光電關(guān)聯(lián)顯微鏡技術(shù)及其在植物學(xué)研究中的應(yīng)用

武欣媛 王廣超 林金星 荊艷萍

（1. 北京林業(yè)大學(xué) 林木育種國家工程實驗室，北京 100083；2. 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室，北京 100083）

傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡觀察視野較廣，可進行特異性標(biāo)記，能夠?qū)崿F(xiàn)活細胞成像［1-2］，但分辨率有一定的局限性；電子顯微鏡分辨率高，可觀察細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，但不具有特異性，不能實現(xiàn)活體檢測［3］。光電關(guān)聯(lián)顯微鏡（correlative light and electron microscopy，CLEM）技術(shù)結(jié)合了這兩種成像方法的優(yōu)勢，利用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡對同一細胞或同一組織區(qū)域進行不同程度成像的聯(lián)合分析，直接在原位獲取全面而清晰的細胞結(jié)構(gòu)信息，目前已成為研究納米級結(jié)構(gòu)和分子分布的有力工具［4-5］。本文就該技術(shù)的研究進展和前人工作進行概述，著重介紹其在植物學(xué)研究中的應(yīng)用，旨為更好地運用CLEM提供借鑒和依據(jù)。

1 CLEM簡介

CLEM將兩種或兩種以上不同的顯微技術(shù)應(yīng)用到樣品的同一區(qū)域，產(chǎn)生互補的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和化學(xué)信息，從而實現(xiàn)單一技術(shù)無法實現(xiàn)的成像效果［6-7］。根據(jù)CLEM關(guān)聯(lián)電鏡的不同，又可以分為光鏡關(guān)聯(lián)掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM），光鏡關(guān)聯(lián)掃描透射電鏡（scanning transmission electron microscopy，STEM）和光鏡關(guān)聯(lián)透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM），后者的分辨率更高，可以提供高分辨率的超微結(jié)構(gòu)細節(jié)，但是樣品制備較為復(fù)雜［8］。早期，大多光電關(guān)聯(lián)使用TEM進行，近來，SEM被越來越普遍地應(yīng)用于CLEM。體積掃描電子顯微鏡（volume SEM）或連續(xù)切片掃描電鏡（serial slice SEM）的方法，通過連續(xù)觀察樣品表面，使三維細胞結(jié)構(gòu)可視化，近來常常被應(yīng)用于CLEM［9］。

冷凍光電關(guān)聯(lián)顯微鏡技術(shù)（cryo-correlative light and electron microscopy，Cryo-CLEM）和超分辨率光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)技術(shù)（super-resolution correlative lightelectron microscopy）近年來發(fā)展迅速。冷凍光電關(guān)聯(lián)顯微鏡技術(shù)，將冷凍技術(shù)與CLEM結(jié)合，采用快速冷凍制樣或者高壓冷凍制樣，吸附于載網(wǎng)的細胞等樣品經(jīng)快速冷凍固定后進行冷凍熒光成像；或者組織樣品經(jīng)高壓冷凍后冷凍切片，固定于載網(wǎng)上進行冷凍熒光成像，隨后均進行冷凍電鏡成像［10］。這一過程中，200 μm 厚度的樣品在20 ms 的極短時間內(nèi)能夠迅速玻璃化，將細胞內(nèi)的生理活動固定在一瞬間，保證樣品更接近生理狀態(tài)，從而可以真實地觀察到特定結(jié)構(gòu)的瞬時變化［11］。此外，低溫下熒光分子發(fā)光特性的提高，也使得成像的精度大大提高［7］。相比常規(guī)的CLEM，Cryo-CLEM具有成像質(zhì)量高，樣本制作難度低，樣本制作時間短等優(yōu)勢，已成為研究生物大分子強有力的武器［12］。

超分辨率熒光顯微技術(shù)包括隨機光學(xué)重建顯微 鏡（stochastic optical reconstruction microscopy，STORM）技術(shù)［13］，光激活定位顯微鏡（photoactivation localization microscopy，PALM）技術(shù)［14］和受激發(fā)射損耗顯微鏡（stimulated emission depletion，STED）技術(shù)［15］等，超分辨率熒光顯微技術(shù)打破了光學(xué)系統(tǒng)極限分辨率的限制，將分辨率提高至納米級［16］。將該技術(shù)應(yīng)用于CLEM，通過超分辨單分子技術(shù)觀察目標(biāo)分子，利用電鏡對目標(biāo)位置進行高分辨率成像，最終將定位信息和結(jié)構(gòu)信息進行整合，揭示目標(biāo)分子在細胞中的分布和所處微環(huán)境結(jié)構(gòu)，在研究生物分子轉(zhuǎn)運和膜動態(tài)變化等過程中具有十分重要的作用［17］。

