一株產(chǎn)木聚糖酶的蠟樣芽孢桿菌對(duì)雪茄煙葉成分及發(fā)酵產(chǎn)物的影響

李志豪 張鴿 貊志杰 鄧帥軍 李佳軼 張海波 劉曉暉劉好寶1，

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，青島 266109；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所 煙草生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；3. 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所 生物能源研究室，青島 266101；4. 深圳煙草工業(yè)有限責(zé)任公司，深圳 518000）

雪茄外包皮煙葉是一支雪茄的精華部分，優(yōu)質(zhì)的雪茄外包皮煙葉要求葉片較薄、葉脈較細(xì)、韌性較強(qiáng)、顏色均勻有光澤［1］，其中葉脈粗細(xì)是衡量雪茄外包皮煙葉品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。近些年我國(guó)國(guó)產(chǎn)雪茄煙的銷量逐年升高，但我國(guó)上等雪茄煙葉嚴(yán)重匱乏，尤其是優(yōu)質(zhì)雪茄外包皮煙葉絕大部分依賴于進(jìn)口［2］。國(guó)產(chǎn)雪茄煙葉存在組織致密，柔韌性差，支脈粗大，燃燒性差，香氣水平不足等問(wèn)題，提高國(guó)產(chǎn)雪茄外包皮煙葉品質(zhì)能極大降低我國(guó)雪茄煙生產(chǎn)成本［3］。雪茄外包皮煙葉作為高價(jià)值產(chǎn)品，支脈較粗會(huì)嚴(yán)重影響雪茄外包皮煙葉的外觀進(jìn)而影響銷售價(jià)格；且葉脈和葉肉結(jié)構(gòu)組成有差異，雪茄外包皮煙葉中葉脈含量較高會(huì)導(dǎo)致煙葉燃燒不均勻。因此，降低雪茄外包皮煙葉的葉脈含量，改善雪茄外包皮煙葉的品質(zhì)，成為雪茄外包皮煙葉研究的熱點(diǎn)。

研究表明，煙葉中細(xì)胞壁物質(zhì)含量對(duì)雪茄外包皮煙葉物理性狀影響較大［4］。煙葉的纖維素、半纖維素含量與煙葉等級(jí)有一定相關(guān)性，纖維素與半纖維素含量一般隨等級(jí)增高而降低［5］。也有研究指出：纖維素、半纖維素等含量較高，致使低等級(jí)煙葉刺激性較強(qiáng)、青雜氣重、吸味辛辣、澀口，并使煙葉的香氣不能顯露［6］。且相對(duì)于葉片，葉脈中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素等細(xì)胞壁物質(zhì)含量較高［7］，通過(guò)常規(guī)的物理化學(xué)方法較難去除［8］。目前對(duì)木質(zhì)纖維素降解的研究多集中在菌株利用及降解的方式，且研究熱點(diǎn)主要集中在纖維素和木質(zhì)素降解菌的篩選及研究中［9］，對(duì)半纖維素降解菌的研究較少［10］。葉脈細(xì)胞中含有相對(duì)較多的半纖維素，且木聚糖是半纖維素中含量最豐富的聚合物，可以通過(guò)木聚糖酶對(duì)其進(jìn)行降解［11］。利用微生物對(duì)雪茄外包皮煙葉進(jìn)行發(fā)酵，是定向提升雪茄外包皮煙葉品質(zhì)的重要途徑。

芽孢桿菌屬（Bacillus）是目前雪茄煙葉發(fā)酵過(guò)程中的主要菌屬［12］，也是主要的木聚糖酶產(chǎn)生菌之一。它能夠通過(guò)分泌木聚糖酶使大分子化合物半纖維素等降解為小分子物質(zhì)［13］。木聚糖酶被廣泛應(yīng)用于紡織、造紙、食品、飼料等行業(yè)［14］，目前利用木聚糖酶改善雪茄外包皮煙葉品質(zhì)的研究鮮有涉及。鑒于此，本研究利用前期篩選的一株蠟樣芽孢桿菌，對(duì)菌株的煙堿耐受性做了檢測(cè)，隨后利用液態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)確定菌株利用雪茄煙葉產(chǎn)木聚糖酶的最佳發(fā)酵條件，并在最佳條件下測(cè)定菌株對(duì)煙葉中半纖維素的降解效果，最后分析比較了菌株對(duì)煙葉香氣物質(zhì)成分的影響。本研究期望能改善雪茄煙葉品質(zhì)，為利用微生物及酶等生物技術(shù)手段改善雪茄煙葉品質(zhì)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 雪茄外包皮煙葉上分離的蠟樣胞桿菌Bacillus cereusL-1（GenBank收錄號(hào)：MW570877），保藏于中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所系統(tǒng)微生物工程實(shí)驗(yàn)室，該菌株經(jīng)培養(yǎng)能產(chǎn)生木聚糖酶，可用于雪茄外包皮煙葉的發(fā)酵。

