wang等［15］從人工濕地土壤中分離得到的克雷伯氏菌（Klebsiella）Y1，在 6 d內(nèi)對100 mg/L的煙嘧磺隆降解率為78.90%。Carles等［16］從煙嘧磺隆污染的農(nóng)田土壤中分離到一株（Pseudomonas fluorescens）SG-1，在1 d內(nèi)對2.5 mg/L的煙嘧磺隆降解率為77.5%。此外，研究人員還分離到了具有煙嘧磺隆降解能力的真菌，例如，F(xiàn)eng等［17］從活性污泥中分離到一株青霉菌（Penicillium）YC-WC1，在6 d內(nèi)能完全降解100 mg/L的煙嘧磺隆。許多研究人員從降解菌株中發(fā)現(xiàn)了多種降解相關(guān)的功能基因及酶，例如，李順鵬等［18］從嗜甲基菌（Methylophilussp.）S113 菌株中獲得了噻吩磺隆水解酶基因tsmE，該基因的表達(dá)產(chǎn)物在1 h 內(nèi)能夠?qū)?00 mg/L 的噻吩磺隆完全水解。Ruan等［19］對庫特氏屬（Kurthia huakuii）LAM0713菌株克隆得到一個(gè)新的酯酶基因sue，該基因的表達(dá)產(chǎn)物在 15 min 內(nèi)對50 mg/L的醚磺隆降解率達(dá)43.2%。宋金龍［20］從黃籃狀菌（Talaromyces flavus）LZMl中純化得到的黃素單加氧酶fmo，在15 min內(nèi)對50 mg/L煙嘧磺隆的降解率達(dá) 71.7%。

目前已報(bào)道的煙嘧磺隆降解菌的多樣性十分有限，僅集中在芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）等幾個(gè)屬中，難以滿足不同環(huán)境條件下煙嘧磺隆污染的生物修復(fù)需求，因此，有必要從不同環(huán)境樣品中分離得到更多更豐富的煙嘧磺隆降解菌資源，并進(jìn)行功能評價(jià)及降解機(jī)理研究。本研究從合肥某煙嘧磺隆生產(chǎn)廠的活性污泥中分離并篩選得到一株能以煙嘧磺隆為唯一氮源生長菌株，對其進(jìn)行分類鑒定和降解機(jī)理研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 供試樣品采自安徽合肥某磺酰脲類除草劑生產(chǎn)廠廢水處理池的活性污泥，采集后裝入滅菌自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，用于煙嘧磺隆降解菌的分離。

1.1.2 主要試劑 煙嘧磺?。ǚ治黾?，＞ 95%）購自上海阿拉丁有限公司，Taq DNA 聚合酶（MT201）、dNTPs、DNA Marker、所用引物購自博邁德有限公司，乙腈（色譜純）等有機(jī)試劑均購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 GSM培養(yǎng)基：5.0 g葡萄糖，0.2 g NaCl，0.1 g CaCl2，0.5 g K2HPO4，0.2 g MgSO4·12H2O，pH 7.0，無 機(jī) 鹽 培 養(yǎng) 基：1.0 g Na3HPO4·12H2O，0.5 g K2HPO4，0.2 g MgSO4·12H2O，pH 7.0。在115℃條件下高壓滅菌20 min。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：3.0 g牛肉膏，10.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl，20.0 g瓊脂，1 000 mL水，pH 7.4-7.6，121℃條件下高壓滅菌20 min，液體培養(yǎng)基中不加瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 煙嘧磺隆降解菌的富集與篩選 取10 g污泥樣品添加到100 mL含終濃度為50 mg/L的煙嘧磺隆的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30℃、160 r/mim的搖床上避光培養(yǎng)30 d，然后以5%的接種比例將該體系轉(zhuǎn)接至100 mL含150 mg/L煙嘧磺隆的新鮮無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，每次提高煙嘧磺隆濃度50 mg/L，并使煙嘧磺隆終濃度達(dá)到200 mg/L。馴化3個(gè)月后將培養(yǎng)液用無菌水進(jìn)行倍比稀釋后涂布到含50 mg/L煙嘧磺隆的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上。將出現(xiàn)的菌落劃線純化后放置- 80℃冰箱保藏備用。

