超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定鐵皮石斛中的吡咯里西啶生物堿

賈寧，曾紹東，陳吳海，郭宏斌，葉劍芝，林玲，楊春亮

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）（2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 湛江 524001）

鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）為蘭科石斛屬草本植物，是一種名貴中藥材，具有滋陰清熱、益胃生津等功效[1，2]，在我國云南、浙江以及安徽等地均有分布。鐵皮石斛中含有豐富的多糖、生物堿、氨基酸以及微量元素，具有抗腫瘤、抗衰老、降血糖以及增強(qiáng)免疫力等作用[3]。2018年鐵皮石斛被正式批準(zhǔn)為“既是食品又是藥品的物質(zhì)”，隨著藥食同源理論在鐵皮石斛中的應(yīng)用，其被開發(fā)為多種功能性食品[4]，因此對鐵皮石斛中風(fēng)險因子的監(jiān)測值得關(guān)注。

吡咯里西啶生物堿（Pyrrolizidine alkaloids，PAs）是植物為抵御食草性動物等的侵害而合成的一種天然毒素，也是典型的植物次生代謝物[5]。據(jù)統(tǒng)計，全球約3%的有花植物中含有該類生物堿，PAs主要分布于蘭科、菊科、豆科和紫草科等13個科[6]。目前已在6000余種植物中分離鑒定出多達(dá)660種PAs及其氮氧化物（PANOs）[7，8]，大約50%以上都具有毒性，尤其不飽和PAs對人體具有顯著的毒性（包括肝毒性、肺毒性、致突變、致癌性以及遺傳毒性等）[9-12]。近年來，在澳大利亞、俄羅斯、阿富汗、印度和美國等國家均有報道，因食用含PAs的中草藥、茶或被PAs污染的食物（如牛奶、蜂蜜、谷物或肉類等），從而導(dǎo)致人畜中毒的事件時有發(fā)生，此現(xiàn)象已經(jīng)引起各國食品藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)以及研究學(xué)者的高度關(guān)注[13]。

目前對鐵皮石斛中風(fēng)險因子的研究主要集中于重金屬、農(nóng)藥殘留等外源性因素[14]，而對其內(nèi)源性風(fēng)險因子的研究極少，對鐵皮石斛中PAs的研究尚屬空白。關(guān)于 PAs的檢測方法并不多，一般都是針對蜂蜜[15-18]和傳統(tǒng)中草藥[19-22]。常見的 PAs檢測分析方法包括分光光度法[7，8]、酶聯(lián)免疫法（ELISA）[23]、核磁共振法（NMR）[24]、高效液相色譜法（HPLC）[25]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）[26]等。其中基于顯色反應(yīng)的分光光度法僅可檢測PAs總量，無法對單個PAs定量[8]；ELISA可對結(jié)構(gòu)上相關(guān)的PAs進(jìn)行檢測分析，但無法對多種PAs進(jìn)行定量[23]；NMR和HPLC靈敏度較低，不適用于復(fù)雜基質(zhì)中PAs的痕量分析[24，25]。GC-MS可用于PAs的定性定量分析，但PANOs無揮發(fā)性，不能直接用GC分析，需經(jīng)前處理將PANO還原為相應(yīng)的PAs，從而進(jìn)一步分析[25]。LC-MS可同時檢測PAs和PANOs，且具有靈敏度高、選擇性好、檢出限低和適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，而成為目前PAs檢測方法中最主要的方法[26]。