1.1.2 煙葉 實(shí)驗(yàn)煙葉在取自于中國(guó)煙草總公司海南省局?？谘┣阉筒h雪茄發(fā)酵基地的D1品種中部葉，保存在中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所系統(tǒng)微生物工程實(shí)驗(yàn)室，-20℃冰箱內(nèi)。1.1.3 培養(yǎng)基 煙葉發(fā)酵培養(yǎng)基：K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，（NH4）2SO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，酵母粉 5.0 g，雪茄外包皮煙葉粉末 20.0 g，加水定容至1 L，115℃滅菌30 min。LB培養(yǎng)基：10.0 g胰蛋白胨，10.0 g NaCl，5.0 g酵母粉，加入去離子水定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 隨機(jī)抽取部分樣品，除去煙葉主脈，將煙葉放入不高于40℃±2℃的烘箱中烘至恒重。從烘箱中取出烘好的樣品粉碎，過(guò)40目篩，充分搖動(dòng)，混勻。此即為制備好的試樣。

1.2.2 菌株對(duì)煙堿耐受性檢測(cè) 測(cè)定該菌株對(duì)尼古丁的耐受性，將菌株置于含有尼古丁的液體LB培養(yǎng)基中，在含有50 mL培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，按照3%（V/V）接種量進(jìn)行接種，培養(yǎng)基中尼古丁的濃度分別為0、0.5、1.0、2.0 g/L，以0 g/L為對(duì)照，37℃，180 r/min培養(yǎng)，每間隔2 h檢測(cè)培養(yǎng)液在600 nm處的吸光度值，通過(guò)菌株生長(zhǎng)狀況反應(yīng)菌株對(duì)尼古丁的耐受情況。每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.3 煙葉培養(yǎng)基發(fā)酵條件優(yōu)化 研究菌株利用煙葉發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的最佳發(fā)酵條件為后期菌株在雪茄煙葉發(fā)酵中的應(yīng)用具有重要的參考價(jià)值。確定菌株利用雪茄煙葉發(fā)酵的最適發(fā)酵周期，為后期發(fā)酵做指導(dǎo)。將保藏的菌株接入LB液體試管培養(yǎng)基中活化，搖床培養(yǎng)6-8 h獲得種子液，然后轉(zhuǎn)接至含100mL液體LB培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)8 h獲得二級(jí)種子液，然后轉(zhuǎn)接于含100 mL煙葉發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，接種量5%（V/V），底物濃度15 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)，每隔6 h 進(jìn)行取樣，直到培養(yǎng)48 h。按照何敏超［15］的方法測(cè)得木聚糖酶酶活，繪制產(chǎn)酶曲線。每組設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)。

培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株產(chǎn)木聚糖酶的影響：利用氯化氫和氫氧化鈉溶液分別調(diào)整培養(yǎng)基中的初始pH值為5、6、7、8，以及自然pH，115℃滅菌30 min。將菌株置于37℃，200 r/min培養(yǎng)24 h，接種量5%。每次試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)。

不同的接種量對(duì)菌株產(chǎn)木聚糖酶的影響：在最佳煙葉粉末濃度以及最佳初始pH條件下，將二級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%。將菌株置于37℃，200 r/min培養(yǎng)24 h。每次試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)。

培養(yǎng)基中最適底物濃度確定：設(shè)定培養(yǎng)基中雪茄煙葉粉末分別為5，10，15，20，25 g/L，測(cè)定菌株產(chǎn)木聚糖酶的情況。將菌株置于37℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，接種量5%。每次試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 雪茄煙葉木質(zhì)纖維素含量的測(cè)量 以無(wú)菌液接種作為空白對(duì)照（CK），原始煙葉粉末作為初始對(duì)照，將培養(yǎng)獲得的樣品分別轉(zhuǎn)移至500 mL 離心杯中，并以5 000 r/min離心20 min。取沉淀，在40℃烘箱中持續(xù)烘干直至恒重。烘干后的樣品以及對(duì)照按照采用美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL）的檢測(cè)方法［16］檢測(cè)木質(zhì)素，纖維素，半纖維素含量，并進(jìn)行分析。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè) 將制得的樣品以及對(duì)照，按照文獻(xiàn)中的方法［17］進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)物的檢測(cè)。定性采用NIST08.L 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索。

