農(nóng)藥殘留檢測(cè)關(guān)鍵用酶固定化研究進(jìn)展

朱永安 王淼 曹靜 喻鶴 曹振 金茂俊 王靜 佘永新

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

在農(nóng)藥的使用保障了我國(guó)糧食穩(wěn)定生產(chǎn)的同時(shí)，不合理和過量的施用也引起了農(nóng)藥殘留超標(biāo)的問題，殘留的農(nóng)藥及其代謝物可以通過富集作用在食物鏈中不斷傳遞、遷移，從而對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全、生態(tài)環(huán)境造成不良的影響，進(jìn)而危害人類健康［1］。

為了對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)，常規(guī)的儀器檢測(cè)方法往往檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，且成本較高，并不適用于實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)過程中農(nóng)產(chǎn)品的快速檢測(cè)。酶抑制法作為一類快速篩查方法，可以對(duì)農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速檢測(cè)，其中最關(guān)鍵的步驟是農(nóng)藥殘留對(duì)酶的抑制效果的分析，但是游離酶由于穩(wěn)定性差且在有機(jī)溶劑環(huán)境下不耐受，而固定化酶可以改善游離酶的缺陷，將酶固定于載體上，同時(shí)保留一定的催化活性。本文重點(diǎn)論述了固定化技術(shù)、載體及產(chǎn)品在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用，為今后農(nóng)藥殘留檢測(cè)固定化酶研究提供一定思路和方法。

1 酶的固定化技術(shù)分類

1.1 吸附法

吸附法是利用物理方法，將酶固定于載體上，可分為離子吸附、親和吸附及物理吸附。物理吸附是最常用的，通過氫鍵、范德華力、疏水相互作用將酶吸附在載體的表面［2］。例如Tallita等［3］將堿性磷酸酶（ALP）以物理吸附的方式固定在聚合物改性電極上制成的電化學(xué)傳感器可以用于檢測(cè)4-硝基酚（4-NP）。

1.2 包埋法

包埋法是將酶固定在聚合物材料的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)或微囊結(jié)構(gòu)等多空隙載體中。用于包埋的載體一般是殼聚糖、聚丙烯酰胺、瓊脂、海藻酸鈣等。該方法可以降低酶的滲出，同時(shí)酶與載體之間無化學(xué)鍵連接，保持了酶構(gòu)象的穩(wěn)定。然而，底物與酶反應(yīng)時(shí)，會(huì)因?yàn)榘窠Y(jié)構(gòu)的特殊性導(dǎo)致底物無法通過保護(hù)層而與酶進(jìn)行反應(yīng)，這是目前包埋法固定酶的主要缺點(diǎn)之一。同時(shí)，僅以物理方法包覆酶可能導(dǎo)致酶的負(fù)載效率低［4］。

應(yīng)用較為廣泛的包埋法是溶膠-凝膠法，Du等［5］用正硅酸乙酯和納米金顆粒（GNPs）制成了用于包埋酶的溶膠-凝膠復(fù)合材料，將乙酰膽堿酯酶（AChE）包埋其中制成生物傳感器，對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)。在抑制率10%時(shí)久效磷的檢出限為0.6 ng/mL，且具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

但由于溶膠-凝膠法包埋過程中酶容易失活［6］，因此一些新的包埋技術(shù)也被逐漸研究，江南大學(xué)孔軍等［7］在研究酶的固定化時(shí)發(fā)明了一種新的包埋技術(shù)，以缺陷型釀酒酵母孢子微膠囊將酶固定化。該方法利用基因工程技術(shù)將酶以包埋法形式固定，對(duì)比溶膠-凝膠法，可以減少因包埋過程中引入有機(jī)溶劑對(duì)酶活性造成的損失。