本研究建立了固相萃取（SPE）結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）檢測鐵皮石斛中藍(lán)薊定（Echimidine，Em）、藍(lán)薊定-氮氧化物（Echimidine-N-oxide，EmN）、芝麻菜葉千里光堿（Erucifoline，Er）、芝麻菜葉千里光堿-氮氧化物（Erucifoline-N-oxide，ErN）、歐天芥菜堿（Europine，Eu）、歐天芥菜堿-氮氧化物（Europine-N-oxide，EuN）、天芥菜堿（Heliotrine，He）、天芥菜堿-氮氧化物（Heliotrine-N-oxide，HeN）、毛果天芥菜堿（Lasiocarpine，Lc）、毛果天芥菜堿-氮氧化物（Lasiocarpine-N-oxide，LcN）、野百合堿（Monocrotaline，Mc）、千里光菲靈堿（Seneciphylline，Sp）、千里光菲靈堿-氮氧化物（Seneciphylline-N-oxide，SpN）、克氏千里光堿（Senkirkine，Sk）、毛束草堿（Trichodesmine，Td）和 7-乙酰石松胺（7-Acetyllycopsamine，7-Ly）等 16種不飽和PAs及PANOs（如圖1所示）含量的方法，以期能為鐵皮石斛質(zhì)量監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：藍(lán)薊定（批號 12430）、藍(lán)薊定-氮氧化物（批號12431）、芝麻菜葉千里光堿（批號12640）、芝麻菜葉千里光堿-氮氧化物（批號 12642）、歐天芥菜堿（批號 12456）、歐天芥菜堿-氮氧化物（批號12636）、天芥菜堿（批號 13386）、天芥菜堿-氮氧化物（批號13485）、毛果天芥菜堿（批號13865）、毛果天芥菜堿-氮氧化物（批號 12395）、野百合堿（批號13347）、千里光菲靈堿（批號11783）、千里光菲靈堿-氮氧化物（批號13878）、克氏千里光堿（批號11964）、毛束草堿（批號10722）、7-乙酰石松胺（批號12176）均購自德國phytolab公司，色譜純，純度均≥95%；甲醇、乙腈（色譜純），德國 Merck公司；甲酸（色譜純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲酸銨（色譜純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；硫酸（98%），鄒平化工有限公司；氨水（25%～28%），廣東光華科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

鐵皮石斛樣品20份，分別購買自廣東省湛江市超市、農(nóng)貿(mào)市場和藥店。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC-TQS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Waters公司；ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）ZORBAX LC column（p/n 186002350），美國Waters公司；BJ-750A型粉碎機(jī)，上海拜杰實(shí)業(yè)有限公司；E120H超聲儀，德國ELMA公司；正壓型固相萃取裝置，美國 Supelco公司；Poly-Sery MCX固相萃取柱500 mg/6 mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；CR22GⅢ離心機(jī)，日本HITACHI公司；Milli Q型超純水器，美國Millipore公司；AUY220型電子分析天平，日本島津公司；N-Evap112型氮吹儀，美國 Organomation Associates公司；MS3型渦旋混合器，德國IKA公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：分別稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解，配制成 1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別量取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇配制成1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-18 ℃保存。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：量取一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白樣品提取液，將溶液稀釋成適用濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 提取溶劑及流動相的配制

0.05 mol/L硫酸-甲醇溶液：量取2.72 mL濃硫酸，加甲醇稀釋至1000 mL，混勻。

0.005 mol/L甲酸銨-0.1%甲酸水溶液：量取1 mL甲酸，加超純水至1000 mL，加入315 mg甲酸銨，混勻。

1.3.3 樣品前處理

稱取2 g樣品粉末于50 mL離心管中，加入20 mL 0.05 mol/L硫酸-甲醇溶液潤濕，在常溫下超聲提取15 min，于10000 r/min離心10 min，取上清液，殘渣重復(fù)提取，合并上清液；將合并后的上清液氮吹濃縮至10 mL左右，備用。

MCX（500 mg/6 mL）固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL 0.05 mol/L硫酸-甲醇溶液活化，取上述10 mL樣品提取液上柱，5 mL甲醇淋洗除雜，10 mL 2.5%氨水-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液并氮吹濃縮至近干，用1 mL 5%甲醇水復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾后供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析測定。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：3 μL；采用梯度洗脫程序分別考察甲醇/乙腈-水體系以及在流動相中添加甲酸、甲酸銨對化合物峰形及響應(yīng)信號的影響，確定最佳的流動相及洗脫條件。

1.3.5 質(zhì)譜條件

在電噴霧離子源正離子模式下（ESI+）進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），毛細(xì)管電壓：1.25 kV，離子源溫度：150 ℃，脫溶劑氣溫度：500 ℃，脫溶劑氣流量：800 L/h。將0.05 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀中，對錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳測定條件。以待測物的準(zhǔn)分子離子峰為母離子，通過優(yōu)化最佳碰撞能，找出信號較強(qiáng)的2個特征子離子作為定性離子和定量離子，以確定每種化合物的定性和定量離子對。