2 CLEM探針的種類

常規(guī)CLEM，首先使用光學(xué)顯微鏡對樣品進行定位，然后在電子顯微鏡中成像。但是，通常電鏡制樣會使有機熒光團淬滅。此外，還可能引入偽像，使光鏡和電鏡圖像之間的配準(zhǔn)復(fù)雜化。最近幾年報道了多種適用于CLEM的探針，可在保持電鏡電子對比度的同時保留熒光信號，而且會降低在不同顯微鏡之間轉(zhuǎn)換時引入偽像的幾率。根據(jù)探針標(biāo)記的不同，將CLEM探針分為如表1 所示的3種類型［18］。

表1 光電關(guān)聯(lián)探針Table 1 CLEM probes

2.1 真空穩(wěn)定的熒光探針

這類探針在電子顯微鏡的真空環(huán)境中穩(wěn)定且具有活性。其中常用的熒光探針，如DNA特異性熒光探針 ：4′， 6-二脒基 -2-苯基吲哚（4′， 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）和Alexa Fluor系列染料等已證明適用于CLEM［19-20］。這類熒光探針通過與靶結(jié)構(gòu)直接結(jié)合或者與抗體結(jié)合來進行定位，既可以在活細胞中用作示蹤劑，也能對固定細胞進行標(biāo)記，還可以在超薄樹脂切片或蔗糖包埋冷凍切片（Tokuyasu）上進行亞細胞定位。由于它們沒有固有的電子對比度，在電鏡中觀察不到，只能通過熒光信號的位置與電子圖像的疊加，實現(xiàn)光電圖像關(guān)聯(lián)［18］。

2.2 無機雙對比探針

當(dāng)所觀察的細胞器體積小且數(shù)量多時，在熒光圖像和電鏡切片中追蹤相同的結(jié)構(gòu)會比較困難。無機雙對比探針可以在光鏡和電鏡中直接成像，提高了電子顯微鏡中的定位精度。這類探針包含熒光納米金和量子點［18］。

2.2.1 熒光納米金（fluoronanogold，F(xiàn)NG） 熒光納米金是一種雙功能探針，在光鏡和電鏡中均能夠被觀察到。由抗體Fab片段（賦予分子選擇性，實現(xiàn)精確定位）和一個小的金簇（為電鏡檢測提供了電子致密結(jié)構(gòu)）和熒光染料（用于熒光顯微鏡檢測）組成［21-22］。FNG足夠小，比較容易滲透進入細胞內(nèi)，因此不破壞細胞膜結(jié)構(gòu)便可以用于標(biāo)記細胞內(nèi)的分子［18，23］。

2.2.2 量子點（quantum dots，QDs） 量子點是一種納米材料，具有良好的光穩(wěn)定性，不易發(fā)生光漂白，能夠反復(fù)成像。量子點的大小以及電子密度特性適合用于電鏡成像，所以，可作為CLEM的探針。此外，量子點的體積與其光吸收和發(fā)射特點相關(guān)，可以通過改變量子點的大小獲得不同波長范圍的光譜，這為同時標(biāo)記多種蛋白質(zhì)提供了可能［4，24］。利用這些特性，可以先在低分辨率光鏡下觀察特定蛋白的分布，然后通過電鏡，在高分辨率下更準(zhǔn)確地定位相同標(biāo)簽的蛋白［23］。

2.3 基因編碼的熒光探針

2.3.1 雙砷染料-四半胱氨酸系統(tǒng)（tetracysteinebiarsenical） 雙砷染料-四半胱氨酸探針系統(tǒng)是通過含有雙砷的熒光團與四半胱氨酸序列相互作用而標(biāo)記目標(biāo)蛋白。雙砷熒光團是二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）依賴的探針，當(dāng)它與含有四半胱氨酸的寡肽標(biāo)簽結(jié)合時，形成具有強熒光的雙砷-四半胱氨酸復(fù)合物，可于光鏡下進行觀察。四半胱氨酸序列為-CCXXCC-，其中X指除半胱氨酸外的任何氨基酸［25］，當(dāng)XX為脯氨酸和甘氨酸，即序列為CCPGCC時，其與雙砷化合物結(jié)合具有更強的特異性［26］。

四半胱氨酸基序可以利用遺傳編碼獲得，通過表達帶有四半胱氨酸標(biāo)記的目的蛋白來顯示各種細胞組分。目前已經(jīng)開發(fā)了多種雙砷染料，其中主要有FlAsH和ReAsH雙砷染料，它們是細胞通透性的，當(dāng)它們與目的蛋白上連接的四半胱氨酸基序結(jié)合時，分別顯示綠色和紅色熒光。因此，在培養(yǎng)基中加入生物砷探針后，該系統(tǒng)可以跟蹤標(biāo)記蛋白在活細胞中的運動［27-28］。此外，這些標(biāo)簽產(chǎn)生的活性氧可作用于DAB，形成高電子密度的聚合物，因此信號可以很容易地在電鏡下被檢測到［29］。

