綠豆肽功能活性及其在食品中的應(yīng)用進展

安宇 ，馮玉超 ，王長遠 *

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319）（2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319)

綠豆（Vigna radiataL.）是我國傳統(tǒng)的藥食同源性雜糧豆類，在提供基本營養(yǎng)需求的基礎(chǔ)上，綠豆具有很多潛在的健康益處[1，2]，大量研究證實多肽是主要功能成分之一[3]。綠豆肽是綠豆蛋白的水解產(chǎn)物，其氨基酸組成與綠豆蛋白基本相同，主要有蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸和精氨酸，分子量分布一般為1.20～0.10 ku[4]。肽與蛋白相比，雖營養(yǎng)價值相近，但更易被吸收，且具有更多原蛋白沒有的生物活性。作為生物活性小分子，它的開發(fā)及應(yīng)用價值要遠高于蛋白質(zhì)，且具有來源廣、安全性高以及微量高效的特點，這使其成為食品國際學術(shù)領(lǐng)域研究的熱點對象。我國蛋白資源豐富，但真正已開發(fā)的蛋白資源卻不多，仍然面臨蛋白資源短缺的情況，植物蛋白來源廣且應(yīng)用性強，是亟待開發(fā)的優(yōu)質(zhì)資源。綠豆產(chǎn)量高，且為主要食用豆類之一，是優(yōu)質(zhì)的可持續(xù)蛋白質(zhì)來源，含量在20.97%～31.32%[5]，氨基酸特征類似于 FAO/WHO 參考蛋白和大豆蛋白[6-8]，其水解產(chǎn)物綠豆肽安全性高、應(yīng)用范圍廣，可作為功能性成分或添加劑應(yīng)用在食品以及特殊食品中，如具有良好的自由清除基能力，則對機體可延緩衰老[9]；對食品具有延長保質(zhì)期的作用[10]；易吸收且可促進腸道有益菌生長[11，12]，則可制成腸道營養(yǎng)劑，作為消化功能低的人群的輔助營養(yǎng)品等，但目前開發(fā)程度較低，是一種極具Mung Bean（Vigna radiataL.）潛力的新型食源性生物活性肽。綠豆肽在生物體內(nèi)雖以微量存在，但其生理活性卻很顯著，多元化的功能活性也使其成為近年良好植物蛋白精深加工研究的重點對象。

1 綠豆肽的制備

目前綠豆肽的制備主要集中于酶法制備，其中包括單酶水解、復(fù)合酶水解，以及超聲輔助酶法提取，另外還有采用發(fā)酵及化學合成方式進行綠豆肽制備的研究。酶法研究中采用的酶主要集中于中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶[13，14]，還有少量學者采用了無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶[15]，其中堿性蛋白酶制備得到的肽效果最好，在復(fù)合酶水解中堿性蛋白酶也是基礎(chǔ)用酶；而制備指標除水解度（DH）外，也有以目的性指標如抗氧化肽以自由基清除率為指標的制備方法等。酶的類型決定了肽鍵的裂解模式，可影響水解產(chǎn)物的性質(zhì)，此外，水解條件也會對蛋白水解產(chǎn)物的性質(zhì)及生物活性產(chǎn)生影響，故酶法制備中研究者也均進行了工藝參數(shù)優(yōu)化，見表1。在酶法制備綠豆肽的研究中，無論蛋白酶種類是否相同，其水解工藝參數(shù)均存在一定差異，且進一步分離、純化出的肽段大部分分子量也不相同，其水解度在 11.45%～33.95%，不同工藝結(jié)果間相差較大。在酶法制備的基礎(chǔ)上，還可協(xié)同物理法進行綠豆肽的制備，如超聲輔助酶法[16]、熱預(yù)處理及超聲波輔助酶法提取[17]等，制備得到的肽濃度更高，且功能性也顯著增強。對于植物蛋白肽的制備目前多采用物理協(xié)同酶法進行，多集中于超聲波、微波、或者超聲微波協(xié)同萃取，但在綠豆肽的制備上物理法協(xié)同制取的研究還相對較少。以發(fā)酵法及化學合成法制備得到的綠豆肽分別具有產(chǎn)量大（綠豆多肽含量達1397.42 μg/mL）和純度高及目標性強的特點[18，19]，但這兩種方法均鮮有報道，尚不成體系。

表1 酶解法綠豆肽制備工藝情況Table 1 Preparationprocess of mung bean peptides by enzymatic hydrolysis

