染色體外環(huán)形DNA研究進(jìn)展及其在畜禽育種中的應(yīng)用

曹修凱 王珊 葛玲 張衛(wèi)博 孫偉，

（1. 揚(yáng)州大學(xué)教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際聯(lián)合研究實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州225009；2. 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009）

過(guò)去人們認(rèn)為遺傳變異和可變多樣連接重組（V（D）J recombination）是造成同一個(gè)體不同組織或相同組織不同細(xì)胞間基因組DNA異質(zhì)性的主要原因。而最近研究表明從基因組上脫離形成的環(huán)形DNA是基因組DNA異質(zhì)性的重要來(lái)源，在基因組進(jìn)化和環(huán)境適應(yīng)性等方面具有重要意義。染色體外環(huán)形DNA（extrachromosomal circular DNA，eccDNA）指來(lái)源于基因組DNA并游離于染色體之外的雙鏈環(huán)狀DNA分子，它在真核生物中普遍存在，如酵母、線蟲(chóng)、果蠅、植物、哺乳動(dòng)物等，通常攜帶部分或完整的基因以及功能元件，通過(guò)特殊的方式參與機(jī)體衰老、耐藥性、腫瘤等的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。

我國(guó)動(dòng)物育種正處在現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)育種手段相結(jié)合的階段，而分子標(biāo)記的鑒定對(duì)畜禽早期選種具有重要意義。最新研究表明作為癌癥研究熱點(diǎn)的eccDNA或許也可用于畜禽標(biāo)記輔助選擇：（1）eccDNA介導(dǎo)KIT基因調(diào)控牛白色背線性狀［1］；（2） 包 含 肌 肉 發(fā) 育 相 關(guān) 基 因 AGRIN 的eccDNA在肉用王鴿肌肉中顯著富集［2］；（3）包含EPSPS基因的eccDNA使長(zhǎng)芒莧對(duì)除草劑產(chǎn)生耐藥性，并且可以穩(wěn)定傳遞到子代［3-4］。但eccDNA與單核苷酸變異（SNP）、插入/缺失（Indel）和拷貝數(shù)變異（CNV）等DNA分子標(biāo)記不同，它存在一定的組織特異性。本文將綜述eccDNA的分類、產(chǎn)生機(jī)制、功能研究及鑒定方法等，并就eccDNA在動(dòng)物育種中的應(yīng)用前景進(jìn)行討論。

1 eccDNA研究歷史

從1869年Friedrich首次鑒定出DNA，到1953年Watson和Crick揭示DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，前后歷經(jīng)85年，人們才確信染色體中的線性雙鏈DNA是遺傳信息的主要載體［5-6］。但基于細(xì)菌基因組環(huán)形DNA的現(xiàn)象，1962年Stahl提出真核生物可能存在染色體環(huán)形DNA分子。1965年，Hotta和Bassel［7］利用電鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)豬精子存在基因組染色體外環(huán)形DNA 分子，長(zhǎng)度在 0.5 μm-16.8 μm（注 ：1 μm ≈3 100 bp［8］），初步證實(shí)了 Stahl的推測(cè)。同年 Cox 等［9］利用光學(xué)顯微鏡在有絲分裂中期的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了游離于基因組染色體之外的數(shù)目眾多、成對(duì)出現(xiàn)和大小不等的染色體（雙微體，doubleminute，DM）。1967年，Radloff等［10］將 Hela細(xì)胞核內(nèi)環(huán)形DNA與線粒體DNA比較分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核內(nèi)環(huán)形DNA長(zhǎng)度在0.2 μm-19.8 μm，而線粒體DNA長(zhǎng)度在（4.81±0.24）μm，前者個(gè)數(shù)占后者的20%左右，這項(xiàng)研究進(jìn)一步證實(shí)了真核細(xì)胞中存在除線粒體之外的環(huán)形DNA。

