菱角殼黃酮類化合物的提取工藝優(yōu)化及抑菌活性研究

鄧麗娜 張疏璇 鄭清 張楷歆

摘 要：采用乙醇提取法對菱角殼中黃酮類化合物進(jìn)行提取，以黃酮類化合物提取率作為指標(biāo)，經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)獲得菱角殼中黃酮類化合物提取的最佳工藝。結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，液料比1∶20，提取溫度70℃，提取時(shí)間85min時(shí)，提取率為3.78%。抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菱角殼中黃酮類化合物提取物對尖孢鐮刀菌、禾谷鐮孢菌、灰葡萄孢菌病原菌的菌絲生長均有抑制效果，對灰葡萄孢菌、尖孢鐮刀菌、禾谷鐮孢菌菌絲生長的抑制率分別達(dá)到29.41%、23.52%、29.41%。

關(guān)鍵詞：菱角殼;黃酮類化合物;抑菌活性

中圖分類號 R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 B 文章編號 1007-7731（2022）03-0108-04

Abstract： The flavonoids in Trapa bispinosa Roxb. shell were extracted by ethanol. The flavonoid content was used as the index to obtain the optimum extraction technology of flavonoids in Trapa bispinosa Roxb. shell. The results of orthogonal experiment showed that the extraction rate of total flavonoids reached 3.78% when the concentration of ethanol was 65%， the ratio of material to liquid was 1：20， extraction conditions was 70℃ and the extraction time was 85 min. Through antifungal test， it was found that the flavonoids in Trapa bispinosa Roxb. shell had inhibitory effect on hyphal growth of Botrytis cinerea， Fusarium graminearum， Fusarium oxysporum. It was found that the inhibition rate of hyphal growth of Botrytis cinerea， Fusarium oxysporum and Fusarium graminis reached 29.41%， 23.52% and 29.41%， respectively.

Key words： Trapa bispinosa Roxb.shell; Flavonoids; Antifungal activity

1 引言

菱角（Trapa bispinosa Roxb）為一年生草本水生植物，又名腰菱，菱實(shí)，水栗[1]。菱角皮脆肉美且含有豐富的營養(yǎng)成分，但是食用果實(shí)后剩余的菱角殼被大量丟棄，對環(huán)境造成了一定的負(fù)面影響[2]。據(jù)報(bào)道，目前研究者已從菱角殼中提取出多種天然活性成分，有甾醇類、黃酮類、生物堿類、多糖類等，研究證實(shí)它們均具有一定的藥理作用[3-6]。現(xiàn)對菱角殼的研究多為其活性成分提取以及藥理作用方面的研究，而對其在抑菌方面的研究相對較少。

植物病害是造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)作物損失的重要原因之一，而真菌是引起各類植物病害的重要病原物之一。目前為了提高作物生產(chǎn)力和質(zhì)量，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)依然無法擺脫對化肥和農(nóng)藥的依賴。近年來的研究表明，天然黃酮類物質(zhì)能提高植物對病毒、真菌、細(xì)菌、線蟲等抗性[7-8]。隨著人們環(huán)保意識和食品安全意識的提升，人們對安全、有效的農(nóng)藥替代品需求日益增加，而植物源抑菌農(nóng)藥已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)[7]。本實(shí)驗(yàn)擬以菱角殼為材料，通過單因素和正交試驗(yàn)對菱角殼中黃酮類化合物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并研究黃酮類化合物提取物對幾種植物病原菌的抗菌活性，為菱角殼資源的合理利用提供理論依據(jù)，同時(shí)為發(fā)現(xiàn)植物源殺菌劑提供線索，以期對有害生物的防治發(fā)揮重要作用。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料 菱角，采自鹽城市董大水生蔬菜專業(yè)合作社。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，亞硝酸鈉，硝酸鋁，無水乙醇，氫氧化鈉，土豆，葡萄糖，純化瓊脂，灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum），尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）等。粉碎機(jī)，干燥箱，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，可見分光光度計(jì)，水浴加熱鍋、超聲破碎儀、高壓蒸汽滅菌鍋、電熱爐、移液槍、菌片打孔器等。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 樣品的制備 取一定量的菱角殼，放入60℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，用萬能粉碎機(jī)粉碎后過50目篩，將菱角殼粉分別裝入干燥器保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法[9]，按照上海源葉生物有限公司提供的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確稱取37.5mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于30mL容量瓶中，用無水乙醇定容。分別吸取該蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0置于25mL的容量瓶中，各容量瓶中加入乙醇至12.5mL，再分別加入5%NaNO2水溶液0.7mL，搖勻后靜置5min;加入10%Al（NO3）3溶液0.7mL，搖勻，靜置6min;再分別加入lmol/L NaOH水溶液5mL，加入無水乙醇至25mL，靜置10min后于可見分光光度計(jì)510nm處測量吸光度。得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.8664X+0.0036（R2=0.99），蘆丁在0.05～0.35mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 測定指標(biāo) 采用傳統(tǒng)的乙醇提取法提取菱角殼中黃酮類化合物[9]，通過單因素試驗(yàn)初步確定料液比、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)4因素水平。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算菱角殼中黃酮類化合物的濃度，根據(jù)公式（1）計(jì)算樣品中黃酮類化合物提取率[9]。