1.3.6 方法學(xué)考察

1.3.6.1 空白樣品的選擇

將購買的市售鐵皮石斛樣品按 1.3.3方法處理，在最佳UPLC-MS/MS條件下進(jìn)行測定，選擇無16種PAs特征峰且對目標(biāo)物干擾較小的空白樣品作為空白基質(zhì)。

1.3.6.2 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）根據(jù)對目標(biāo)物響應(yīng)信號的升高或降低，可分為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和減弱效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用提取凈化后添加標(biāo)液法考察基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)計算公式為：

式中：

A——溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；

B——基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

當(dāng) ME＜±10%時，表明基質(zhì)效應(yīng)可忽略，可用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線定量；當(dāng)±10%≤ME≤±50%時，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)或減弱效應(yīng)，需用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量；當(dāng)ME＞±50%時，表明基質(zhì)效應(yīng)很強(qiáng)，需優(yōu)化前處理方法[27]。

1.3.6.3 線性范圍、檢出限和定量限的測定

空白鐵皮石斛樣品經(jīng)1.3.3方法處理后，用提取液將16種PAs的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋，配制成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/L系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。分別以16種PAs定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。以樣品峰響應(yīng)值為 3倍噪音時的添加濃度為方法檢出限（LOD），以10倍噪音時的添加濃度為方法定量限（LOQ）。

1.3.6.4 回收率和精密度的測定

在空白鐵皮石斛樣品中分別添加0.5、1.0、10 μg/kg三個水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個添加水平做6次平行，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采集和處理使用儀器所配置的 Masslynx軟件，圖表采用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的確定

在最佳優(yōu)化條件下，16種PAs均獲得了特征離子對，具體參數(shù)見表1。

表1 16種PAs的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 16 kinds of PAs

2.2 色譜條件的確定

鑒于PAs為堿性物質(zhì)，在質(zhì)譜中以電噴霧正離子電離源（ESI+）檢測。通常ESI+檢測時，流動相中加入酸可促進(jìn)化合物電離以增強(qiáng)質(zhì)譜響應(yīng)，從而提高儀器靈敏度。

多組分分析方法的建立需要兼顧化合物的極性差異，本實(shí)驗(yàn)考查了使用不同的色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、不同的流動相組合：甲醇-水和乙腈-水體系，以及在流動相中添加甲酸、甲酸銨對化合物峰形及響應(yīng)信號的影響。實(shí)驗(yàn)表明：使用ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）對16種PAs有較好的分離效果，采用甲醇（A）和0.005 mol/L甲酸銨-0.1%甲酸水溶液（B）為流動相，在最佳梯度洗脫條件（見表2）下，大多數(shù)PAs有良好的峰形且目標(biāo)化合物區(qū)分度良好，各化合物在出峰位置基本不存在干擾。16種PAs的總離子流圖，如圖2所示。16種PAs的提取離子流圖，如圖3所示。

表2 流動相梯度洗脫程序Table 2 Mobile phase gradient elution procedure

2.3 提取溶劑的選擇

PAs及 PANOs通常共存于植物體內(nèi)，關(guān)于 PAs的提取方法需確保兩者均可被提取[25]。通常使用極性有機(jī)溶劑或稀酸溶液萃取PAs[28，29]。本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、0.05 mol/L硫酸甲醇溶液和0.1 mol/L硫酸甲醇溶液作為提取溶劑時，對鐵皮石斛中PAs回收率的影響（見圖4）。結(jié)果表明，使用甲醇做提取溶劑時，16種PAs的回收率均較低，范圍為41.23%～54.67%；0.05 mol/L硫酸甲醇溶液和0.1 mol/L硫酸甲醇溶液對PAs的回收率范圍分別為 79.46%～108.25%、80.52%～106.83%，回收率較高，提取效果較好，且無明顯差異。