1972 年 Smith 等［11］將長(zhǎng)度在 0.05 μm-2.0 μm的染色體外環(huán)形DNA定義為小多分散環(huán)狀DNA（small polydisperse circular DNA，spcDNA），并且發(fā)現(xiàn)放線酮處理或細(xì)胞接觸抑制會(huì)使Hela細(xì)胞spcDNA的數(shù)目增加至少10倍以上。深入研究發(fā)現(xiàn)同種細(xì)胞或組織的spcDNA在長(zhǎng)度和個(gè)數(shù)上存在較高異質(zhì)性［12-14］。20世紀(jì)80-90年代，人們利用Sanger雙脫氧鏈終止法、Dot blot、Southern blot和酶切等技術(shù)發(fā)現(xiàn)spcDNA存在大量基因組重復(fù)序列，如 SINE［15-16］、LINE［17］、串聯(lián)重復(fù)序列［18-19］、轉(zhuǎn)座子序列［20］、rDNA 序列［21］和端粒重復(fù)序列［22］等，其中，人染色體外環(huán)形rDNA（extrachromosomal rDNA circle，ERC）長(zhǎng)度在 2 kb-20 kb［23］，人染色體外環(huán)形端粒（telomeric circle，t-circle）長(zhǎng)度在0.7 kb-56.8 kb［24-25］，但有關(guān)非重復(fù)序列型spcDNA的研究報(bào)道很少［26-27］。DM是腫瘤特異的，并且存在完整癌基因序列，如肺癌［28］、軟骨肉瘤［29］、神經(jīng)膠質(zhì)瘤［30-31］、淋巴瘤［32］和骨髓性白血病［33］等，但DM出現(xiàn)的頻率很低：182/200種腫瘤中鑒定出DM；DM陽(yáng)性腫瘤類型的病例檢出比為0.26%-44%；DM陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞水平檢出比例最低為7%［34-36］。因此，科學(xué)家們一度認(rèn)為spcDNA是eccDNA的主要存在形式，并且spcDNA主要是由重復(fù)序列構(gòu)成的。但隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人們開(kāi)始對(duì)eccDNA有了新的認(rèn)識(shí)。2012年，Shibata等［37］在小鼠組織和多種細(xì)胞系中鑒定出大量長(zhǎng)度在200 bp-400 bp的小分子eccDNA，它們主要來(lái)源于5′ UTR、外顯子和CpG島等區(qū)域，并將其命名為microDNA。隨后M?ller等［38］在正常人類肌肉組織和白細(xì)胞中也鑒定出大量microDNA。2017年，Turner等［39］提出染色體外DNA（extrachromosomal DNA，ecDNA）概念，他們發(fā)現(xiàn)在17種癌癥117種腫瘤細(xì)胞系中大約30%的ecDNA是以DM形式存在。之后人們用ecDNA特指腫瘤細(xì)胞中長(zhǎng)度較大（數(shù)百 kb-數(shù)Mb）并且至少包含一個(gè)完整基因的染色體外環(huán)形DNA，而將長(zhǎng)度較小的染色體外環(huán)形DNA用eccDNA（extrachromosomal circular DNA，eccDNA，狹義，筆者劃分為 ＜ 100 kb）表示［40-42］。

值得注意的是在早期研究染色體外環(huán)形DNA時(shí)，人們提出了一些相關(guān)概念，在此筆者做出區(qū)分。1985年，Kinoshita和Kunisada等［43-44］在煙草和小麥中鑒定出cccDNA（covalently closed circular）和spcDNA，隨后認(rèn)為它們是不同分離富集方法下的同一類分子的兩種不同形態(tài)。1987年，Carroll等［45］將CAD基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CAD-/-CHO細(xì)胞系，研究DM的形成機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有些細(xì)胞基因組整合了質(zhì)粒，而有些細(xì)胞存在包含部分質(zhì)粒序列和基因組序列環(huán)形分子（作者命名為episome）。深入研究發(fā)現(xiàn)，刪除的基因組序列環(huán)化形成episome，episome多聚化形成DM，DM又可以重新整合到基因組，因此游離體是DM的前體［46-51］。eccDNA分類如圖1所示。下文除明確指出外，eccDNA指廣義eccDNA。

圖1 eccDNA的分類Fig.1 eccDNA classification

2 eccDNA形成的分子機(jī)制

由上可知，eccDNA在序列長(zhǎng)度和特征上有很大的異質(zhì)性，因此eccDNA的產(chǎn)生可能涉及了不同分子機(jī)制，但這些機(jī)制似乎都與基因組DNA修復(fù)過(guò)程有關(guān)［52］。筆者將這些機(jī)制概括為4大類：同源重組（homologous recombination，HR）、非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）、DNA 復(fù) 制和轉(zhuǎn)錄（圖2），其真實(shí)性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖2 形成eccDNA的潛在機(jī)制Fig.2 Possible mechanisms of forming eccDNA

