煙嘧磺隆對(duì)甜玉米糖酵解和三羧酸循環(huán)途徑中關(guān)鍵物質(zhì)的影響

蒙彥宇， 王 健， 李 云， 韓金玲， 韓玉翠， 楊 敏， 林小虎， 周印富

(河北科技師范學(xué)院，河北秦皇島 066004)

甜玉米(ZeamaysL. ssp.saccharataSturt)有水果玉米、蔬菜玉米之稱，具有廣闊的市場(chǎng)前景。為了迎合市場(chǎng)需求，玉米的品種選育逐漸向籽粒含高糖量方向發(fā)展，而甜玉米籽粒的高含糖量會(huì)降低種子活力，導(dǎo)致群體冠層生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，無(wú)法應(yīng)對(duì)田間日益激烈的雜草競(jìng)爭(zhēng)[1]。

因此，使用除草劑控制田間雜草是甜玉米生產(chǎn)的必然選擇。煙嘧磺隆是一種磺酰脲類內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，常用于玉米田苗后雜草控制[2]。煙嘧磺隆的選擇性除草作用機(jī)制是基于玉米、雜草對(duì)其代謝的差異實(shí)現(xiàn)的。在煙嘧磺隆脅迫下，受害嚴(yán)重的玉米幼苗可出現(xiàn)大面積失綠、矮化、畸形，甚至死亡[3-4]。近幾年來(lái)，煙嘧磺隆得到廣泛使用，但其在甜玉米上應(yīng)用的安全性還未得到全面驗(yàn)證。

糖酵解是生物體取得能量的主要方式，其途徑是將葡萄糖、糖原降解為丙酮酸，生成的丙酮酸進(jìn)入線粒體，通過(guò)三羧酸循環(huán)(TCA)途徑及電子傳遞鏈徹底氧化成二氧化碳和水，并生成三磷酸腺苷(ATP)[5-6]。任曉松等研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫會(huì)降低玉米種子的糖酵解、TCA途徑和磷酸戊糖途徑的轉(zhuǎn)運(yùn)效率[7]。薛梅真等研究發(fā)現(xiàn)，人工老化處理使己糖激酶(HK)活性升高，ATP含量降低，最終會(huì)影響玉米種子的發(fā)芽率[8]。Hao等研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫條件會(huì)導(dǎo)致玉米根部糖類物質(zhì)和相關(guān)酶的基因表達(dá)量發(fā)生改變[9]。

糖代謝途徑是植物獲取能量的主要方式，關(guān)于逆境脅迫對(duì)植物體內(nèi)糖酵解和TCA途徑的影響已被廣泛報(bào)道[10-11]，但是關(guān)于煙嘧磺隆脅迫對(duì)甜玉米植株體內(nèi)糖酵解、TCA途徑的影響則鮮有報(bào)道。本研究的前期結(jié)果表明，煙嘧磺隆脅迫導(dǎo)致敏感性甜玉米HK320的光合特性值、葉綠素?zé)晒鈪?shù)顯著降低，PSⅡ反應(yīng)中心失活，C4途徑代謝活動(dòng)下降，將影響甜玉米體內(nèi)的物質(zhì)合成和積累[12-13]。在此研究基礎(chǔ)上，本研究繼續(xù)從糖酵解、TCA途徑角度解析煙嘧磺隆脅迫下甜玉米的耐藥生理機(jī)制，以期為減緩苗后除草劑對(duì)甜玉米的毒害作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和藥劑

供試材料為河北科技師范學(xué)院選育的1對(duì)對(duì)煙嘧磺隆表現(xiàn)出耐藥差異的甜玉米姊妹系，分別為耐藥性甜玉米自交系HK301、敏感性甜玉米自交系HK320。

試驗(yàn)藥劑為日本石原產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)的 40 g/L 煙嘧磺隆可分散油懸浮劑。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)開(kāi)始于2018年，在河北科技師范學(xué)院昌黎試驗(yàn)站進(jìn)行。前期除草劑濃度的篩選試驗(yàn)結(jié)果表明，在玉米苗4葉1心期，當(dāng)噴施藥劑濃度為 36 mg/hm2時(shí)，HK301可以正常生長(zhǎng)，HK320最終死亡[3]。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇36 g/hm2作為田間噴施煙嘧磺隆的濃度。

2020—2021年在河北科技師范學(xué)院昌黎試驗(yàn)站進(jìn)行大田試驗(yàn)。大田試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積為38.4 m2，設(shè)3次技術(shù)重復(fù)。設(shè)置藥劑噴施濃度為36 g/hm2，以噴施清水作為對(duì)照。在玉米4葉1心期時(shí)噴藥，分別在噴藥后1、3、5、7 d采集不同處理的葉片樣品置于液氮中，保存于-80 ℃冰箱中，用于葡萄糖(GLU)、丙酮酸(PA)、檸檬酸(CA)、草酰乙酸(OAA)、蘋果酸(MDH)、三磷酸腺苷(ATP)和6-磷酸葡萄糖(6PG)含量(以鮮質(zhì)量計(jì))的測(cè)定與己糖激酶(HK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性(以鮮質(zhì)量計(jì))的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