1.3 共價(jià)結(jié)合法

由于酶的表面存在很多游離基團(tuán)，如羧基、氨基、巰基等可以與載體表面基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成共價(jià)鍵，以此原理固定化酶的方法為共價(jià)結(jié)合法。AChE上含有氨基，因此Khaldi等［8］將單晶硅表面羧基化后，通過酰胺鍵將AChE共價(jià)連接至羧基端。Tallita等［3］同樣將電極上的羧基活化后，與堿性磷酸酶（ALP）以形成酰胺鍵的方式進(jìn)行固定化，制成的電化學(xué)傳感器可對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行靈敏檢測(cè)。

另外還有研究者利用酶表面的羧基進(jìn)行固定化，Jiang等［9］將膠體金納米顆粒和重氮樹脂固定于對(duì)氨基苯磺酸修飾后的玻碳電極表面，形成基質(zhì)復(fù)合膜，用于乙酰膽堿酯酶的固定。類似的基于形成化學(xué)共價(jià)鍵的方式固定化可以使酶與載體結(jié)合緊密，不易從載體表面脫落。但是由于酶與載體以共價(jià)鍵結(jié)合后可能會(huì)導(dǎo)致酶的空間構(gòu)象發(fā)生變化，對(duì)酶活會(huì)造成不同程度的損失。因此以共價(jià)結(jié)合法固定酶時(shí)應(yīng)該考慮到該缺陷。

1.4 交聯(lián)法

交聯(lián)法是利用交聯(lián)劑與酶蛋白進(jìn)行交聯(lián)，通過形成穩(wěn)定的三維交聯(lián)網(wǎng)架結(jié)構(gòu)將酶固定。如果交聯(lián)的是相同的官能團(tuán)，則被稱為同雙功能交聯(lián)劑，例如戊二醛。若交聯(lián)劑連接的是不同的基團(tuán)則該種交聯(lián)劑被稱為異雙功能試劑［10］。

交聯(lián)法固定化酶中，戊二醛試劑［11］被廣泛使用。毛罕平等［12］使用戊二醛將AChE交聯(lián)在紙制微流控系統(tǒng)中用于檢測(cè)對(duì)硫磷，檢測(cè)線性范圍在1.0×10-7-1.0×10-5g/mL內(nèi)，檢出限為3.3×10-8g/mL。與其它固定化酶方法相比，戊二醛在交聯(lián)酶時(shí)用量較大，當(dāng)用量大于一定閾值后會(huì)使酶失活。Sun等［13］用戊二醛作為交聯(lián)劑，采用交聯(lián)法和溶膠-凝膠包埋法兩種不同的固定化方法將AChE固定在殼聚糖膜上，結(jié)果表明用戊二醛作為交聯(lián)劑固定化酶的活性明顯低于溶膠-凝膠包埋法。所以采用交聯(lián)法固定化酶時(shí)需要優(yōu)先考慮交聯(lián)劑的類型是否會(huì)對(duì)酶造成毒害作用。

1.5 氨基酸置換法

利用對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定點(diǎn)誘變的基因工程技術(shù)可以直接改變酶的性質(zhì)，這種蛋白質(zhì)性質(zhì)的變化還可以用于酶的固定化，提高酶的催化性能［14］。即在酶蛋白上合適位點(diǎn)，置換某個(gè)氨基酸，突變后的酶蛋白通過該突變氨基酸特殊的側(cè)鏈基團(tuán)控制固定酶的方向。Li等［4］通過迭代飽和誘變（ISM）方法篩選得到催化活性最高的甲基對(duì)硫磷水解酶（MPH）突變產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)證明突變酶可以對(duì)甲基對(duì)硫磷進(jìn)行高效地水解，以誘變方法得到突變酶的思路可以借鑒到對(duì)農(nóng)藥殘留檢測(cè)當(dāng)中。但關(guān)于這方面的報(bào)道還較少，需要進(jìn)一步研究其實(shí)用性。

1.6 生物素-親和素親和法

生物素-親和素親和法基于生物素與親和素高效專一性、極強(qiáng)的親和力可以把酶蛋白與生物素結(jié)合成融合蛋白以后，再將融合蛋白固定在親和素包被的材料中。Zhang等［15］制備了一種基于生物素-鏈霉親和素耦聯(lián)合成方法的免疫傳感器用于檢測(cè)細(xì)胞因子IL-6的濃度變化，與共價(jià)結(jié)合方法相比，該方法可以增加固定在載體表面的抗體數(shù)量，使免疫傳感器的檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.1 pg/mL，檢測(cè)的線性范圍在0.4-400 pg/mL間。