2.3.2 小型單線態(tài)氧氣發(fā)生器（mini singlet oxygen generator，MiniSOG） MiniSOG通過改造植物擬南芥向光色素-2（phototropin-2）而獲得，其大小約為15 kD，分子量僅為GFP的一半，MiniSOG可以在細胞中表達。通過表達MiniSOG和目標(biāo)蛋白的融合蛋白，對活細胞中目標(biāo)蛋白進行可視化［30］。Mini SOG在藍光照射下高效生成單線態(tài)氧，可以氧化DAB形成電鏡下可見的嗜鋨小體，從而被電鏡檢測到，是一種方便、強大的CLEM探針。

2.3.3 增強型抗壞血酸過氧化物酶（enhanced ascorbate peroxidase，APEX） APEX是一種可用于電鏡（electron microscopy，EM）水平上的蛋白質(zhì)標(biāo)記。它編碼過氧化物酶，在H2O2存在下，催化DAB氧化聚合，形成光學(xué)顯微鏡可以檢測的產(chǎn)物，可以在電子顯微鏡制備之前篩選樣本。目前，APEX已被成功用于定位蛋白，但其檢測靈敏度有局限，一些低水平表達的蛋白檢測不到。通過對其改進而得到APEX2，靈敏度顯著提高。當(dāng)APEX與GFP或其他熒光蛋白結(jié)合時，可在活細胞中表達出熒光信號，經(jīng)過化學(xué)固定和添加DAB和H2O2，可以產(chǎn)生EM可見的反應(yīng)產(chǎn)物，可應(yīng)用于活細胞延時成像和CLEM［31-32］。

2.3.4 綠 色 熒 光 蛋 白（green fluorescent protein，GFP）及其衍生物 GFP常常用于DAB介導(dǎo)的光電關(guān)聯(lián)。將目標(biāo)蛋白與GFP蛋白融合表達，漂白感興趣區(qū)域的GFP熒光能夠產(chǎn)生單線態(tài)氧，所產(chǎn)生的單線態(tài)氧作用于DAB形成聚合物［29］，因此，利用這一性質(zhì)，實現(xiàn)在光鏡和電鏡目標(biāo)區(qū)域的關(guān)聯(lián)定位［33］。由于GFP產(chǎn)生單線態(tài)氧的效率比較低，因此，該方法運用過程中存在一定困難。GFP衍生物如黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）也可應(yīng)用于 CLEM 成像［34］。

采用GFP融合蛋白免疫膠體金標(biāo)記的方法，可以提供便于光電關(guān)聯(lián)的高對比度電鏡圖像，但相比DAB介導(dǎo)的方法，該方法需要進行膜的透化處理，容易導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的破壞。結(jié)合甲基丙烯酸酯（glycol methacrylate，GMA）低溫包埋的方法，以及Tokuyasu制樣方法，均可以很好地保護GFP熒光，可以實現(xiàn)細胞超微結(jié)構(gòu)的光電聯(lián)用觀察。GMA包埋的方法中，當(dāng)切片為250 nm時，GFP信噪比明顯提高，該方法還可與高壓冷凍固定兼容，避免了化學(xué)固定可能帶來的假象。Tokuyasu方法中，80 nm 的切片便可以檢測到足夠的熒光信號，使目的區(qū)域形態(tài)結(jié)構(gòu)可視化，從而實現(xiàn)了光鏡電鏡圖像的關(guān)聯(lián)［35］。

2.3.5 FerriTag FerriTag是一種基因編碼的化學(xué)誘導(dǎo)探針，近來被開發(fā)應(yīng)用于光電關(guān)聯(lián)。FerriTag將熒光重組電子致密的鐵蛋白顆粒與感興趣的蛋白連接，通過雷帕霉素誘導(dǎo)系統(tǒng)表達，實現(xiàn)了在光鏡下的熒光成像，以及電鏡下的直接觀察。該方法成功應(yīng)用于標(biāo)記細胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)，包括線粒體，質(zhì)膜，網(wǎng)格蛋白包被小泡和液泡等相關(guān)的蛋白質(zhì)。FerriTag具有較高的信噪比，標(biāo)記分辨率可以達到10 nm，將其作為標(biāo)記探針，在納米尺度上實現(xiàn)了蛋白在亞細胞結(jié)構(gòu)的定位［36］。