2 結(jié)果

2.1 菌株對(duì)煙堿耐受性

在本研究中，我們探索了菌株在含有500-2 000 mg/L的尼古丁的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況（圖1）。結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中煙堿含量在1.0 g/L及以下時(shí)，菌株生長(zhǎng)與對(duì)照相比無(wú)較大差異，其生長(zhǎng)基本不受該濃度下煙堿的抑制，該含量大于煙葉中尼古丁的含量；當(dāng)培養(yǎng)基中尼古丁含量為2.0 g/L時(shí)，菌株的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。

圖1 菌株對(duì)煙堿的耐受性結(jié)果Fig. 1 Tolerance of the strain to nicotine

2.2 菌株發(fā)酵產(chǎn)酶周期曲線

以D1煙葉粉末為碳源，對(duì)蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusL-1進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液中的木聚糖酶酶活，以了解其在發(fā)酵體系中酶活的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。其木聚糖酶酶活變化曲線如圖2所示，6-12 h木聚糖酶酶活緩慢增大，12-18 h酶活速率加快，在24 h時(shí)酶活效率達(dá)到最大，24 h之后酶活速率緩慢下降。該結(jié)果指導(dǎo)后期酶活測(cè)定發(fā)酵周期可以控制在24 h，以便獲得較大的酶活。

圖2 菌株發(fā)酵產(chǎn)酶曲線Fig. 2 Curve of enzyme production by the fermentation of the strain

培養(yǎng)基中初始pH對(duì)菌株利用雪茄煙葉產(chǎn)木聚糖酶的影響如圖3所示，在自然pH時(shí)（6.7），酶活效率最高；當(dāng)pH過(guò)大或過(guò)小時(shí)，菌株產(chǎn)木聚糖酶的活性都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。由圖4 可知，當(dāng)接種量小于5%時(shí)，隨接種量的增大，酶活效率在增加；接種量為5%時(shí)，酶活效率最高達(dá)到（3.81±0.61）U/mL；過(guò)度增加接種量，酶活減小，可能是菌株之間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)增加。培養(yǎng)基中雪茄煙葉粉末是菌株發(fā)酵中重要的碳源，其濃度對(duì)菌株產(chǎn)木聚糖酶的影響結(jié)果如圖5所示。培養(yǎng)基中底物濃度為20 g/L濃度時(shí)，木聚糖酶活性可達(dá)（4.04±0.18）U/mL，明顯高于其余處理；但過(guò)大提高培養(yǎng)基中煙葉粉末的濃度，木聚糖酶活性不再增加。

圖3 初始培養(yǎng)基pH對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig. 3 Influence of initial medium pH on the enzyme production of the strain

圖4 接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig. 4 Influence of inoculation amount on the enzyme production of the strain

圖5 培養(yǎng)基中煙葉濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig. 5 Influence of cigar leaves concentration in medium on the enzyme production of the strain

2.3 煙葉木質(zhì)纖維素含量變化

蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusL-1在以初始pH 6.7、5%接種量、底物濃度20 g/L的條件下發(fā)酵24h，雪茄外包皮煙葉中的木質(zhì)纖維素成分含量及變化結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，由菌發(fā)酵處理的煙葉粉末與不加菌液的對(duì)照相比，半纖維素的含量由3.62%降為3.38%，減少了6.63%；纖維素含量則有更明顯的減少，由11.48%降為10.54%，減少了8.19%。木質(zhì)素含量在菌處理和對(duì)照以及原始煙葉成分中含量差異性不顯著。該結(jié)果表明菌株不僅在雪茄煙葉的半纖維素降解中發(fā)揮作用，而且對(duì)纖維素降解也具有較明顯的效果。

圖6 菌株發(fā)酵對(duì)雪茄煙葉中木質(zhì)纖維素成分的影響Fig. 6 Effects of strain fermentation on the lignocellulose content in cigar leaves

2.4 煙葉發(fā)酵產(chǎn)物變化

雪茄外包皮煙葉中致香物質(zhì)種類繁多，對(duì)煙葉的香型、香氣質(zhì)、香氣量有不同的影響。經(jīng)GC/MS定性分析，共檢測(cè)出87種化合物。經(jīng)與譜庫(kù)檢索及分析，主要的物質(zhì)有肉豆蔻醛、棕櫚酸、法尼基丙酮、葉綠醇、油酸、正二十六烷、正二十七烷、正三十一烷等。相較于原始煙葉，菌處理煙葉肉豆蔻醛和法尼基丙酮含量有所減少，葉綠醇含量增加，油酸含量增加。廣泛存在于烤煙煙葉、白肋煙煙葉、香料煙煙葉以及煙氣中的正二十六烷和正三十一烷均有所增加，正二十七烷含量減少。菌處理與對(duì)照相比，棕櫚酸的含量減少較多，葉綠醇和油酸含量均增加。正二十六烷、正二十七烷和正三十一烷對(duì)照組和原始煙葉含量相差較小。因此可知菌處理可明顯提升雪茄煙葉中葉綠醇、油酸、正二十六烷和正三十一烷（表1）。