2 酶的固定化載體

2.1 無機(jī)載體

無機(jī)載體主要是指利用二氧化硅、黏土材料等作為基質(zhì)復(fù)合形成的固定化材料，這類材料具有孔隙率大、無毒、綠色等特點(diǎn)，但缺點(diǎn)在于作為單一基質(zhì)其穩(wěn)定性不高，需要和有機(jī)材料復(fù)合形成更穩(wěn)定的載體。

2.1.1 二氧化硅 由于硅材料具有良好的生物相容性，毒性小，化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定，被廣泛用于酶的催化和制造傳感器。Yang等［16］采用SiO2作為納米片（SNS）再結(jié)合全氟磺酸（NF）用于修飾玻碳電極（GCE），通過殼聚糖固定AChE，制成了檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的生物傳感器，對(duì)甲基對(duì)硫磷、毒死蜱、克百威具有很低的檢出限。然而，以二氧化硅作為載體的固定材料缺點(diǎn)在于在固定過程中酶的定向性較差，在包覆酶的過程中還容易使酶發(fā)生變性進(jìn)而影響傳感器的性能［17］。

2.1.2 黏土材料 黏土材料基于其結(jié)構(gòu)和功能特性，可以作為吸附劑用于生物催化過程中。在酶的固定化中常用到的生物納米復(fù)合材料可以由不同的黏土礦物和生物高分子組裝形成。研究發(fā)現(xiàn)第一種有機(jī)-無機(jī)混合納米結(jié)構(gòu)材料便是基于天然硅酸鹽合成的，即黏土材料［18］。黏土材料的特定晶體結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)的混合材料相比具有一定優(yōu)勢(shì)。

2.2 有機(jī)高分子載體

有機(jī)高分子載體主要分為天然高分子載體和合成高分子載體。天然高分子載體例如殼聚糖、纖維素等具有無毒環(huán)保、良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)。合成高分子載體則以樹脂材料和聚酯型復(fù)合材料居多，其優(yōu)點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度高且物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定［19］。但是合成高分子材料對(duì)生物相容性較差，且具有一定的細(xì)胞毒性。

2.2.1 天然高分子載體

2.2.1.1 殼聚糖 殼聚糖是一種具有生物相容性、無毒的固定化酶的基質(zhì)，可以對(duì)其進(jìn)行化學(xué)改性，并且殼聚糖易于修飾。將其用作固定化載體，可穩(wěn)定AChE活性。Patel等［20］將殼聚糖固定的AChE用于食品中殘留的有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)，在反應(yīng)前后酶活仍舊維持穩(wěn)定。此外，殼聚糖通常也與其他固定材料復(fù)合以改善殼聚糖對(duì)反應(yīng)環(huán)境耐受性較差的缺點(diǎn)。例如Bayramo?lua［21］提出了使用甲基丙烯酸殼聚糖復(fù)合材料作為固定化酶的載體，增強(qiáng)了酶的反應(yīng)環(huán)境耐受性，與游離酶（50℃）相比，固定化酶反應(yīng)溫度可以提高至62℃，同時(shí)游離酶在反應(yīng)15 d內(nèi)全部失活，而采用甲基丙烯酸殼聚糖復(fù)合載體的固定化酶在循環(huán)使用8次后仍然保留了40%以上的相對(duì)活性，可見殼聚糖復(fù)合型材料作為固定化酶的基質(zhì)具有穩(wěn)定酶反應(yīng)條件的特點(diǎn)。

2.2.1.2 纖維素 纖維素和殼聚糖同屬于多糖類，也具有良好的生物相容性、無毒等特點(diǎn)。伍周玲等［22］采用微晶纖維素為原料制備了雙醛纖維素，該材料用作生物傳感器中AChE的固定，對(duì)敵敵畏的檢出限為6.99 ng/mL。以纖維素作為固定化載體成本較低且固定化酶的性質(zhì)較為穩(wěn)定，可以提高對(duì)酶的負(fù)載量，間接提高酶與底物的反應(yīng)速率［23］。