樣品中黃酮類化合物提取率%=C×V/W×103×100 （1）

其中C：黃酮類化合物濃度，mg/mL;V：樣液總體積，mL;W：菱角殼粉的質(zhì)量，g。

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別選擇料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）這4個(gè)因素，設(shè)計(jì)適宜范圍內(nèi)的3個(gè)不同水平，如表1所示L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.2.4 抑菌試驗(yàn) 抑菌活性測定采用抑制菌絲生長速率法[10]，取黃酮類化合物提取液1mL涂布于PDA培養(yǎng)基上，以無菌水涂布為空白對照，分別接種3mm的灰葡萄孢菌、禾谷鐮孢菌、尖孢鐮孢菌的菌片進(jìn)行培養(yǎng)，將各平板倒置放入26～28℃恒溫培養(yǎng)箱中觀察其生長情況。根據(jù)公式（2）、（3）測定抑菌活性。

病原菌菌落直徑=測量直徑平均值-3mm （2）

抑菌率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照組菌落直徑×100 （3）

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 料液比對菱角殼黃酮類化合物提取率的影響 由圖1可知，料液比在1∶15～1∶25（g：mL）的范圍時(shí)，黃酮類化合物提取率逐漸增加;當(dāng)料液比達(dá)到1∶25（g：mL）時(shí)，黃酮類化合物提取率達(dá)到2.71%，當(dāng)料液比繼續(xù)增大時(shí)，黃酮類化合物提取率趨于穩(wěn)定，分析原因可能是當(dāng)物料比達(dá)到1∶25時(shí)，黃酮類化合物已經(jīng)基本溶出，達(dá)到最大溶解量。由此選取最佳料液比為1∶25（g：mL）。

3.1.2 乙醇提取分?jǐn)?shù)比對菱角殼黃酮類化合物提取率的影響 由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，黃酮類化合物提取率先增高后降低;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，黃酮類化合物的提取率達(dá)到3.33%;隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，黃酮提取率反而降低。分析可能是部分黃酮類化合物是水溶性的，過高濃度的乙醇影響水溶性黃酮類化合物的溶解。因此選取最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

3.1.3 提取溫度比對菱角殼黃酮類化合物提取率的影響 由圖3可知，隨著提取溫度的升高，黃酮類化合物粗提物的提取率呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢;當(dāng)提取溫度達(dá)到75℃時(shí)，黃酮類化合物提取率達(dá)到3.20%;隨著提取溫度繼續(xù)升高，黃酮類化合物提取率出現(xiàn)了降低的趨勢，原因可能是當(dāng)溫度過高易破壞了一些黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致菱角殼的黃酮類化合物提取率降低。因此選取最佳提取溫度為75℃。

3.1.4 提取時(shí)間比對菱角殼黃酮類化合物提取率的影響 由圖4可知，在70～80min范圍內(nèi)隨著提取時(shí)間的增加，黃酮類化合物的提取率提高，提取時(shí)間為80min時(shí)提取率達(dá)到2.54%;當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，黃酮提取率出現(xiàn)下降趨勢。其原因可能是隨著提取時(shí)間延長，黃酮的穩(wěn)定性降低，雜質(zhì)易析出，導(dǎo)致提取率降低。因此選取最佳提取時(shí)間為80min。

3.2 正交試驗(yàn) 通過正交試驗(yàn)分析可知（表2），各因素對菱角殼黃酮類化合物提取率的影響大小依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）>液料比（A）>提取溫度（C）>提取時(shí)間（D）。最優(yōu)提取條件為B1A2C1D3，即提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，液料比1∶20，提取溫度70℃，提取時(shí)間85min時(shí)，黃酮類化合物的提取率最高。為進(jìn)一步考察上述優(yōu)選工藝的穩(wěn)定性，采用上述的最佳提取條件，取3份質(zhì)量為5.000g的菱角殼粉樣品，進(jìn)行乙醇提取法并計(jì)算黃酮類化合物提取率。得到總黃酮的平均提取率為3.78%。

3.3 抑菌試驗(yàn)結(jié)果 以無菌水涂布為空白對照，發(fā)現(xiàn)菱角殼提取的黃酮類化合物對灰葡萄孢、禾谷鐮孢菌和尖孢鐮刀菌的菌絲生長均表現(xiàn)出不同程度的抑制（表3）。當(dāng)空白對照組的3種菌落的菌絲長滿平板時(shí)，觀察可發(fā)現(xiàn)菱角殼中黃酮類化合物提取物對灰葡萄孢菌和尖孢鐮刀菌抑制效果較好（圖3-5）。由菌絲生長抑制率測定值可知，菱角殼提取出的黃酮類化合物對灰葡萄孢菌和尖孢鐮刀菌抑制率均達(dá)到29.41%，對禾谷鐮孢菌抑制率為23.52%。

4 結(jié)論

以菱角殼黃酮類化合物的提取率為考察指標(biāo)，優(yōu)化最佳的提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，液料比1∶20，提取溫度70℃，提取時(shí)間85min，得到黃酮類化合物的提取率為3.78%。已有文獻(xiàn)表明菱角殼的提取物具有一定的抑菌活性[11-12]，而本試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)菱角殼的黃酮類化合物對3種植物病原真菌有一定的抑制效果，對灰葡萄孢菌和尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制率均達(dá)到29.41%，而其中的抑菌活性成分的分離純化、田間藥效、作用機(jī)理等尚待深入探討。本研究結(jié)果表明，菱角殼中黃酮類化合物物質(zhì)是潛在的天然植物抑菌劑，可為植物病原菌抑菌劑的研發(fā)提供理論依據(jù)，對生物防治起到推進(jìn)作用。

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（責(zé)編：王慧晴）

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