在DNA雙鏈斷裂的情況下，rDNA和tDNA可通過(guò)loop結(jié)構(gòu)介導(dǎo)HR分別產(chǎn)生ERC和t-circle［53］。Dillon等［54］為了系統(tǒng)研究microDNA的產(chǎn)生機(jī)制，以雞DT40細(xì)胞系為模型，分別敲除NHEJ、HR和MMR關(guān)鍵蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除錯(cuò)配修復(fù)關(guān)鍵基因MSH3后，microDNA數(shù)量減少了81%，證明了microDNA的產(chǎn)生與DNA錯(cuò)配修復(fù)存在密切關(guān)系。此外，microDNA主要來(lái)源于GC富集區(qū)、5′ UTR和外顯子區(qū)，這些區(qū)域在轉(zhuǎn)錄時(shí)極易形成DNA：RNA三鏈結(jié)構(gòu)R-loop，而該結(jié)構(gòu)參與了DNA損傷和修復(fù)過(guò)程，因此R-loop可能與microDNA產(chǎn)生有關(guān)，但這有待進(jìn)一步驗(yàn)證［55］。ODIRA（origin-dependent inverted-repeat amplification）可能也是產(chǎn)生microDNA的機(jī)制之一，由于復(fù)制泡兩端反向短重復(fù)序列的存在，使新生DNA鏈發(fā)生環(huán)化［56］。抑制HR關(guān)鍵基因BRCA1或NHEJ關(guān)鍵基因DNA-PK會(huì)導(dǎo)致含有DHFR基因的ecDNA拷貝數(shù)減少，也可消除結(jié)腸癌MTX（甲胺喋呤）抗性細(xì)胞中的eccDNA，說(shuō)明雙鏈斷裂或大片段的DNA序缺失可通過(guò)HR或NHEJ環(huán)化形成ecDNA［57-58］，包括DM和游離體，游離體可進(jìn)一步多聚化形成更加復(fù)雜的游離體或DM［46，48］。表1列舉了eccDNA機(jī)制研究相關(guān)文獻(xiàn)。

表1 形成eccDNA的11種潛在機(jī)制對(duì)應(yīng)參考文獻(xiàn)Table 1 Corresponding references of 11 kinds of potential mechanisms for eccDNA formation

3 eccDNA的功能研究進(jìn)展

eccDNA缺少著絲粒和端粒，能夠自我復(fù)制（microDNA未知），有絲分裂和減數(shù)分裂時(shí)隨機(jī)分配到子代細(xì)胞，部分eccDNA可以重新整合到基因組同源染色區(qū)域（homogeneously staining region，HSR），并且ecDNA較高染色質(zhì)開(kāi)放性強(qiáng)使得eccDNA上調(diào)控元件與靶基因互作更強(qiáng)，基因表達(dá)水平更高，這些特性極大的增加了細(xì)胞異質(zhì)性和環(huán)境適應(yīng)性［40-41，71］。eccDNA 功能概括如圖 3。

圖3 eccDNA的功能Fig.3 An overview of current understanding of eccDNA functions

3.1 端粒和rDNA拷貝數(shù)維持

不依賴于端粒酶的t-circle修復(fù)途徑對(duì)端?？勺冄娱L(zhǎng)（alternative lengthening of telomeres，ALT）具有重要意義。這種機(jī)制最初是在酵母線粒體基因組中發(fā)現(xiàn)的，t-circle可以作為端粒DNA滾環(huán)合成的模板，動(dòng)植物中廣泛存在的t-circle極有可能具有類似的功能［25，72］。此外，據(jù)估計(jì)15%人類永生化細(xì)胞系可能通過(guò)ALT維持端粒長(zhǎng)度［73］。真核生物rDNA拷貝數(shù)可達(dá)100-1 000個(gè)，以串聯(lián)重復(fù)的方式排列在基因組上，以滿足機(jī)體對(duì)核糖體合成的需求。ERC的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致果蠅基因組rDNA拷貝數(shù)減少，但是其子代生殖細(xì)胞rDNA拷貝數(shù)可恢復(fù)正常，研究表明ERC可以自我復(fù)制并可以重新整合到基因組上維持或增加基因組rDNA的拷貝數(shù)［59］。但是ERC的整合并不多見(jiàn)，因此ERC對(duì)維持基因組rDNA拷貝數(shù)的作用仍有待深入研究。