表1 煙葉發(fā)酵產(chǎn)物含量變化Table 1 Changes in contents of the fermentation products in cigar leaves

3 討論

尼古丁具有細(xì)胞毒性，對(duì)多數(shù)微生物具有抑制作用［18］。探索菌株對(duì)尼古丁的耐受情況，為后期菌株在煙葉發(fā)酵中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)［19］。煙草葉片中尼古丁的平均含量達(dá)22 000 mg/kg左右［20］，在發(fā)酵培養(yǎng)基中相當(dāng)于880 mg/L。在本研究中，測(cè)定1 000 mg/L尼古丁含量與無(wú)煙堿對(duì)照組相比菌株生長(zhǎng)不受影響，該菌株在后期煙葉發(fā)酵中能發(fā)揮作用。

研究表明煙葉纖維素及半纖維含量過(guò)高，煙葉組織則粗糙且易碎，同時(shí)燃燒后產(chǎn)生的煙氣粗糙，易產(chǎn)生令人不愉快的氣味［21］。因此，在一定范圍內(nèi)減少纖維素和半纖維素的含量，有助于提升雪茄外包皮煙葉品質(zhì)。目前煙葉發(fā)酵中，針對(duì)纖維素的降解主要集中在烤煙等的研究中，如王煒等［22］篩選一株降解纖維素菌株，作用于煙葉時(shí)，可使煙葉纖維素最高降解率為8.94%；楊宗燦等［9］針對(duì)降解纖維素篩選到一株枯草芽孢桿菌，降解率可達(dá)30.6%。關(guān)于雪茄煙葉中半纖維素降解菌的篩選及利用目前鮮有報(bào)道，本研究篩選的菌株不僅在半纖維素降解中發(fā)揮一定作用，同時(shí)還可以降低煙葉中的纖維素含量，對(duì)后期煙葉發(fā)酵中含碳物質(zhì)的降解發(fā)揮一定作用，期望后期能用于改善雪茄外包皮煙葉的韌性，進(jìn)一步改善外包皮煙葉燃燒性，提升外包皮煙葉品質(zhì)。后期如果復(fù)配其他菌劑用于雪茄外包皮煙葉的葉脈發(fā)酵處理中，期望能更好改善葉脈較粗的情況。

肉豆蔻醛具有脂肪香、牛奶香、奶油香、果香等，常用于日用香精中。葉綠醇和葉綠素在煙葉調(diào)制過(guò)程中可降解為新植二烯，新植二烯是一種重要的致香物質(zhì)［23］。油酸是煙草中常見的一種高級(jí)脂肪酸［24］。烷烴是煙葉表面蠟質(zhì)的主要成分，煙草中含量較多的烷烴多集中在二十五碳至三十五碳之間，占煙葉烷烴總質(zhì)量的95%［25］。Oliveira等［26］發(fā)現(xiàn)植物表面正構(gòu)烷烴是非常好的減弱水損失的屏障，也有研究［27］指出加入烷烴類化合物對(duì)煙絲有較為明顯的保潤(rùn)效果。因此推測(cè)烷烴含量的提高可能對(duì)提升雪茄外包皮煙葉的保潤(rùn)作用具有一定效果。李寧等［28］研究也證明芽孢桿菌在雪茄煙葉發(fā)酵過(guò)程中明顯改善煙葉勁頭、明顯降低刺激性、減少雜氣、提升香氣，提高煙葉的整體品質(zhì)。

本研究中的蠟樣芽胞桿菌對(duì)雪茄煙葉中半纖維素及纖維素降解具有一定作用，后期可應(yīng)用于雪茄外包皮煙葉的固態(tài)發(fā)酵研究，對(duì)改善雪茄外包皮煙葉物理特性提供理論指導(dǎo)，有望在雪茄煙葉發(fā)酵提質(zhì)增香中發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

本研究以蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusL-1發(fā)酵雪茄煙葉，確定了B. cereusL-1降解雪茄煙葉的最適發(fā)酵條件：在初始pH 6.7，5%接種量，20 g/L的底物濃度下發(fā)酵24 h，最高酶活可達(dá)（4.04±0.18）U/mL。在該發(fā)酵條件下，雪茄煙葉中半纖維素含量為3.38%，降低了6.63%，纖維素含量為10.54%，降低了8.19%，同時(shí)降低了煙葉中纖維素和半纖維素的含量；對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物分析比較發(fā)現(xiàn)，香氣物質(zhì)葉綠醇、油酸、正二十六烷和正三十一烷有較大提升。