1.2.2 煙嘧磺隆降解菌的初步鑒定 將獲得菌株接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng) 2 d后觀察菌落形態(tài)，采用革蘭氏染色法確定菌株革蘭氏類型。將菌株接種于牛肉膏液體培養(yǎng)基中并置于30℃，160 r/mim的搖床上培養(yǎng)過夜，利用DNA提取試劑盒提取菌液DNA，經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，以該DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用細(xì)菌通用引物1492R和27F擴(kuò)增該菌株中的16S rRNA基因［21］，純化的PCR產(chǎn)物由北京博邁德測序公司進(jìn)行測序。PCR反應(yīng)體系為（25 μL）：模板DNA 1 μL；正向及反向引物各 1 μL；Taq PCR Mix 12.5 μL；ddH2O 8.5 μL。PCR 程序如下：95℃，初始變性 5 min；95℃，變性 30 s；55℃退火 30 s；72℃延伸 1.5 min，循環(huán) 30 次；72℃，延伸 10 min。將測序結(jié)果提交至EzBioCloud［22］進(jìn)行序列比對，根據(jù)比對結(jié)果，選擇相似性高的菌株作為參比并下載相關(guān)模式菌株的16S rRNA基因序列，通過 CLUSTAL X［23］進(jìn)行多序列比對，使用MEGA7.0［24］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹確定該菌的分類地位。

1.2.3 菌株降解性能測定 將菌株LAM-M5接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于30℃，165 r/min的恒溫?fù)u床上避光培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)液在8 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min，棄上清，收集菌體。用0.13mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.2）洗滌菌體3次后重懸，以5.0%（V∶V）接種比例接入含終濃度50 mg/L煙嘧磺隆的GSM培養(yǎng)基中，于30℃、165 r/min條件下避光培養(yǎng)，研究降解菌對煙嘧磺隆的降解效果，以未接種的相同體系作為空白對照，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，定期取樣檢測液體培養(yǎng)基中煙嘧磺隆殘留量。

煙嘧磺隆的測定采用高效液相色譜法［25］，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間定性、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積外標(biāo)法定量。本實(shí)驗(yàn)采用Agilent 1200 LC高效液相色譜：色譜柱：Dikam Diam onsil C18，柱長 250 mm×4.6 mm，內(nèi)徑5 μm；柱溫：30℃；流速1.0 mL/min；流動相：乙腈∶水∶冰乙酸 =（30∶70∶0.05，V∶V∶V）；進(jìn)樣量10 μL，檢測波長245 nm。根據(jù)公式計(jì)算降解能力：降解率/% =［1 -（實(shí)測殘量/對照樣實(shí)測殘量）］× 100%［26］。

1.2.4 菌株降解煙嘧磺隆的特性研究 菌株的降解特性研究包括菌株在不同溫度、pH及接種量條件下對煙嘧磺隆的降解能力。設(shè)置不同溫度（15、20、25、30和35℃），不 同pH值（5、6、7、8和9）和不同接種量（0.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%和10.0%，V∶V），將菌株接種至不同條件下含煙嘧磺隆GSM培養(yǎng)基中作為處理組，以相同條件下不接入菌株為對照組，測定煙嘧磺隆殘余濃度計(jì)算菌株的降解率。

1.2.5 短鏈有機(jī)酸的鑒定 利用HPLC檢測并鑒定菌株LAM-M5在含煙嘧磺隆的GSM培養(yǎng)基中產(chǎn)生的短鏈有機(jī)酸情況，檢測條件：流動相為磷酸二氫銨（0.02 mmol/L，pH 2.7）與甲醇的混合物（比例為85∶15，V∶V），進(jìn)樣量為10 μL，光電二極管陣列檢測器的波長為210 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃。以分析純級的草酸、L -蘋果酸、α-酮戊二酸、檸檬酸和富馬酸作為參照標(biāo)樣。