3.2 細(xì)胞中eccDNA的積累導(dǎo)致衰老

Sinclair等［74］發(fā)現(xiàn)衰老的酵母細(xì)胞中會(huì)出現(xiàn)大量ERC，在有絲分裂時(shí)這些具有自我復(fù)制能力的ERC表現(xiàn)出母細(xì)胞偏好性，使ERC在母細(xì)胞中進(jìn)一步累積。據(jù)估計(jì)，酵母細(xì)胞分裂15代之后，每個(gè)母細(xì)胞含有500-1 000個(gè)ERC。大量的ERC會(huì)吸附復(fù)制和轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，使得基因組DNA無(wú)法進(jìn)行有效復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致酵母生長(zhǎng)停滯，直至死亡［74］。酵母解螺旋酶Sgs1基因突變會(huì)導(dǎo)致ERC的快速積累并發(fā)生早衰，相反，復(fù)制叉阻斷蛋白Fob1基因突變會(huì)抑制ERC的形成，并延緩衰老［75］。M?ller與Payen等［76-77］研究發(fā)現(xiàn)年輕酵母群中存在近1 800種不同基因組來(lái)源的eccDNA，并且絕大多數(shù)eccDNA至少含有蛋白編碼基因的部分序列，但這1 800種eccDNA拷貝數(shù)很少，它們幾乎不會(huì)對(duì)酵母表型產(chǎn)生影響，任何eccDNA只有大量積累之后才會(huì)產(chǎn)生作用［75］?；谝陨鲜聦?shí)，Hull等［75］提出酵母衰老可能是酵母為適應(yīng)外部或內(nèi)部環(huán)境富集了某些eccDNA而犧牲了健康的結(jié)果，因?yàn)榛蚩截悢?shù)的擴(kuò)增會(huì)在某種程度上破壞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和蛋白穩(wěn)態(tài)。按照Hull等推測(cè)，CuSO4處理酵母后而富集的CUP1 eccDNA可能對(duì)酵母衰老也有作用［53］，但這需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3.3 eccDNA通過(guò)增加基因拷貝數(shù)使機(jī)體產(chǎn)生耐藥性

致癌變異EGFR vIII能有效加速膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)，但是它也使表達(dá)它的腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑TKI更加敏感。TKI處理之后，腫瘤組織中高表達(dá)EGFR vIII的TKI敏感腫瘤細(xì)胞比例降低，低表達(dá)EGFR vIII的TKI抗性腫瘤細(xì)胞比例升高。研究表明腫瘤TKI耐藥性是通過(guò)消除包含EGFR vIII的DM而產(chǎn)生的，消失的DM可以整合到基因組HSR上，但當(dāng)停藥后，這種DM又會(huì)快速出現(xiàn)，通過(guò)該途徑，癌細(xì)胞可以逃避癌基因的靶向治療。因此，TKI的脈沖間歇治療可達(dá)到更好的靶向抑制效果，同時(shí)使腫瘤恢復(fù)藥物敏感性［39，78-79］。值得注意的是，EGFR DM在復(fù)制過(guò)程中也能會(huì)產(chǎn)生EGFR DM，進(jìn)一步提高腫瘤異質(zhì)性和適應(yīng)性［79］。在植物中，Koo等［3-4］發(fā)現(xiàn)在抗草甘膦長(zhǎng)芒莧中存在包含EPSPS基因的eccDNA，而且eccDNA可以通過(guò)有絲分裂和減數(shù)分裂傳給下一代，這表明eccDNA分子可以驅(qū)動(dòng)高等生物的快速適應(yīng)性進(jìn)化。