2.3.6 光轉(zhuǎn)換熒光蛋白mEos mEos是一種可以抗鋨酸固定和Epon包埋的光轉(zhuǎn)換熒光蛋白，該熒光蛋白在電鏡制樣后仍然保持熒光并具有光開關(guān)活性。目前，有許多種經(jīng)過改造的mEos衍生物如：mEos2、mEos3.1/3.2及mEos4等，均有助于活體和輕度固定樣品的成像［37］。Fu等［38］通過優(yōu)化超薄切片中單分子定位算法和成像方法，利用mEosEM首次實現(xiàn)了Epon后固定電鏡樣品的同層超分辨光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)成像。由于該探針沒有顯著的天然電子對比度，因此，光電關(guān)聯(lián)通過光鏡和電鏡圖像的疊加而實現(xiàn)［18］。

3 光電關(guān)聯(lián)樣品制備與圖像關(guān)聯(lián)

根據(jù)實驗具體需要，可以選擇前包埋光電聯(lián)用或者后包埋光電聯(lián)用成像。前包埋光電聯(lián)用成像方法首先使用共聚焦等光學(xué)顯微鏡觀察活細胞或者固定后細胞的熒光圖像，獲得較大范圍的光學(xué)成像數(shù)據(jù)，然后將成像后的樣品進行脫水、包埋、切片、染色等處理，使用電子顯微鏡成像獲得細胞的局部結(jié)構(gòu)特征［39-40］。上述過程中，光學(xué)顯微鏡檢測的是包埋前的整個細胞，而電鏡檢測的則為包埋后細胞的一個切面，所以這種方法雖然能夠獲得較強的熒光信號，但是容易導(dǎo)致整體細胞的光鏡圖像與超薄切片的電鏡圖像關(guān)聯(lián)不準(zhǔn)［23，41-42］。

后包埋光電聯(lián)用成像是將樣品處理后，獲得切片，然后通過光鏡成像定位蛋白的分布，再利用電鏡切片檢測超微結(jié)構(gòu)。這種方式可以使用連續(xù)切片分別進行光鏡和電鏡成像，也可以使用同一切片先后進行光鏡和電鏡成像。從樣品中獲取連續(xù)切片，可以根據(jù)需要獲得不同厚度的切片進行不同類型的成像。比如半薄切片厚度較大，具有較好的成像反差及標(biāo)記效率，可以先通過半薄切片在光鏡中觀察確定成像目標(biāo)，再使用電鏡對對應(yīng)的超薄切片的目標(biāo)區(qū)域進行高分辨率成像，這樣可以兼顧光鏡標(biāo)記效率和關(guān)聯(lián)的準(zhǔn)確度，但是標(biāo)記的蛋白也并非嚴(yán)格一致［43-44］。使用同一切片進行光電關(guān)聯(lián)成像可以保證成像蛋白的一致性，甚至能夠?qū)崿F(xiàn)超薄切片熒光標(biāo)記結(jié)構(gòu)與超微結(jié)構(gòu)納米水平的關(guān)聯(lián)，但是由于光鏡標(biāo)記的需要，一般無法使用高濃度的戊二醛及鋨酸固定，電鏡成像的分辨率較差，Johnson等［45］對其進行改進，通過高壓冷凍、冷凍替代后樹脂包埋的方法，保留了mGFP、mVenus 以及 mRuby2等熒光蛋白的熒光和光控特性，實現(xiàn)了超薄切片熒光標(biāo)記結(jié)構(gòu)與電鏡超微結(jié)構(gòu)納米水平的關(guān)聯(lián)，然而，該方法無法保證電鏡成像中的圖像襯度。近來，F(xiàn)u等［38］借助于新型抗鋨酸固定和Epon包埋的探針mEosEM，實現(xiàn)了對同一切片的超分辨光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)成像，這種方式有利于保持細胞超微結(jié)構(gòu)與電鏡圖像質(zhì)量，更容易確定光鏡和電鏡圖像之間的關(guān)系。

利用CLEM得到的光學(xué)圖像需要合適的方法和電鏡的圖像進行關(guān)聯(lián)，從而實現(xiàn)低倍數(shù)的蛋白定位信息導(dǎo)航和高分辨結(jié)構(gòu)信息觀察的整合。目前圖像關(guān)聯(lián)主要有以下3種方式：第一，利用細胞特征結(jié)構(gòu)進行關(guān)聯(lián)。細胞中部分結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)特征明顯，例如：脂滴，在光鏡和電鏡中都可見，所以可將該結(jié)構(gòu)作為基準(zhǔn)，實現(xiàn)光電圖像對照關(guān)聯(lián)［42］；第二，利用標(biāo)記物進行關(guān)聯(lián)。探針標(biāo)記的改進，使得標(biāo)記物在光鏡和電鏡中都可以觀察到，這極大地促進了圖像的關(guān)聯(lián)效率，而且定位的信息也更加直觀而準(zhǔn)確［18］；第三，商業(yè)軟件關(guān)聯(lián)。由于CLEM技術(shù)的應(yīng)用逐漸廣泛，用于光鏡和電鏡圖像重疊定位的軟件也應(yīng)運而生，可以直接應(yīng)用軟件實現(xiàn)圖像自動校準(zhǔn)［46］。