1.2.6 菌株LAM-M5降解煙嘧磺隆中間產(chǎn)物的檢測 將菌株LAM-M5按1.2.3的方法培養(yǎng)并制備OD600為1.0的菌懸液。取5.0%的LAM-M5菌懸液接種到含有50 mg/L煙嘧磺隆的GSM培養(yǎng)基，以相同條件但不接菌的GSM培養(yǎng)基作為空白對照，分別培養(yǎng)3 d后取樣，上述所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。使用配備電噴霧電離的Xevo三重四極桿（Xevo-TQD）質(zhì)譜儀（Waters Corp，Milford，MA，USA）進(jìn)行檢測。質(zhì)量模式m/z為100-450［27］，Masslynx NTV的正模式（ESI +）和負(fù)模式（ESI -）的ESI源被用于收集和分析獲得的數(shù)據(jù)［28］。

1.2.7 菌株LAM-M5全基因組測序及分析 將菌株LAM-M5送至諾禾致源科技有限公司（北京，中國）進(jìn)行基因組測序，具體流程參考文獻(xiàn)［29］。菌株全基因組測序完成后，分析菌株的基因組成分，分析預(yù)測編碼基因、非編碼 RNA、重復(fù)序列、CRISPR 等基因組成分，并使用KEGG、GO、Swissprot、NR、COG等數(shù)據(jù)庫對編碼基因序列進(jìn)行功能注釋。結(jié)合已報(bào)道降解相關(guān)的基因，搜索并分析該菌株中可能存在的與煙嘧磺隆降解相關(guān)的功能基因信息。

2 結(jié)果

2.1 煙嘧磺隆降解菌株的分離

將富集培養(yǎng)得到的富集液進(jìn)行煙嘧磺隆的降解驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)富集液對煙嘧磺隆幾乎無降解作用，接下來對富集液進(jìn)行平板稀釋涂布，共獲得18株細(xì)菌，其中菌株LAM-M5的降解能力最強(qiáng)，在GSM培養(yǎng)基中7 d（30℃，5%接種量）對50 mg/L的煙嘧磺隆的降解率可達(dá)92.39%，選作后續(xù)研究菌株。

2.2 煙嘧磺隆降解菌株的鑒定

菌株LAM-M5在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，菌落呈金黃色，不透明（圖2）。革蘭氏陰性，無鞭毛。

圖2 菌株LAM-M5在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain LAM-M5 on the beef extract peptone medium plate

將菌株LAM-M5的16S rRNA基因序列（1 505 bp）提交至Genbank數(shù)據(jù)庫中（序列登錄號為：MW647553）。將該基因序列信息在EzBiocloud網(wǎng)站上進(jìn)行比對，結(jié)果表明，LAM-M5的16S rRNA基因序列與Chryseobacterium lacusYLOS41T相似性最高，達(dá)到99.93%。利用 NJ（neighbor joining method）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）可以看出，菌株LAM-M5與來自Chryseobacterium屬的菌株聚在一起，因此，初步將該菌株鑒定為Chryseobacteriumsp. LAM-M5。自NCBI數(shù)據(jù)庫中下載菌株Chryseobacterium lacusYLOS41T的全基因組信息，通過OrthoANIu algorithm（https://www.ezbiocloud.net/tools/ani）分析菌株間的平均核苷酸一致性（average nucleotide identity，ANI）。結(jié)果表明，菌株LAM-M5的基因組序列與Chryseobacterium lacusYLOS41T的ANI值是97.74%，利 用Genome-to-Genome Distance Calculator 2.1（http://ggdc.dsmz.de/）計(jì)算菌株間的DNA雜交同源性（DNA-DNA hybridization，DDH），菌株LAM-M5與Chryseobacterium lacusYLOS41T間的DDH值為79%，兩個(gè)數(shù)值均高于定義同種的閾值（ANI 95%-96%和DDH 70%）［30］，因此將該菌株LAM-M5鑒定為Chryseobacterium lacus，這是首次關(guān)于金黃桿菌屬（Chryseobacterium）菌株降解煙嘧磺隆的報(bào)道。