2.2.2 合成高分子載體

2.2.2.1 樹脂材料 溶膠-凝膠法在酶的固定化中應(yīng)用較為廣泛，而樹脂材料是溶膠-凝膠合成固定化酶的常用載體。有報(bào)道使用了低聚硅氧烷樹脂材料結(jié)合非水解溶膠-凝膠法將AChE共價(jià)固定化，該樹脂材料可以使AChE的固定化率達(dá)到80%以上，且在一定的pH（5.5、5.8）和相對(duì)較高的溫度（40℃以上）中，樹脂材料固定的AChE活性高于游離酶，固定化酶還增強(qiáng)了的貯存穩(wěn)定性以及對(duì)某些金屬陽離子的抑制作用［24］。Li等［25］通過戊二醛將酶固定在NKA-9樹脂上，在NKA-9樹脂上的負(fù)載量為34.4 mg/100 mg，因此樹脂材料還可提高酶的負(fù)載量。

2.2.2.2 聚酯材料 聚酯材料是用化學(xué)方法將有機(jī)二元酸和二元醇縮聚合成的纖維，屬于高分子化合物。聚酯材料制備的固定化酶載體，由于其化學(xué)性能穩(wěn)定且具有一定的強(qiáng)度，可以使酶的穩(wěn)定性增強(qiáng)。Gao等［26］通過共價(jià)結(jié)合的方法將有機(jī)磷降解酶A（OpdA）固定在高孔洞的非織造聚酯織物：聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）表面，用于對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解。固定化酶在酸性環(huán)境中仍保持較高的活性，在4℃磷酸鹽緩沖液中還可保存至少4周以上。Han等［27］將一種由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）的單體材料作為固定化辣根過氧化物酶（HRP）的載體。固定化酶在60℃時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性，在循環(huán)使用6次后，HRP仍然可以保持52%的原活性。雖然聚酯材料的優(yōu)良物理化學(xué)特性可以為酶的催化反應(yīng)和保存提供穩(wěn)定的環(huán)境，但還要考慮酶在聚酯材料上的兼容性，且目前國(guó)內(nèi)外將酶固定在聚酯材料上進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)的相關(guān)研究報(bào)道較少，須進(jìn)一步考究其適用性。

2.3 磁性材料

磁性材料作為固定化酶的基質(zhì)具有更好的穩(wěn)定酶活的作用，如目前應(yīng)用較為廣泛的基于生物炭或二氧化硅基質(zhì)包覆的磁性材料，具有低毒、易于回收、清潔高效等特點(diǎn)。在適宜條件下利用二氧化硅包覆的磁性納米材料在滿足核殼均一的前提下，還應(yīng)盡可能提高納米顆粒的比表面積，同時(shí)制備的磁性材料可以對(duì)不同基質(zhì)進(jìn)行修飾。Won等［17］報(bào)道了一類由Fe3O4磁性無機(jī)核、介孔二氧化硅和AChE制成的磁性生物復(fù)合材料。該磁性材料用于修飾SPE電極，將對(duì)氧磷的檢測(cè)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)。用磁性材料制成的傳感器具有良好的操作穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和酶活性，對(duì)氧磷的檢測(cè)限在納摩爾范圍。

此外Li等［28］通過Fe3O4@SiO2復(fù)合材料包覆AgNPs，成功合成了Fe3O4@SiO2@Ag，該材料具有較大的表面拉曼增強(qiáng)效應(yīng)（SERS），對(duì)福美雙的拉曼信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)限為0.24 ppm。像這樣含有兩種或者兩種以上不同材料包覆的磁性載體具有多種性能，可以對(duì)檢測(cè)信號(hào)起到放大作用，將金屬納米粒子包覆在磁性載體上還展現(xiàn)出一定的SERS性能，對(duì)于解決檢測(cè)靈敏度低的問題，提供了良好的借鑒方法。