3.4 腫瘤發(fā)生

ecDNA是基因擴(kuò)增的一種形式，ecDNA的非孟德?tīng)栠z傳會(huì)導(dǎo)致腫瘤內(nèi)細(xì)胞間的異質(zhì)性增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤進(jìn)化［39，80-81］。攜帶完整原癌基因MET、EGRF或MYC的ecDNA可以使腫瘤細(xì)胞快速增殖，攜帶完整原癌基因MYCN的ecDNA對(duì)腫瘤侵襲和遷移具有重要作用［69，80］。早期的研究認(rèn)為ecDNA對(duì)癌基因表達(dá)的貢獻(xiàn)主要是由于基因拷貝數(shù)的增加所致。2019年Wu團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)ecDNA對(duì)癌基因的表達(dá)增高不僅僅由于基因拷貝數(shù)的升高，還包括ecDNA本身高度轉(zhuǎn)錄活性的貢獻(xiàn)［41］。ecDNA上面缺乏抑制型的組蛋白修飾和高級(jí)壓縮結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其開(kāi)放性比染色體DNA要強(qiáng)，并且ecDNA上的增強(qiáng)子不受絕緣子的束縛，可以與原癌基因產(chǎn)生超遠(yuǎn)距離的DNA相互作用，進(jìn)一步促進(jìn)基因表達(dá)［82-83］。人類正常個(gè)體和癌癥個(gè)體血清和血漿中存在大量游離的eccDNA，這些eccDNA主要是microDNA［84-85］。切除腫瘤前后，血液中游離的mircoDNA其長(zhǎng)度分布會(huì)發(fā)生變化，說(shuō)明microDNA可以作為腫瘤診斷的分子標(biāo)記［85］。腫瘤異種移植后可以在受體血液中檢測(cè)到游離的供體microDNA，說(shuō)明microDNA可能參與了細(xì)胞間通訊［85］。含有ecDNA的腫瘤患者其生存期要顯著低于不含有ecDNA的腫瘤患者，說(shuō)明ecDNA可以作為腫瘤的預(yù)后標(biāo)記物［86-87］。

3.5 eccDNA對(duì)畜禽表型的影響

目前有關(guān)eccDNA對(duì)畜禽表型影響的研究已有報(bào)道，包括牛白色背線性狀（colour sideness，Cs）和鴿子肌肉發(fā)育。牛白色背線性狀表現(xiàn)為從頭頸至臀尾部的白色背線，屬于顯性遺傳性狀。eccDNA通過(guò)影響毛色關(guān)鍵基因KIT的表達(dá)調(diào)控牛白色背線性狀。6號(hào)染色體上一段包含KIT基因的492 kb的片段通過(guò)環(huán)化形成eccDNA（Durkin等命名為環(huán)形中間體circular intermediate）易位到29號(hào)染色體，形成Cs29等位基因。包含Cs29等位基因的一段575 kb的基因組片段環(huán)化后易位到6號(hào)染色體，構(gòu)成Cs6等位基因［1］。eccDNA介導(dǎo)了KIT基因轉(zhuǎn)座，使其異常表達(dá)。M?ller［2］研究發(fā)現(xiàn)肉用王鴿（king pigeon）肌肉組織eccDNA數(shù)目比信鴿（homing pigeon）高9倍，并且在肉用王鴿顯著富集了包含AGRIN基因的eccDNA，而AGRIN基因編碼一種細(xì)胞膜蛋白，參與神經(jīng)肌肉接頭的發(fā)育，該基因突變會(huì)導(dǎo)致肌肉發(fā)育異常［2］。并且在植物中，Koo與Molin等［3-4］發(fā)現(xiàn)在抗草甘膦長(zhǎng)芒莧中存在包含EPSPS基因的eccDNA，而且eccDNA可以通過(guò)有絲分裂和減數(shù)分裂傳給下一代，這表明eccDNA分子可以驅(qū)動(dòng)高等生物的快速適應(yīng)性進(jìn)化。這些研究結(jié)果表明eccDNA或許可以用于畜禽分子標(biāo)記選擇。但是eccDNA具有一定的時(shí)空特異性，類似于mRNA，這會(huì)限制其應(yīng)用。例如，如何利用肌肉組織特異的eccDNA作為分子標(biāo)記來(lái)實(shí)現(xiàn)肉用家畜的早期選種？因此，血液中游離的mircoDNA或許可作為未來(lái)畜禽分子育種的方向之一。通過(guò)前期血液eccDNA的篩選和后期關(guān)聯(lián)分析，或許可以鑒定出相關(guān)eccDNA標(biāo)記。