采用相似的酶解工藝水解綠豆蛋白得到的產(chǎn)物叫法也不統(tǒng)一，當前更多研究者將其稱為綠豆多肽，少部分稱其為綠豆肽、綠豆寡肽、綠豆蛋白水解物（MBPHs）。在實驗操作中的區(qū)別在于是否對其進行分離、純化步驟，而這直接決定了肽的純度、分子量的大小。目前綠豆肽純化的主要的方式有超濾、陰離子交換（AEC）多肽分離、TSK-凝膠尺寸排除色譜、反相高效液相色譜（RP-HPLC）等。雖對綠豆肽的研究目的不一，但是有必要對不同蛋白酶最佳工藝條件以及復(fù)合酶的復(fù)合方式及配比進行細化研究，這對于制備得到的綠豆肽的功能性質(zhì)研究具有重要影響。

2 綠豆肽功能活性

目前綠豆肽功能活性的研究主要集中于抗氧化性、ACE抑制性以及免疫活性，除此之外綠豆肽在解酒、提高細胞存活率、抗癌、對急性肺損傷的保護，提高缺氧耐受力等方面也表現(xiàn)出良好的效果[26-28]。且研究中發(fā)現(xiàn)，分子量越小其功能作用越顯著[29，30]。

2.1 抗氧化活性

綠豆肽的抗氧化性的研究涉及體外抗氧化指標、細胞層次以及小鼠體內(nèi)抗氧化性能的測定。體外抗氧化指標集中于DPPH自由基清除能力、超氧酸根離子（O2-）清除能力、羥基自由基（·OH）清除能力和鐵離子還原能力，而結(jié)果均證實綠豆肽具有顯著的抗氧化活性[31]，且研究發(fā)現(xiàn)采用酶法制備得到的綠豆肽其抗氧化能力要顯著強于發(fā)酵法；細胞層面的研究主要體現(xiàn)在清除細胞內(nèi)活性氧（ROS）、促進超氧化物歧化酶（SOD）分泌、抑制丙二醛（MDA）生成等方面，發(fā)現(xiàn)其功能作用與綠豆肽添加量成劑量依賴關(guān)系，且該作用可能與綠豆肽的疏水性和芳香族氨基酸含量具有相關(guān)性[32]。體內(nèi)研究結(jié)果顯示，綠豆肽可降低小鼠血清和肝臟中MDA含量（約30.16%），可大幅增加SOD（約14.03%）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活力（66.59%）[16，33]，在清除ABTS自由基活性方面也具有一定作用(清除量在90～100 μg抗壞血酸當量/mL)。綠豆肽的抗氧化能力主要取決于水解程度，但目前的研究中對于水解度與抗氧化性關(guān)系的探究并不多，且抗氧化性的研究仍以體外抗氧化指標居多，綠豆肽發(fā)揮該活性的作用機理尚不清晰，有待繼續(xù)探討。

2.2 降血壓活性

從食物蛋白中提取的ACE抑制肽與ACE抑制劑藥物相比具有安全性高，性質(zhì)溫和、無副作用的優(yōu)勢[34]，故植物蛋白 ACE的挖掘與研究成為熱點內(nèi)容。研究發(fā)現(xiàn)綠豆肽的降血壓效果要強于花生肽和大米肽等[29，35]?，F(xiàn)有研究中綠豆肽在體外的ACE抑制活性均可達到89%以上，經(jīng)消化后其活性仍較高，穩(wěn)定性強[29，36，37]；在自發(fā)性高血壓大鼠（187.90±8.70 mmHg 降低 30.80 mmHg）和小鼠體內(nèi)也均表現(xiàn)出心臟收縮壓顯著下降的效果，且在體內(nèi)持續(xù)時間也較長，可達8 h左右[38]。目前已測定出的綠豆 ACE抑制肽（抑制率為 89.50%）的活性成分有 FLVNPDDNENL、FLVNPDDNENLRII和 KDNVISEIPTEVLDL[38，39]。綠豆肽是潛在的優(yōu)質(zhì) ACE肽源，但綠豆肽若要在機體中發(fā)揮降壓作用，口服后需經(jīng)腸道吸收以及進一步抵抗血漿肽酶的降解后而到達其作用靶點，故其體外的ACE抑制活性與在體內(nèi)的降壓活性會有一定差異，更多的體內(nèi)研究對于綠豆肽降血壓效果的探討更具實際意義。目前綠豆降血壓活性的研究僅局限于證實具有該作用，但其發(fā)揮降血壓活性的調(diào)控機制也尚不明確。