2.4 介孔材料

介孔材料是一種孔徑在2-50 nm的多孔材料，因?yàn)槠淇讖椒植驾^窄，比表面積極高，同時(shí)該類材料的間隙結(jié)構(gòu)分布優(yōu)越，被逐漸用于對(duì)各種蛋白質(zhì)和酶的固定化［29］。最早發(fā)現(xiàn)的介孔材料是由氧化硅組成的孔狀三維結(jié)構(gòu)物質(zhì)。之后的研究中也出現(xiàn)了許多非硅系介孔材料。硅系介孔材料如Ji等［30］利用介孔二氧化硅（MSN）為載體制備了酶-抗體結(jié)合型免疫傳感器，利用硅烷化試劑（GPTMS）將MSN表面功能化后用酶和第二抗體（Ab2）對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記（制備過程見圖1），檢測(cè)時(shí)再將信號(hào)放大成比色信號(hào)。

圖1 基于MSN載體免疫傳感器制備流程Fig. 1 Preparation process of MSN carrier immunosensor

非硅系載體則主要包括磷酸鹽、金屬氧化物和介孔碳等，與介孔二氧化硅類似，具有高比表面積和納米孔道結(jié)構(gòu)。Wu等［31］利用非硅系介孔材料——介孔碳（BCs）制備了電化學(xué)發(fā)光（ECL）傳感器用于檢測(cè)農(nóng)藥阿特拉津（ATZ），對(duì)阿特拉津的檢出限為0.08 ng/L。

介孔材料雖然都具有高比表面積的特性，可以將固定化酶的負(fù)載量提高，但是不同的介孔材料由于其表面化學(xué)性質(zhì)不同，因此對(duì)酶固定化過程的影響也大相徑庭。而MSN作為固定化酶的載體具有效益高的優(yōu)點(diǎn)，表面功能化的MSN是介孔材料的首選。

2.5 納米材料

納米材料是一類尺寸介于1-100 nm的材料，具有優(yōu)越的導(dǎo)電性、良好的催化活性及無毒清潔等特點(diǎn)被用于制備生物傳感器的重要材料［32］。Quan等［33］采用酶法合成、自由基聚合以及靜電紡絲相結(jié)合的方法制備了含多碳納米管（MWCNTs）的丙烯腈共聚物納米纖維，將多碳納米管加入后可以增強(qiáng)載體的多孔性，為酶的固定提供了更多結(jié)合位點(diǎn)。

納米材料制備的固定化酶載體除了可以增加材料的比表面積外，將納米材料表面功能化后還可以控制蛋白質(zhì)的吸附和定向，增強(qiáng)酶與載體之間的親和力［34-35］。Yu等［34］通過制備氨基化的多碳納米管CNT-NH2和羥基化的多碳納米管CNT-OH，將AChE固定在不同的納米管上。結(jié)果顯示更多的AChE吸附在CNT-NH2上，且兩種不同帶電性的材料都比原始碳納米管固定的AChE更多。還有研究人員對(duì)其他納米材料進(jìn)行表面功能化，Mahmoudifard等［36］制備了一種基于表面化學(xué)修飾的聚醚砜（PES）納米纖維膜，用EDC/NHS耦聯(lián)策略將抗體固定在該納米纖維膜上。另外無機(jī)材料同樣可以作為固定化酶的載體，如Mei等［37］用硅酸鹽（CuSiO3）制備的載體對(duì)酶的負(fù)載量為140 mg/g。因此納米材料由于具有優(yōu)良的物理性能（高比表面積）及表面功能化后的化學(xué)性能（親和性），使其成為了固定化酶載體的又一選擇。