圖3 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbour-joining phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences

2.3 煙嘧磺隆的降解特性

LAM-M5可以在較寬的pH值范圍（5-9）內(nèi)降解煙嘧磺?。▓D4-A），降解率隨pH值的降低而增加。初始pH值為6.0時(shí)，菌株LAM-M5對煙嘧磺隆的降解效果最佳，可達(dá)92.39%。在第3天時(shí)，開始對50 mg/L煙嘧磺隆表現(xiàn)出明顯的降解，此時(shí)體系pH值開始下降；第7天時(shí)，體系pH值降至3.5，此時(shí)菌株LAM-M5對50 mg/L的煙嘧磺隆降解率達(dá)到92.39%。菌株LAM-M5對溫度具有較好的適應(yīng)性，它在15℃-35℃范圍內(nèi)均能降解煙嘧磺隆，且降解效率隨溫度增加而增加（圖4-B），在35℃時(shí)降解效果最佳，達(dá)到98.39%。菌株LAM-M5的初始接種量對煙嘧磺隆的降解率也有影響，隨著接種量的增加，降解效率有明顯的增加，初始接種量為10% 時(shí)，降解效率最高，達(dá)到99.6%。

圖4 不同pH值（A）、溫度（B）、接種量（C）對菌株LAM-M5 降解煙嘧磺隆降解率的影響Fig.4 Effects of different pH（A），temperature（B）and initial inoculum ratio（C）on the degradation of nicosulfuron by strain LAM-M5

同時(shí)驗(yàn)證了菌株LAM-M5對其他田間常用除草劑的降解，例如，磺酰脲類除草劑氯嘧磺隆和三酮類除草劑硝磺草酮，在相同的培養(yǎng)條件和降解體系內(nèi)，菌株LAM-M5對這兩類除草劑在7 d內(nèi)均無降解。

2.4 菌株LAM-M5降解煙嘧磺隆過程中產(chǎn)生的短鏈有機(jī)酸的鑒定

本研究中，菌株LAM-M5在含煙嘧磺隆的GSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，體系pH值在7 d之內(nèi)從7.0降至3.0左右（圖5）。利用HPLC對菌株的培養(yǎng)液進(jìn)行了檢測，在培養(yǎng)液中檢測到了大量L -蘋果酸，由于煙嘧磺隆在酸性條件下極不穩(wěn)定，推測菌株LAM-M5通過代謝葡萄糖產(chǎn)生大量L-蘋果酸，降低環(huán)境pH值，從而使煙嘧磺隆發(fā)生脲橋斷裂而降解。

圖5 LAM-M5降解煙嘧磺隆過程中pH值的變化Fig.5 Change of pH value during the nicosulfuron degradation by strain LAM-M5

2.5 菌株LAM-M5降解煙嘧磺隆代謝產(chǎn)物的檢測及其代謝途徑的推測

通過高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用［31］，對菌株LAM-M5在含煙嘧磺隆的GSM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后的中間代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測與分析。ESI源檢測結(jié)果表明，在陰離子和陽離子模式下，共檢測到5個(gè)片段，質(zhì)荷比分別為409m/z，259m/z，228m/z，156m/z，304m/z。根據(jù)已報(bào)道的代謝途徑及中間產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)［31-33］，對檢測片段的物質(zhì)類型和產(chǎn)生途徑進(jìn)行了推斷，其中陰離子模式中的259.44m/z（2-（N-氨基甲?；酋；酋；? N，N-二甲基丙酰胺）是由于磺酰脲橋C-N鍵的斷裂產(chǎn)生，并進(jìn)一步斷裂酰胺鍵產(chǎn)生228.38m/z（2-氨基磺酰基-N，N-二甲基丙酰胺）。陽離子模式下質(zhì)荷比為304.18m/z（N-（4，6-二甲氧基嘧啶-2-基氨基甲?；?1-（甲基亞氨基）甲磺酰胺）的產(chǎn)生是由于煙嘧磺隆中吡啶環(huán)的開環(huán)［34］；在陽離子模式下檢測到的155.41m/z（2-氨基-4，6-二甲氧基嘧啶）產(chǎn)物是由304.18m/z產(chǎn)物的磺酰脲橋的酰胺鍵斷裂產(chǎn)生。綜上，推測得出了菌株LAM-M5在GSM培養(yǎng)基中對煙嘧磺隆可能的降解途徑（圖6）。