4 CLEM在植物學(xué)研究中的應(yīng)用

近年來，CLEM在動物和植物研究領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用，主要用于檢測亞細胞結(jié)構(gòu)、生物大分子精確定位和動態(tài)運輸、以及分析病原體侵染等過程。植物細胞相對動物細胞結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，首先，植物細胞具有細胞壁，固定液穿透速度更慢，標(biāo)記過程也變得更為復(fù)雜；其次，植物細胞存在大液泡，緩沖液使用不當(dāng)，會引起液泡收縮，在固定過程中導(dǎo)致質(zhì)壁分離。因此，與動物細胞中的相關(guān)研究相比，在植物領(lǐng)域應(yīng)用CLEM還相對較少［6，36］。以下，對目前在植物中應(yīng)用CLEM研究取得的成果進行總結(jié)，希望可以為后續(xù)研究提供借鑒。

4.1 亞細胞結(jié)構(gòu)與特定結(jié)構(gòu)的觀察

細胞及亞細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能息息相關(guān)，了解這些結(jié)構(gòu)的形態(tài)及組成，對探究該結(jié)構(gòu)的功能有非常重要的作用。隨著光學(xué)顯微鏡的改進，配合使用高分辨率的電子顯微鏡，越來越精細的結(jié)構(gòu)被發(fā)現(xiàn)。采用CLEM，可將定位信息與結(jié)構(gòu)信息相對應(yīng)，獲得單一技術(shù)無法觀察到的信息。在動物研究領(lǐng)域應(yīng)用CLEM，取得了一系列進展，例如：揭示了自噬體的超微結(jié)構(gòu)［42］，發(fā)現(xiàn)了線粒體中特殊結(jié)構(gòu)的嵴［47］，重建了黏著斑的三維結(jié)構(gòu)［48］以及發(fā)現(xiàn)了包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白在內(nèi)的一系列蛋白質(zhì)與超微結(jié)構(gòu)的關(guān)系等［49］。

在植物組織中，部分結(jié)構(gòu)由于位置特殊或者結(jié)構(gòu)復(fù)雜，利用單一的顯微手段不易觀察完整結(jié)構(gòu)信息，因此運用CLEM觀察特定的結(jié)構(gòu)在植物研究領(lǐng)域有較多的應(yīng)用。例如，韌皮部細胞較小，它們在植物器官中的位置特別，識別韌皮部的細胞類型在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性。Bell等［50］對熒光標(biāo)記及固定技術(shù)進行了改進，利用共聚焦顯微鏡，對目標(biāo)區(qū)域進行檢測和定位，通過透射電鏡，觀察到部分篩孔和沉積的胼胝質(zhì)環(huán)的高分辨結(jié)構(gòu)，最后利用三維結(jié)構(gòu)照明顯微鏡（3D structured illumination microscopy，3D-SIM），觀察到完整的篩孔結(jié)構(gòu)及周圍的纖維素環(huán)，3種成像方式相互結(jié)合，共同揭示了篩孔結(jié)構(gòu)和胼胝質(zhì)沉積的關(guān)系。Schroeder等［51］運用熒光納米金標(biāo)記，結(jié)合光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡，對風(fēng)信子分裂過程中的一對染色體上突出的釘狀結(jié)構(gòu)進行研究，將染色體與帶有熒光基團的45S rDNA探針雜交，使用熒光顯微鏡定位成像，篩選目標(biāo)細胞，然后用掃描電鏡進行高分辨成像，證明染色體上的釘狀結(jié)構(gòu)是核仁組織區(qū)。此外，針葉樹水和礦物質(zhì)運輸主要通過管胞壁上的具緣紋孔，具緣紋孔的紋孔膜中央有一個圓盤狀富含果膠的增厚區(qū)域，即紋孔塞。West等［52］用酶處理木材以提高木材滲透性，使用光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)被染色的果膠物質(zhì)褪色，認為紋孔塞已被破壞。然而，利用掃描電子顯微鏡觀察相同區(qū)域發(fā)現(xiàn)，許多未染色的具緣紋孔在掃描電鏡下可見完整但經(jīng)修飾的紋孔塞，因此，結(jié)合兩種顯微技術(shù)能夠提供更完整的信息，可以防止錯誤的結(jié)論。Hertle等［53］利用共聚焦顯微鏡和電子顯微鏡觀察了嫁接植物結(jié)合處及基于愈傷組織嫁接后融合的細胞壁，闡明了植物水平基因組轉(zhuǎn)移事件的細胞學(xué)機制，揭示了植物細胞間的轉(zhuǎn)運途徑，通過該途徑，細胞間實現(xiàn)了基因、結(jié)構(gòu)（包括整個質(zhì)體）的交換。通過熒光顯微鏡和場發(fā)射掃描電子顯微鏡關(guān)聯(lián)，Neumann等［54］對豌豆（Pisum Sativum）的著絲粒結(jié)構(gòu)進行了高分辨率研究。他們使用熒光納米金作為標(biāo)記探針，發(fā)現(xiàn)著絲粒結(jié)構(gòu)域的組織和DNA組成比之前認為的要復(fù)雜得多，拓展了人們對于全著絲粒染色體的了解。