4 eccDNA的鑒定方法

樣品總DNA提取之后，可直接進(jìn)行顯微觀測(cè)，也可利用Hirt法簡(jiǎn)單富集低分子量（low molecular weight，LMW）DNA后進(jìn)行顯微觀測(cè)和2D電泳［88-89］。染色體核型分析時(shí)，可在光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)到DM［35］，但小分子eccDNA則需要電子顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)，并且可以估算eccDNA大?。?0］（圖4）。2D電泳也可鑒定eccDNA的大小，Cesare等［24］利用2D電泳鑒定出的eccDNA在0.7 kb-56.8 kb。2D電泳通?？捎^測(cè)到4條泳帶，包括開(kāi)放環(huán)（open circle）條帶、超螺旋環(huán)（supercoiled circle）條帶、線性DNA（linear DNA）條帶和電泳過(guò)程中超螺旋環(huán)轉(zhuǎn)變?yōu)殚_(kāi)放環(huán)（supercoilded to open circle）而形成的條帶［88］。開(kāi)放環(huán)是eccDNA主要構(gòu)型，但無(wú)法確定2D電泳條帶中的開(kāi)放環(huán)是松散環(huán)（relaxed circle）還是缺口環(huán)（nicked circle）［90］。2D 電泳結(jié)合Southern blot等印記技術(shù)可以進(jìn)一步揭示eccDNA序列特征及相對(duì)豐度［90］。此外，細(xì)胞經(jīng)DAPI染色后，利用電鏡結(jié)合ECdetect軟件可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中ecDNA的計(jì)數(shù)［39］。

與質(zhì)粒提取試劑盒相比，CsCl-EB法從總DNA中富集eccDNA上樣量大、操作繁瑣、缺口環(huán)易丟失，所以目前應(yīng)用較少［90-92］。富集后的eccDNA可采用Circulome-seq［92］、mobilome-seq［93］、Circle-seq［76］或 CIDER-seq［94］進(jìn)行高通量測(cè)序（圖 4）。Circulome-seq采用Tn5轉(zhuǎn)座酶在一個(gè)反應(yīng)中完成實(shí)現(xiàn)eccDNA線性化、末端修復(fù)和接頭連接，極大簡(jiǎn)化了文庫(kù)構(gòu)建，可檢測(cè)數(shù)百bp-數(shù)百kb的eccDNA；mobilome-seq采用核酸外切酶DNase消化eccDNA富集樣品中的線性DNA，滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）后，進(jìn)行高通量測(cè)序，可用于鑒定反轉(zhuǎn)座子形成的eccDNA；Circle-seq為了充分消化線性DNA，在核酸外切酶DNase消化之前，先用核酸內(nèi)切酶Not I對(duì)富集的樣品進(jìn)行處理，所以會(huì)造成部分eccDNA的丟失，鑒定范圍在1 kb-38 kb；CIDER-seq可檢測(cè)數(shù)百bp-數(shù)百kb的eccDNA，但＜ 10 kb的eccDNA鑒定準(zhǔn)確度更高。該方法對(duì)富集后的eccDNA直接進(jìn)行RCA，沒(méi)有進(jìn)行酶切處理，因此線性基因組得到大量擴(kuò)增，但該方法采用了SMRT長(zhǎng)讀長(zhǎng)（long read）測(cè)序策略，可以得到更多的split read，這有利于eccDNA的鑒定，因?yàn)橛糜趀ccDNA鑒定的軟件都依賴于split read。在進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建時(shí)可以加入質(zhì)粒作為對(duì)照或內(nèi)參，可提高驗(yàn)證文庫(kù)構(gòu)建和后續(xù)數(shù)據(jù)分析的可靠性。依據(jù)eccDNA的數(shù)據(jù)分析原理，可以直接從全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS）或ATAC-seq 數(shù) 據(jù) 中 鑒 定 eccDNA［39，80，95］， 或 者 先富集總DNA中的高分子量（high molecular weight，HMW）DNA，WGS后，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，可鑒定出更多的 ecDNA［41］。Koche 等［42］證實(shí) 100% 的 WGS ecDNA在Circle-seq ecDNA中重現(xiàn)，但僅有30% 的WGS eccDNA（狹義）被Circle-seq鑒定出來(lái)。目前利用高通量測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定eccDNA的軟件主要有AmpliconArchitect［96］、AmpliconReconstructor［97］、CIRCexplorer2［98］、Circle_finder［42］、Circle-Map［99］和ECCsplorer［100］等，Prada-Luengo對(duì)應(yīng)用較多的3款軟件進(jìn)行了對(duì)比［99］，此處不再詳述。