圖6 菌株LAM-M5降解煙嘧磺隆的代謝途徑Fig .6 Proposed metabolic pathways of nicosulfuron degradation by strain LAM-M5

2.6 菌株LAM-M5基因組分析

2.6.1 菌株LAM-M5基因組測序數(shù)據(jù)分析 通過對菌株LAM-M5的基因、重復(fù)序列、非編碼 RNA 等的預(yù)測，獲得了該菌株基因組的組成基本情況信息（表1）。菌株LAM-M5的基因總長度為5.704 Mb，基因組中含基因數(shù)量達(dá)6 366個(gè)，平均長度 896 bp。串聯(lián)重復(fù)序列共 280個(gè)，總長為 17 086 bp，占基因組全長的 0.2707%。小衛(wèi)星序列 211個(gè)，微衛(wèi)星序列 0個(gè)，tRNA 121個(gè)，rRNA 14個(gè)。

表1 LAM-M5的基因組組分結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 1 Genomic characteristics of strain LAM-M5

2.6.2 菌株LAM-M5對煙嘧磺隆降解酶基因的預(yù)測 在該研究中，對菌株LAM-M5進(jìn)行基因組Swiss-port的數(shù)據(jù)庫分析，同時(shí)結(jié)合已報(bào)道的煙嘧磺隆的降解基因分析，對菌株LAM-M5中可能參與煙嘧磺隆降解的相關(guān)基因進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果如表2所示。

表2 菌株LAM-M5 基因組中7個(gè)降解酶相關(guān)的基因Table 2 7 genes related to degradation enzymes in the genome of strain LAM-M5

3 討論

煙嘧磺隆長期使用造成的殘留會對土壤及地下水造成污染，對生態(tài)環(huán)境和人類健康存在潛在的威脅，同時(shí)損害后茬敏感農(nóng)作物，并危害水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。因此尋找高效、環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)的除草劑污染環(huán)境治理方法十分迫切。微生物修復(fù)技術(shù)無毒、無殘留，避免了二次污染，是消除煙嘧磺隆殘留及保障農(nóng)產(chǎn)品安全的有效途徑之一。目前已經(jīng)從各種環(huán)境樣本中通過富集馴化等方式獲得了許多煙嘧磺隆的降解資源。但是這些降解資源僅限于環(huán)境中的優(yōu)勢屬，例如芽孢桿菌屬（Bacillus），假單胞菌屬（Pseudomonas）等。環(huán)境中存在著豐富的微生物資源，許多具有降解功能的菌株資源未被發(fā)掘，可嘗試通過培養(yǎng)組學(xué)［35］的方法獲得更多的煙嘧磺隆降解的菌株資源，豐富除草劑的微生物降解資源庫。本實(shí)驗(yàn)從某煙嘧磺隆生產(chǎn)廠的活性污泥中，分離出一株煙嘧磺隆高效降解菌株LAM-M5，通過16S rRNA的基因序列比對，初步將菌株鑒定為Chryseobacterium lacusLAM-M5。