近年來，針對CLEM植物超微結(jié)構(gòu)成像進行了技術(shù)改進。光學(xué)顯微鏡的分辨率有了很大的提高，但對于更高分辨率的結(jié)構(gòu)分析，電子顯微鏡仍然是很好的選擇，傳統(tǒng)的植物組織制備技術(shù)通常需要較長固定時間和使用有毒的固定劑，存在細胞結(jié)構(gòu)變形等缺點。Pfeiffer［55］等采用高壓冷凍、冷凍替代、低溫包埋等一系列改進的制備方法，其中番紅O作為低溫脫水過程中的固定劑，同時也可以作為染料使細胞成分著色，使用激光掃描共聚焦顯微鏡和透射電鏡對豌豆和大麥葉片進行觀察，發(fā)現(xiàn)細胞精細結(jié)構(gòu)和細胞組分的抗原性都得到了很好的保護，為植物樣品的制備提供了借鑒。此外，Rizzo等［56］研究了一種低壓背散射電子成像技術(shù)，結(jié)合光鏡和掃描電子顯微鏡對大豆葉片組織和玉米籽粒的切片進行成像，發(fā)現(xiàn)可以在130-70 000倍的連續(xù)放大倍數(shù)下進行觀察，可記錄組織和亞細胞的超微結(jié)構(gòu)細節(jié)，可觀察到7 mm×10 mm切片大小范圍內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，明顯大于傳統(tǒng)透射電子顯微鏡0.2 mm×0.3 mm的切片大小，而且易于進行免疫定位。

4.2 蛋白質(zhì)在亞細胞結(jié)構(gòu)的精細定位分析

在細胞的生命周期中，蛋白質(zhì)處于不斷運動，修飾，合成和降解的過程。細胞生命活動在時間和空間上高度有序，蛋白質(zhì)在特定時間會出現(xiàn)在特定空間，其正確定位是行使功能的必要條件。研究蛋白質(zhì)的精確亞細胞定位是解析其生物學(xué)功能的重要依據(jù)之一。在動物中已經(jīng)進行了大量研究，Liu等［57］利用超高分辨熒光顯微鏡和冷凍電鏡的超分辨能力，觀察到線粒體蛋白與線粒體外膜在三維納米分辨率下具有良好的相關(guān)性。Watanabe等［58］將STED或PALM與電鏡相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)3種蛋白質(zhì)在細胞器上的精確定位。Zhen等［59］發(fā)現(xiàn)參與介導(dǎo)吞噬體形成的兩種重要蛋白質(zhì)。

植物細胞中，運用CLEM技術(shù)，同樣解析了部分蛋白的精細定位。植物胞間連絲是一種納米級的細胞間通訊通道，利用熒光顯微鏡可以觀察感興趣的蛋白質(zhì)是否定位于胞間連絲或與胞間連絲結(jié)構(gòu)域相關(guān)。然而，由于胞間連絲是納米級尺寸的結(jié)構(gòu)，熒光信號只能作為散布在細胞外圍的小斑點被檢測到，不能實現(xiàn)精確定位。Modla等［60］將表達GFP標(biāo)記的胞間連絲定位蛋白，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，隨后，對標(biāo)記的目標(biāo)切片進行透射電鏡分析，使用合適的圖像軟件將采集的光電圖像對準(zhǔn)，通過使用這種方法，光鏡下的熒光散斑與電鏡下的單個或聚集的胞間連絲蛋白之間實現(xiàn)了明確的關(guān)聯(lián)。此外，El-Kasmi等［61］用激光共聚焦顯微鏡和透射電鏡對擬南芥sec22突變體的花粉進行研究，運用免疫膠體金標(biāo)記蛋白發(fā)現(xiàn)，SEC22蛋白對早期分泌過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的膜融合起重要作用。