2.6 金屬有機(jī)框架（MOFs）

金屬有機(jī)框架（MOFs）作為固定化酶的材料，具有提高酶穩(wěn)定性和活性，可調(diào)節(jié)孔徑大小以及選擇性等特點(diǎn)。以MOFs材料為載體可以通過物理吸附、共價(jià)結(jié)合、分子自組裝等方式將酶固定在其多孔結(jié)構(gòu)中從而賦予了MOFs材料催化性能。合成后的MOFs材料具有選擇性和催化活性高的特點(diǎn)［38］。這種基于晶體納米材料的結(jié)構(gòu)，只需利用特定的固定方法將酶引入MOFs結(jié)構(gòu)中即可［39］。同時(shí)，由于金屬和配體形成的結(jié)構(gòu)具有拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)，可以根據(jù)需要對(duì)載體材料進(jìn)行設(shè)計(jì)［40］。因而MOFs作為固定化酶的載體具有很好的前景。

Cai等［41］提出了基于金屬有機(jī)框架和大孔樹脂將酶固定化的一種方法，將酶封裝到沸石咪唑骨架-8（ZIF-8）中，然后通過物理吸附進(jìn)一步與大孔樹脂D101結(jié)合形成金屬有機(jī)框架復(fù)合材料CAL-BZIF-8@D101，經(jīng)過10次循環(huán)使用后相對(duì)酶活仍保留了84.20%。

但以MOFs材料作為固定化酶的載體還存在不足之處，在固定化時(shí)酶容易滲漏，且底物與酶的作用不緊密，在MOFs材料中酶和底物的接觸因?yàn)榭蚣芙Y(jié)構(gòu)的大小而被限制。而利用微流控技術(shù)合成的缺陷型MOFs，可以使底物與酶的接觸面積增大，從而提高了酶的活性［42］，其原理如圖2所示。

圖2 缺陷型MOFs合成過程Fig. 2 Synthesis process of defective MOFs

除了使用缺陷型MOFs材料以外，南開大學(xué)陳瑤研究員團(tuán)隊(duì)對(duì)MOFs材料固定化酶則采取了一種新的思路來解決因?yàn)镸OFs材料狹窄孔道造成的酶催化效率低的問題。該方法將酶用一鍋法固定于MOFs材料中后再包覆COFs外殼，最后在溫和的條件下將MOFs降解［43］，依靠COFs寬闊的孔徑使底物與酶充分接觸，該方法見圖3。

圖3 三步法制備COF膠囊結(jié)構(gòu)Fig. 3 Preparation of COF capsule structure by three-step method

MOFs載體具有較大比表面積和孔隙率可以為酶的固定提供更多結(jié)合位點(diǎn)，含有的金屬離子還可以提高電子轉(zhuǎn)移性能而增強(qiáng)檢測(cè)時(shí)的電信號(hào)，其在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的案例見表1所示。

表1 不同類型MOFs載體檢測(cè)性能比較Table 1 Comparison of detection performance of different types of MOFs carriers

3 固定化酶產(chǎn)品在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中應(yīng)用

固定化酶技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用除了常見的試紙條和速測(cè)卡，還有微流控系統(tǒng)和生物傳感器等，由這幾類檢測(cè)技術(shù)開發(fā)的產(chǎn)品在快速農(nóng)藥殘留檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用，是農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留篩查、監(jiān)管和防控的科學(xué)工具，為消費(fèi)者食用安全提供了一定保障。

3.1 試紙條

農(nóng)藥殘留檢測(cè)試紙條是常見的一種快速檢測(cè)產(chǎn)品。試紙條制備的常見方法是將酶固定在載體膜片上，然后固定于底板中。將樣品滴在膜片上后加入底物進(jìn)行顯色，由于存在一定的農(nóng)藥殘留會(huì)使酶活受到抑制，底物不能完全水解，因而顯色程度淺。根據(jù)此原理，廣州綠洲生化科技有限公司基于國(guó)標(biāo)方法［53］生產(chǎn)的天福牌農(nóng)藥速測(cè)卡可以在15 min內(nèi)對(duì)果蔬中有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速檢測(cè)，對(duì)呋喃丹、敵敵畏等農(nóng)藥的最低檢出限小于0.5 mg/kg。

3.2 微流控系統(tǒng)