參照李圓圓的方法[14]進(jìn)行GLU含量的測(cè)定；參照Braithwaite等[15]、Martinez-Barajas等的方法[16]進(jìn)行HK活性的測(cè)定；參照Gonzalez等的方法[17-18]進(jìn)行PEPC活性的測(cè)定；參照孟德義的方法[19]進(jìn)行PA含量的測(cè)定；參照Yang等的方法[20]進(jìn)行CA含量的測(cè)定；參照崔曉慧的方法[21]進(jìn)行OAA含量的測(cè)定；參照尹志梅等的方法[22]進(jìn)行MDH含量的測(cè)定；參照應(yīng)漢杰等的研究方法[23]進(jìn)行6PG含量的測(cè)定；參照劉俊芳等的方法[24]進(jìn)行ATP含量的測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2007和SigmaPlot 12.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖，用SPSS 22.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙嘧磺隆對(duì)甜玉米糖酵解途徑的影響

2.1.1 煙嘧磺隆對(duì)甜玉米中葡萄糖含量的影響 由圖1可知，在煙嘧磺隆脅迫處理下，HK301的GLU含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在用煙嘧磺隆脅迫處理5 d后達(dá)到最大值。用煙嘧磺隆脅迫處理 3 d 后，HK301的GLU含量較對(duì)照(HK301-CK)增加41.62%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。在煙嘧磺隆脅迫處理下，HK320的GLU含量呈持續(xù)上升的趨勢(shì)。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3 d后，HK320的GLU含量與對(duì)照(HK320-CK)相比沒(méi)有顯著差異；用煙嘧磺隆脅迫處理5、7 d后，HK320的GLU含量分別較對(duì)照(HK320-CK)增加了21.56%、22.80%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。對(duì)2個(gè)自交系甜玉米的GLU含量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，用煙嘧磺隆脅迫處理1、7 d后，HK301的GLU含量分別較HK320低46.27%、62.80%，并且差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

2.1.2 煙嘧磺隆對(duì)甜玉米中6-磷酸葡萄糖含量的影響 由圖2可知，煙嘧磺隆脅迫處理顯著提高了HK301、HK320的6PG含量。在煙嘧磺隆脅迫處理1、3、5、7 d，HK301的6PG含量分別較對(duì)照(HK301-CK)增加了52.04%、64.07%、72.69%、50.19%，并且差異顯著。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3 d 后，HK320的6PG含量與對(duì)照(HK320-CK)間沒(méi)有顯著差異，用煙嘧磺隆脅迫處理5、7 d后，HK320的6PG含量分別比對(duì)照(HK320-CK)增加了48.77%、59.37%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

2.1.3 煙嘧磺隆對(duì)甜玉米中丙酮酸含量的影響 由圖3可知，在煙嘧磺隆脅迫處理下，HK301的PA含量較對(duì)照顯著增加。在噴藥后1、3、5、7 d，HK301的PA含量分別比對(duì)照(HK301-CK)增加了36.78%、29.67%、46.87%、26.22%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3、7 d后，HK320的PA含量分別較對(duì)照(HK320-CK)增加了30.80%、22.92%、27.37%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。用煙嘧磺隆脅迫處理5 d后，PA含量較對(duì)照(HK320-CK)顯著降低了21.35%。

2.1.4 煙嘧磺隆對(duì)甜玉米中己糖激酶活性的影響 由圖4可知，隨著煙嘧磺隆脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，HK301的HK活性呈上升趨勢(shì)。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3、5、7 d后，HK301的HK活性與對(duì)照(HK301-CK)相比分別增加了54.66%、55.48%、67.22%、17.83%(P<0.05)，并且差異顯著。隨著煙嘧磺隆脅迫時(shí)間的增加，HK320的HK活性總體呈先上升后下降的趨勢(shì)。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3、5、7 d后，HK320的HK活性分別較對(duì)照(HK320-CK)增加了51.07%、49.84%、51.06%、72.64%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。煙嘧磺隆脅迫處理顯著改變了2個(gè)自交系甜玉米的HK活性，用煙嘧磺隆處理1、3、5 d后，HK301的HK活性分別較HK320降低了64.18%、51.92%、82.56%。