4.3 囊泡運輸

細胞中各種生理生化反應(yīng)的有序進行離不開廣泛分布的生物膜系統(tǒng)。細胞中營養(yǎng)吸收、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、突觸小泡循環(huán)和免疫反應(yīng)等生命活動，通常借助于膜的更新與重構(gòu)，利用囊泡運輸進行物質(zhì)傳遞。CLEM方法廣泛應(yīng)用于研究酵母和動物細胞的膜運輸和細胞器動態(tài)［62］。其中，利用光鏡結(jié)合電子斷層掃描技術(shù)，Kukulski等［63］揭示了胞吞蛋白募集以及解離過程中，膜形狀的變化，Avinoam等［40］發(fā)現(xiàn)網(wǎng)格蛋白在內(nèi)吞過程中，首先募集到平坦的膜上，隨后再根據(jù)膜的形狀發(fā)生重塑，F(xiàn)ranke等［64］發(fā)現(xiàn)了內(nèi)體在不同細胞器間的囊泡運輸過程。

反面高爾基體網(wǎng)絡(luò)（trans-golgi network，TGN）是由高爾基體衍生而來的多功能細胞器，是細胞膜運輸?shù)臉屑~，對分泌和內(nèi)吞兩條途徑都有貢獻。植物中的TGN還具有早期內(nèi)體的功能。因此，植物細胞中不僅有與高爾基體相關(guān)的TGN，還有散布在細胞質(zhì)中的游離TGN。Wang等［65］使用熒光顯微鏡和透射電鏡分析了擬南芥根尖細胞中的TGN分布范圍及其超微結(jié)構(gòu)，首先利用熒光顯微鏡定位了GFP標(biāo)記的TGN相關(guān)蛋白，然后使用透射電鏡觀察了在切片中有熒光標(biāo)記的TGN囊泡，確定其超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)TGN亞群確實存在異質(zhì)性，為今后研究植物TGN結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了基礎(chǔ)。

4.4 植物免疫研究

植物在長期的進化過程中，形成了抵抗病原菌和昆蟲的能力，刺激或強化植物的免疫系統(tǒng)，可以提高植物對病蟲害的抗性。此外，植物與其生長環(huán)境中的微生物關(guān)系密切，形成了植物-微生物共生體系，植物影響著周圍和體內(nèi)的微生物群落，微生物也通過生命活動影響植物的生長發(fā)育。光鏡和電鏡的使用促進了植物免疫研究的進程。其中，電子顯微鏡特有的高分辨率，在植物病害檢測，超微結(jié)構(gòu)及形態(tài)觀察中發(fā)揮了重要作用［66］。

植物在與昆蟲長期相互作用過程中，進化出了抵抗昆蟲的能力。麥二叉蚜在小麥葉片上的取食部位會形成壞死點，周圍會出現(xiàn)褪綠光暈。這種相互作用的植物組織學(xué)特征雖然在很早之前就開始研究，但分辨率及觀察技術(shù)受到限制，機制尚不清楚。Ledford等［67］利用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡，觀察了小麥葉片橫截面上的紋狀體鞘和組織損傷。在光鏡下，發(fā)現(xiàn)填充蚜蟲損傷的外層維管束鞘細胞管腔的單一物質(zhì)為黃褐色，通過掃描電鏡進一步發(fā)現(xiàn)，它可能是聚合體。這種物質(zhì)的后續(xù)化學(xué)鑒定可能會揭示蚜蟲與敏感小麥組織之間相互作用的本質(zhì)，為植物和昆蟲相互作用中涉及的三維關(guān)系提供更加清晰的證據(jù)。