圖4 eccDNA的鑒定方法Fig.4 Methods for eccDNA identification

5 總結(jié)與展望

eccDNA在真核生物中是普遍存在的，包括動(dòng)物、植物和酵母等。依據(jù)來(lái)源和大小，eccDNA可以劃分為不同種類，它們的產(chǎn)生機(jī)制也不盡相同，共涉及了11種模型。但這些模型都缺少直接證據(jù)，例如支持eccDNA自我復(fù)制的直接證據(jù)，因此這些模型仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。盡管這些問(wèn)題尚未解決，但是目前已開(kāi)發(fā)了可用于單倍型分型的CRISPR-hapC技術(shù)［101］。該技術(shù)基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除基因組片段（兩個(gè)SNP位點(diǎn)位于片段兩端），環(huán)化形成eccDNA，使兩個(gè)SNP出現(xiàn)在eccDNA接頭處，提取DNA，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，單克隆測(cè)序鑒定基因組單倍型。該技術(shù)可以可以實(shí)現(xiàn)200 Mb基因組序列單倍型鑒定［101］，在功能基因組學(xué)研究和因果突變鑒定方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

大分子eccDNA，如ecDNA，通?？梢詳y帶完整原癌基因，這使其成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。并且攜帶eccDNA的腫瘤患者，其生存率顯著低于不攜帶eccDNA的患者，說(shuō)明大分子eccDNA可以作為腫瘤預(yù)后的生物標(biāo)記［86-87］。在動(dòng)植物中，大分子eccDNA也可以攜帶完整基因，如KIT和EPSPS在表型變異環(huán)境適應(yīng)方面發(fā)揮重要作用，并且這種以獲得的表型可以穩(wěn)定地傳遞給下一代［1，3-4］。此外，這種大分子eccDNA在正常組織中含量不低，如鴿子肌肉組織中共有1 083個(gè)完整基因存在于eccDNA上［2］。這些結(jié)果表明，大分子eccDNA可用于分子標(biāo)記輔助選擇。但eccDNA存在時(shí)空特異性，這在某種程度上限制了其應(yīng)用，例如，肌肉組織特異的eccDNA在畜禽肉用選育中的應(yīng)用。因?yàn)榧幢闶羌∪饨M織活體采樣，也會(huì)對(duì)待測(cè)畜禽產(chǎn)生影響，更不用提早期選育。

研究表明，microRNA占eccDNA的絕大部分，它們可以由其他組織釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)中［84-85］。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，鑒定血液中游離的microDNA，利用qPCR進(jìn)行相對(duì)定量，并與畜禽表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，鑒定可用的microDNA標(biāo)記。因此，血液游離microRNA的鑒定及其與表型關(guān)聯(lián)分析是未來(lái)eccDNA應(yīng)用于畜禽育種的一個(gè)重要方向。目前，已有eccDNA專門數(shù)據(jù)庫(kù)（eccDNAdb，http：//www.eccdnadb.net/），并已收錄了人、小鼠和雞共計(jì)170萬(wàn)個(gè)eccDNA，這些數(shù)據(jù)可為關(guān)聯(lián)分析提供數(shù)據(jù)支撐。如果血液中microDNA的豐度確實(shí)與表型變異存在顯著相關(guān)，那其中的分子機(jī)制又有哪些。目前，已有人提出了兩種潛在機(jī)制：作為分子海綿吸附轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生非編碼RNA，但目前尚未有任何相關(guān)研究報(bào)道［60，64，102-103］。這些問(wèn)題的深入研究，將促進(jìn)eccDNA在畜禽育種中的應(yīng)用。