2.1.5 煙嘧磺隆對(duì)甜玉米中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的影響 由圖5可知，用煙嘧磺隆脅迫處理5 d后，HK301的PEPC活性達(dá)到最大值，隨后呈下降趨勢(shì)。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3、5、7 d后，HK301的PEPC活性分別較對(duì)照(HK301-CK)增加了0.17%、45.12%、62.42%、60.49%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。在煙嘧磺隆脅迫處理下，HK320的PEPC活性呈持續(xù)下降的趨勢(shì)。用煙嘧磺隆脅迫處理1 d后，HK320的PEPC活性與對(duì)照(HK320-CK)相比無(wú)顯著變化，而用煙嘧磺隆脅迫3、5、7 d后，HK320的PEPC活性分別較對(duì)照(HK320-CK)減少了30.04%、50.57%、67.35%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。隨著煙嘧磺隆脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，2個(gè)自交系甜玉米的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性間的差異顯著。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，HK301的PEPC活性分別較HK320高38.81%、56.86%、80.31%、82.18%，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

2.2 煙嘧磺隆對(duì)甜玉米三羧酸途徑的影響

2.2.1 煙嘧磺隆對(duì)甜玉米中蘋果酸含量的影響 由圖6可知，2個(gè)自交系的MDH含量均在噴藥后 1 d 達(dá)到最大值，隨后呈下降趨勢(shì)，并且HK320的下降速率更大。在煙嘧磺隆脅迫處理1、3、5、7 d后，HK301的MDH含量分別較對(duì)照(HK301-CK)增加了67.06%、44.35%、28.02%、14.77%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。除噴藥后1 d，噴藥后3、5、7 d，HK320的MDH含量分別較對(duì)照(HK320-CK)顯著減少22.89%、53.41%、71.08%。噴藥后HK301、HK320的MDH含量呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，但HK301分別比HK320高28.24%、56.79%、66.61%、73.72%，差異顯著。

2.2.2 煙嘧磺隆對(duì)甜玉米中草酰乙酸含量的影響 由圖7可知，隨著噴藥天數(shù)的增加，2個(gè)自交系的OAA含量呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。煙嘧磺隆脅迫處理顯著增加了HK301的OAA含量，并且在脅迫后 1 d 達(dá)到最大值。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3、5、7 d后，HK301的OAA含量分別較對(duì)照(HK301-CK)增加了40.74%、38.46%、37.50%、36.00%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。在煙嘧磺隆脅迫處理下，HK320的OAA含量呈先上升后逐漸下降的趨勢(shì)。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3、5 d后，HK320的OAA含量分別較對(duì)照(HK320-CK)增加了24.99%、30.04%、15.61%，用煙嘧磺隆脅迫處理7 d后，HK320的OAA含量比對(duì)照(HK320-CK)低12.11%，并且差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。對(duì)比2個(gè)自交系的OAA含量可知，在噴藥后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，HK301的OAA含量分別比HK320高18.76%、16.01%、21.50%、47.60%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

2.2.3 煙嘧磺隆對(duì)甜玉米中檸檬酸含量的影響 由圖8可知，在煙嘧磺隆脅迫處理下，隨著時(shí)間的增加，HK301的CA含量呈先下降后上升的趨勢(shì)，并且在脅迫后1 d達(dá)到最小值。在煙嘧磺隆脅迫處理 1 d 后，CA含量比對(duì)照(HK301-CK)低41.49%，并且差異顯著；用煙嘧磺隆脅迫處理7 d后，HK301的CA含量比對(duì)照(HK301-CK)高43%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。在煙嘧磺隆脅迫處理下，HK320的CA含量呈持續(xù)上升的趨勢(shì)。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3、5、7 d后，HK320的CA含量分別較對(duì)照(HK320-CK)增加了58.73%、35.78%、44.52%、43.79%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。用煙嘧磺隆脅迫處理7 d后，HK301的CA含量比HK320高34.53%，并且差異顯著。

2.2.4 煙嘧磺隆對(duì)甜玉米三磷酸腺苷的影響 由圖9可知，用煙嘧磺隆處理后，HK301的ATP含量呈先上升后緩慢下降的趨勢(shì)。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3 d后，HK301的ATP含量分別較對(duì)照(HK301-CK)增加了36.87%、58.00%，并且差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。用煙嘧磺隆脅迫處理5、7 d后，HK301的ATP含量與對(duì)照(HK301-CK)相比未有顯著改變。用煙嘧磺隆處理后，HK320的ATP含量在煙嘧磺隆脅迫處理1、3 d后呈上升趨勢(shì)，但HK320的ATP含量與對(duì)照間無(wú)顯著差異，用煙嘧磺隆脅迫處理5、7 d后，HK320的ATP含量突然下降，與對(duì)照(HK320-CK)的ATP含量相比，分別顯著減少57.45%、63.67%。用煙嘧磺隆脅迫后的1、3、5、7 d，2個(gè)自交系的ATP含量都有下降趨勢(shì)，并且HK301的ATP含量分別比HK320高36.16%、23.66%、76.23%、72.57%。