植物還參與微生物互作。Lucas等［68］利用CLEM研究了根瘤菌對豆科植物的定植過程，通過光學(xué)顯微鏡，可以看到植物中有細菌定植和未定植兩類細胞，細菌未定植的細胞中，幾乎沒有熒光信號或僅有幾個熒光“斑點”，這類細胞中通常含有大液泡。聚焦離子束掃描電鏡結(jié)果證明了熒光信號與細菌的有無或大液泡的存在與否直接相關(guān)，這為研究植物和細菌相互作用關(guān)系提供了方案，同時為大體積樣品的研究提供了借鑒。細胞器間的聯(lián)系對于先天免疫反應(yīng)至關(guān)重要，參與了病原體防御過程。葉綠體作為防御素分子的主要產(chǎn)生場所，在防御過程中如何與其他細胞器進行溝通和協(xié)調(diào)，人們還知之甚少。Caplan等［69］發(fā)現(xiàn)植物在進行先天免疫或應(yīng)答外源防御信號過程中，葉綠體會產(chǎn)生動態(tài)的延伸小管，即基質(zhì)小管，在細胞核周圍有大量的基質(zhì)小管存在。運用共聚焦和透射電鏡圖像疊加確定了葉綠體到細胞核連接的位置和類型，揭示了基質(zhì)小管有助于將防御信號放大和/或傳輸?shù)郊毎撕推渌麃喖毎Y(jié)構(gòu)。近來，Liu等［70］利用熒光顯微鏡、二次離子質(zhì)譜、X射線光電子能譜以及掃描電子顯微鏡，首次對于短柄草及其與典型的促植物生長細菌Pseudomonas SW25間的相互作用進行了關(guān)聯(lián)成像，為揭示植物-微生物復(fù)雜相互作用提供了策略，有助于預(yù)測和調(diào)控根際相互作用。

5 展望

CLEM結(jié)合了不同類型的光鏡和電鏡，實現(xiàn)了各自成像優(yōu)勢的疊加，能夠同時獲得光鏡下定位信息和電鏡下高分辨結(jié)構(gòu)信息。該技術(shù)具有一系列優(yōu)勢：首先，超分辨率熒光顯微技術(shù)的出現(xiàn)，突破了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨極限，同時，電子成像技術(shù)種類也越來越豐富，觀察結(jié)果更清晰和深入；其次，冷凍技術(shù)的出現(xiàn)，樣品處理更接近真實狀態(tài)，也有益于保護熒光基團，使原位細胞結(jié)構(gòu)成像成為可能；最后，探針種類的改進使光鏡和電鏡之間的關(guān)聯(lián)成像更容易，這些技術(shù)的進步都極大地促進了CLEM的應(yīng)用。但是，要做到準(zhǔn)確的光電關(guān)聯(lián)需要平衡可見視場與分辨率、熒光基團的保護與電子襯度、成像速度與體積、樣品大小與真實狀態(tài)的保存，成像時間以及圖像分辨率等之間的關(guān)系。CLEM的發(fā)展迅速，但依然面臨很大挑戰(zhàn)。一方面要盡量減少由輻射損傷和光電轉(zhuǎn)換造成的偽影；另一方面，仍需要進一步改進探針和包埋樹脂，以盡可能在電鏡制樣中保存熒光基團的發(fā)光特性，實現(xiàn)光鏡電鏡直接成像。伴隨著冷凍光電關(guān)聯(lián)顯微技術(shù)的發(fā)展，冷凍條件下具有更高定位精度的熒光探針的選擇與優(yōu)化仍具有很大的空間。此外，CLEM制樣相對耗時且較難，急需優(yōu)化樣品準(zhǔn)備與光電轉(zhuǎn)換的流程，提高可重復(fù)性。

對于植物而言，其組織樣本比較厚，細胞體積較大，其厚的細胞壁阻礙了固定液的進入。高壓冷凍技術(shù)可以用于冷凍固定比較厚的樣品，考慮到植物樣品富含水份的大液泡常常由于得不到徹底冷凍而形成冰晶，可以通過使用葡聚糖冷凍保護劑，實現(xiàn)對于植物樣品的較好固定。隨后進行冷凍切片并在冷凍熒光顯微系統(tǒng)中成像、冷凍電鏡下觀察，或者冷凍替代后制備常溫樣品，進行常溫下光電成像實現(xiàn)光電關(guān)聯(lián)。光電關(guān)聯(lián)顯微鏡技術(shù)利用熒光成像實現(xiàn)目標(biāo)生物大分子的特異性標(biāo)記和定位識別，利用電子顯微鏡實現(xiàn)定位區(qū)域的精細解析，有助于在更多尺度和更加動態(tài)的水平探究植物生物學(xué)問題。借助CLEM，目前已經(jīng)實現(xiàn)了精確分析植物亞細胞結(jié)構(gòu)與特定結(jié)構(gòu)、準(zhǔn)確確定蛋白質(zhì)亞細胞定位，明確TGN囊泡的異質(zhì)性，并且為植物與病原微生物和昆蟲的互作提供了直接清晰的證據(jù)。科技的發(fā)展日新月異，近來冷凍超分辨光電關(guān)聯(lián)技術(shù)、超低溫超高分辨率熒光顯微鏡關(guān)聯(lián)聚焦離子束掃描電子顯微鏡技術(shù)等在動物細胞研究中取得了長足的進展，相信隨著未來CLEM的改進，這些技術(shù)有望應(yīng)用于植物細胞，極大地促進植物生物學(xué)的發(fā)展。