主要是由于PAs為堿性化合物，在酸性條件下易電離，且易溶于甲醇等有機(jī)溶劑。因PAs在0.05 mol/L硫酸甲醇溶液中可充分離子化，與使用0.1 mol/L硫酸甲醇溶液的提取效果相當(dāng)，因此，采用0.05 mol/L硫酸甲醇溶液提取鐵皮石斛中的PAs。

2.4 凈化方式的選擇

采用LC-MS/MS法對PAs定量測定時，通常采取SPE等凈化方式降低背景干擾，減少基質(zhì)效應(yīng)，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[30]。本實(shí)驗(yàn)比較了 C18-SPE柱和MCX-SPE柱對PAs的凈化效果（見圖5）。結(jié)果表明，使用 C18柱對 PAs凈化時，16種 PAs的回收率在57.53%～68.47%之間，未達(dá)到理想的凈化效果；使用MCX柱對PAs凈化時，16種PAs的回收率在78.36%～110.48%之間，凈化效果較好。

這主要是由于MCX小柱是一種混合型陽離子交換固相萃取柱，可提供反相和陽離子交換的雙重保留模式[31]；酸性提取液流經(jīng)小柱，其中鍵合有苯磺酸基的共聚物填料由于離子電荷作用，將目標(biāo)物吸附于填料中，而后在堿性條件下將目標(biāo)物洗脫收集，從而達(dá)到較好的凈化富集效果。本研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了chen等人[22]指出的陽離子固相萃取小柱對PAs的純化富集有良好的效果這一觀點(diǎn)。因此，采用MCX固相萃取小柱對鐵皮石斛中的PAs富集純化。

2.5 方法學(xué)評價

2.5.1 空白樣品的確定

經(jīng)測定，選擇的空白鐵皮石斛樣品作為空白基質(zhì)，如圖6所示。

2.5.2 基質(zhì)效應(yīng)

本研究考察了PAs在鐵皮石斛中的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果表明，16種PAs的ME為-13.65%～-34.80%（見表3）。為消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法進(jìn)行定量。

2.5.3 線性范圍、檢出限和定量限

在優(yōu)化的分析條件下，16種PAs在0.5～20 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，檢出限為 0.06～0.11 μg/kg，定量限為 0.23～0.35 μg/kg。具體數(shù)值見表3。

表3 16種PAs的基質(zhì)效應(yīng)、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Matrix effect， linear equation， correlation coefficient (r2)， LOD and LOQ of 16 kinds of PAs

2.5.4 回收率和精密度

鐵皮石斛中加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在0.5、1.0、10 μg/kg加標(biāo)水平下，16種PAs的回收率為75.38%～110.27%，RSD為2.61%～7.43%（見表4）。表明，該方法準(zhǔn)確度較好，可以滿足檢測要求。

表4 鐵皮石斛中16種PAs加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n=6）Table 4 Recoveries and relative standard deviations (RSD) of 16 kinds of PAs in Dendrobium officinale Kimura et Migo samples (n=6)

2.5.5 實(shí)際樣品的測定

采用本方法對20份鐵皮石斛中的16種PAs進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，其中12份樣品中檢出7-乙酰石松胺，含量為 1.02～6.54 μg/kg。

3 結(jié)論

國內(nèi)外對PAs的研究較少，我國至今沒有PAs相關(guān)的檢測標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過優(yōu)化質(zhì)譜條件和色譜條件，考察提取和凈化方法，建立了 SPE-UPLC-MS/MS法同時測定鐵皮石斛中16種PAs的分析方法。樣品經(jīng)0.05 mol/L硫酸甲醇溶液超聲提取，陽離子固相萃取小柱純化富集，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測分析，在優(yōu)化的質(zhì)譜及色譜條件下，可在16 min內(nèi)有效分離16種PAs，完成儀器檢測分析過程。與已有研究相比，本方法操作簡便，無需使用鋅粉將 PANOs還原為游離PAs后進(jìn)行檢測；結(jié)果準(zhǔn)確可靠，方法學(xué)考察結(jié)果較好，在實(shí)際檢測中具有較強(qiáng)的可操作性，可為制定PAs含量檢測的標(biāo)準(zhǔn)提供一定的依據(jù)。本研究關(guān)注鐵皮石斛中PAs成分，可為鐵皮石斛質(zhì)量安全監(jiān)管提供參考。