3 討論與結(jié)論

筆者的前期研究結(jié)果表明，在煙嘧磺隆脅迫下，相較于耐藥性甜玉米自交系HK301，敏感性甜玉米自交系HK320的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度顯著下降，說(shuō)明煙嘧磺隆脅迫會(huì)影響玉米的光合特性，進(jìn)而導(dǎo)致其物質(zhì)積累和呼吸速率發(fā)生變化[25]。本研究從糖酵解和TCA途徑的角度進(jìn)一步探討煙嘧磺隆脅迫對(duì)甜玉米自交系呼吸代謝、物質(zhì)消耗的影響，解析甜玉米對(duì)煙嘧磺隆的耐藥性。

糖酵解途徑存在于生物體內(nèi)，可為生命活動(dòng)提供能量[26]。HK是糖酵解途徑的限速酶，是六碳糖進(jìn)入糖酵解途徑的關(guān)鍵酶[27-28]。GLU通過(guò)HK形成6PG，隨后6PG經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)形成PA[29]。本研究結(jié)果表明，相較于耐藥性自交系HK301，HK320的GLU和6PG含量顯著升高，HK的活性顯著增強(qiáng)。說(shuō)明受到煙嘧磺隆危害時(shí)，植物體內(nèi)可能需要消耗更多糖分物質(zhì)為機(jī)體提供能量，因此對(duì)煙嘧磺隆越敏感的品種，其糖類物質(zhì)含量升高得越快。謝美華等研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下玉米幼苗葉片的可溶性糖含量隨著脅迫天數(shù)的增加而增加[30]。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，即PEPC在PEPC酶作用下形成OAA[31]。本研究結(jié)果表明，在煙嘧磺隆脅迫下，相較于HK301，HK320的PEPC活性顯著降低，表明煙嘧磺隆脅迫會(huì)影響植物糖酵解的最終產(chǎn)物含量。郭書奎等研究發(fā)現(xiàn)，在NaCl脅迫下，玉米幼苗的PEPC活性顯著降低[32]。在煙嘧磺隆脅迫下，敏感性甜玉米PEPC活性的降低可能導(dǎo)致糖酵解途徑物質(zhì)積累過(guò)多。

TCA途徑是在有氧條件下，EMP的最終產(chǎn)物PA進(jìn)入線粒體，形成CO2、H2O的過(guò)程[33]。MDH酶是TCA途徑的關(guān)鍵酶，它催化蘋果酸脫氫生成OAA、NADH，是TCA途徑反應(yīng)的最后一步，可以反映TCA途徑的活化程度[34-35]。本研究結(jié)果表明，在煙嘧磺隆脅迫下，2種自交系甜玉米中敏感性HK320的MDH含量隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著降低。任淑娟的研究發(fā)現(xiàn)，MDH活性較高，表明有氧呼吸作用強(qiáng)，植物體內(nèi)各種代謝活動(dòng)旺盛[36]。由此可見(jiàn)，2種自交系甜玉米的TCA途徑的活化程度受到除草劑影響且呈下降趨勢(shì)。本研究結(jié)果表明，在煙嘧磺隆脅迫下，HK301、HK320與對(duì)照(HK301-CK和HK320-CK)相比OAA、CA含量顯著升高。黃愛(ài)纓等研究發(fā)現(xiàn)，在低磷脅迫下，玉米自交系苗期根部的OAA、CA含量顯著增多[37]。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。Samanta等研究發(fā)現(xiàn)，水稻在砷脅迫下呼吸代謝代表性有機(jī)酸和酶受到調(diào)節(jié)[38]。在煙嘧磺隆脅迫下，相較于HK301，HK320的ATP含量顯著降低。段乃彬等研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，玉米種子的ATP含量明顯降低[39]。由此可見(jiàn)，苗后除草劑會(huì)影響甜玉米的TCA途徑的正常代謝速率，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)減緩，甚至死亡。

在煙嘧磺隆脅迫下，相較于耐藥性自交系HK301，敏感性自交系HK320的糖類物質(zhì)(GLU、6PG)積累加快，呼吸代謝的關(guān)鍵物質(zhì)(PA、OAA、MDH、CA、ATP)含量及關(guān)鍵酶(PEPC)活性顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，煙嘧磺隆脅迫影響不同耐藥性甜玉米的糖代謝程度。本研究結(jié)果將為解決煙嘧磺隆除草劑對(duì)甜玉米的糖代謝途徑的毒害作用、提高甜玉米對(duì)煙嘧磺隆耐藥性提供理論依據(jù)。