在已報(bào)道的煙嘧磺隆微生物降解途徑與相關(guān)機(jī)制中，煙嘧磺隆主要通過脲橋上的C-N鍵斷裂完成降解。Zhao等［12］在糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalisZWS11）對煙嘧磺隆的降解產(chǎn)物中檢測到了N，N-二甲基-2-氨基磺?；?3-吡啶甲酰胺和2-氨基-4，6-二甲氧基嘧啶，并由此推斷這兩個(gè)降解產(chǎn)物是由磺酰脲橋的C-N鍵斷裂直接得到的。Zhang等［36］根據(jù)粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescensN80）對煙嘧磺隆的主要降解產(chǎn)物推測了其降解途徑，其中化合物N，N-二甲基-2-氨基磺?；?3-吡啶甲酰胺和2-氨基-4，6-二甲氧基嘧啶均是在微生物作用下直接從煙嘧磺隆獲得，分別來自于磺酰脲橋上 C-N 鍵的斷裂?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，不同種類微生物對煙嘧磺隆的降解途徑均存在差異，并導(dǎo)致所產(chǎn)生的中間降解產(chǎn)物有所不同［37］，但是幾乎所有的煙嘧磺隆降解體系中都能直接檢測到產(chǎn)物N，N-二甲基-2-氨基磺酰基-3-吡啶甲酰胺和2-氨基-4，6-二甲氧基嘧啶，表明這兩種化合物是在微生物作用下直接由煙嘧磺隆產(chǎn)生的。但是在本研究中，檢測到的2-氨基-4，6-二甲氧基嘧啶并不能在菌株LAM-M5的作用下直接獲得，而是由中間產(chǎn)物N-（4，6-二甲氧基嘧啶-2-基氨基甲酰基）-1-（甲基亞氨基）酰胺鍵斷裂后生成的。表明菌株LAM-M5對煙嘧磺隆的降解過程和機(jī)制不同于糞產(chǎn)堿桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌。

在以前的報(bào)道中，對黃籃狀真菌（Talaromyces flavusLZM1）［21］和臘狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）［32］降解煙嘧磺隆的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了比較深入的研究。這兩個(gè)菌在降解煙嘧磺隆過程中均能直接產(chǎn)生259.44 m/z（2-氨基磺?；?N，N-二甲基煙酰胺），304.18 m/z（N-（4，6-二甲氧基嘧啶-2-基氨基甲?；?1-（甲基亞氨基）甲磺酰胺）和另外一個(gè)346m/z（2-（1-（4，6-二甲氧基-嘧啶-2-）-脲基）-N，N-二甲基-煙酰胺）產(chǎn)物，說明這兩個(gè)菌均能通過3種途徑降解煙嘧磺隆。而在本研究中，雖然我們嘗試不同時(shí)間取樣和改變檢測條件，但是346 m/z這個(gè)產(chǎn)物卻始終檢測不到，說明菌株LAM-M5對煙嘧磺隆的降解過程和機(jī)制不同于黃籃狀真菌和臘狀芽孢桿菌。

同時(shí)監(jiān)測到該菌株與煙嘧磺隆共培養(yǎng)過程中，體系的pH值從7.0減少到3.0，環(huán)境酸化，而煙嘧磺隆在酸性條件下極不穩(wěn)定，從而造成煙嘧磺隆的脲橋發(fā)生斷裂，推測這可能是一種微生物自我保護(hù)機(jī)制。通過對菌株的全基因組信息分析，發(fā)現(xiàn)該菌株的基因序列中含有大量已報(bào)道的參與煙嘧磺隆降解過程的功能基因，如水解酶［19］、氧化酶［37］、酯酶［38］、過氧化氫酶［39］等。

4 結(jié)論

從活性污泥中獲得了一株煙嘧磺隆的高效降解菌，初步鑒定為Chryseobacterium lacusLAM-M5，該菌最適的降解條件為35℃，pH 6.0，接種量10%時(shí)菌株對50 mg/L的煙嘧磺隆降解率最高可達(dá) 92.39%。菌株在以葡萄糖為碳源時(shí)，通過產(chǎn)生大量的L-蘋果酸導(dǎo)致體系內(nèi)pH值下降，造成煙嘧磺隆脲橋斷裂。菌株Chryseobacterium lacusLAM-M5對煙嘧磺隆具有較高的降解能力。