由微型制造分析設(shè)備與集成組件構(gòu)成的全微型分析系統(tǒng)又稱為微流控系統(tǒng)。微流控系統(tǒng)由于可移植性，樣本、試劑消耗低，廢棄物生成少，低運(yùn)營(yíng)成本和高效率等優(yōu)點(diǎn)，逐漸引起了人們的關(guān)注。由微流控系統(tǒng)制成的產(chǎn)品可以對(duì)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的農(nóng)藥殘留檢測(cè)，杭州霆科生物科技有限公司生產(chǎn)的微流控農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)系統(tǒng)只需將樣品滴入14通道微流控芯片后，結(jié)合便攜式分析儀便可以在10 min內(nèi)同時(shí)檢測(cè)多種基質(zhì)的農(nóng)藥殘留［54］，對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥的檢測(cè)具有較高的特異性和可靠性。

3.3 生物傳感器

生物傳感器是一類將生物信號(hào)轉(zhuǎn)為電信號(hào)的高靈敏度傳感器，主要包括比色生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器、熒光生物傳感器和基于拉曼光譜的生物傳感器等［32］，生物傳感器具有更簡(jiǎn)便的操作方法和更高靈敏度的檢測(cè)效果，被運(yùn)用至眾多食品和農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中。常見的生物傳感器如電化學(xué)生物傳感器，通過固定在電極上的酶和底物反應(yīng)前后產(chǎn)生的電流信號(hào)變化得出酶被抑制的程度，抑制程度和農(nóng)藥濃度在一定濃度范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，因此可以檢測(cè)出農(nóng)藥殘留［55］。電化學(xué)生物傳感器與傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)相比具有快速響應(yīng)、低檢出限和良好的選擇性等特點(diǎn)［56］。

瑞士IST AG公司生產(chǎn)的生物傳感器采用酶法安培測(cè)量原理，依靠固定化酶對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)和分析，此外IST AG旗下Jobst Technologies GmbH開發(fā)的固定化系統(tǒng)還可以調(diào)節(jié)敏感度和測(cè)量范圍等參數(shù)，滿足了對(duì)不同目標(biāo)物的檢測(cè)需求。除一些傳統(tǒng)的用于檢測(cè)農(nóng)藥殘留的電化學(xué)生物傳感器外，El-Moghazy等［57］制備的電化學(xué)免疫傳感器通過檢測(cè)3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）的含量可以間接測(cè)定擬除蟲菊酯對(duì)人體的暴露量。Liu等［58］制備的電化學(xué)熒光傳感器對(duì)草甘膦的檢測(cè)線性范圍為0.001-1.0 μmol/L，檢出限為0.5 nmol/L。

目前越來越多的農(nóng)藥殘留檢測(cè)在向生物傳感器、免疫傳感器和微流控芯片等方向發(fā)展，這些快速檢測(cè)技術(shù)具有媲美傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的同時(shí)又耗時(shí)短、成本低，而固定化酶又是農(nóng)藥快速檢測(cè)的主要研究?jī)?nèi)容，本文將參考的由固定化酶原理制備的農(nóng)藥殘留檢測(cè)傳感器進(jìn)行了列舉，詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 不同類型傳感器比較Table 2 Comparison of different types of sensors

4 結(jié)論

基于酶抑制法原理制備的固定化酶產(chǎn)品在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用使檢測(cè)速度提高，且檢測(cè)能力可以與傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)性能相當(dāng)。不同的固定方法可以一定程度實(shí)現(xiàn)對(duì)酶的固定化。但目前存在的問題是，農(nóng)藥殘留檢測(cè)用酶大部分都局限于一種或者一類酶，即廣泛地使用AChE作為固定化酶源，對(duì)于其他酶源的固定化研究還較少。因此對(duì)于農(nóng)藥殘留檢測(cè)用酶的固定化研究應(yīng)重點(diǎn)對(duì)不同方法、載體和酶源進(jìn)行探討，而固定化酶產(chǎn)品運(yùn)用至農(nóng)藥殘留檢測(cè)中還需要進(jìn)一步研究和發(fā)展。