2.3 免疫活性

免疫調(diào)節(jié)對于維持自身生理功能穩(wěn)定與平衡具有重要作用，已有研究發(fā)現(xiàn)綠豆肽可提高機體的免疫活性，此類多為純化后得到的綠豆肽。綠豆肽不僅在體外免疫指標中表現(xiàn)出呈現(xiàn)一定劑量效應(yīng)的免疫活性，還可增強RAW 264.7巨噬細胞活性，促進其增殖，以及抑制溶菌酶和超氧歧化酶的活性，在降低促炎細胞因子的表達，以及在促進巨噬細胞 NO分泌、iNOS活性以及對iNOSm RNA的表達等方面也均表現(xiàn)出良好的效果。具有免疫活性的綠豆肽分子量通常較?。ǎ?000 u），已鑒定出的一個肽段的氨基酸序列為Asn-Asn-Tyr-Gly-Pro-Thr-Met，且發(fā)現(xiàn)綠豆肽的免疫活性與疏水氨基酸的含量有關(guān)[40-42]。在小鼠體內(nèi)，綠豆肽可提高其缺氧耐受性和免疫力，體現(xiàn)在吞噬巨噬細胞的能力、半數(shù)溶血值、脾臟生成抗體的細胞數(shù)以及淋巴細胞的增殖能力顯著提高等方面[43]。刁靜靜[4]還通過環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠模型對綠豆肽（Mw＜1000 u，含量96%）發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機制進行了探究，其鑒定出三個免疫活性最強的綠豆肽的氨基酸序列，分別為Phe-Leu-Val-Asn-Arg-Ile（885.10 u），Phe-Leu-Val-Asn-Pro-Asp-Asp（961.06 u），Lys-Asp-Asn-Val-Ile-Ser-Glu-Leu（1043.13 u），結(jié)果表明綠豆肽發(fā)揮免疫調(diào)控作用可能是通過TLR1受體調(diào)控p38、ERK1/2和NF-κB信號通路實現(xiàn)的；且綠豆肽免疫活性程度與其分子量大小、氨基酸構(gòu)成及含量、疏水性及其二級結(jié)構(gòu)均密切相關(guān)。

2.4 金屬螯合能力

研究顯示，綠豆肽具有較強的金屬螯合能力，但目前僅體現(xiàn)在鐵離子和鋅離子螯合方面，可作為較好的鋅強化劑和亞鐵離子螯合劑。Fu等[44]從堿性酶水解得到的綠豆蛋白水解物中分離純化出一個分子量為1192.56 u具有鋅結(jié)合能力的新肽，其氨基酸序列為SSEDQPFNLR，其肽結(jié)合鋅的能力為80.82 mg/g，研究顯示鋅在肽上的結(jié)合位點為酰胺的氮原子、末端氨基和羧基上的氧原子；肽鋅螯合物在酸性和堿性條件下均表現(xiàn)出良好的溶解性，且螯合后促進了鋅離子在機體中的轉(zhuǎn)運及在胃腸道中的吸收。綠豆肽與鐵離子的螯合物則表現(xiàn)出較強的抗氧化活性，Chunkao等合成了五個由5～8個氨基酸組成的具有較高鐵結(jié)合能力的抗氧化活性肽，分子量為88.86～153.59 mg/g。其中PAIDL的鐵結(jié)合能力最高，LLLLG和LLGIL的金屬螯合活性最強，而PAIDL（46.63%）和LLGIL（81.27%）清除DPPH自由基的活性顯著優(yōu)于其他肽段；并發(fā)現(xiàn)短鏈與亮氨酸結(jié)合的c端氨基酸殘基是肽具有較強抗氧化性[45，46]。綠豆肽對于其他金屬的螯合能力也有待探索，且后續(xù)仍通過大量動物模型和人體實驗來進一步研究。

3 綠豆肽在食品中的應(yīng)用

目前綠豆肽在食品中的應(yīng)用研究較少，現(xiàn)多將綠豆肽添加到液態(tài)食品中，研究其對食品感官及食品功能性的影響。如開發(fā)添加綠豆肽的抗氧化飲料（DPPH、O2-、·OH 自由基的清除率分別為 81.48%、73.18%、54.90%）、具有抗氧化功能的糯米酒中（DPPH、O2-、·OH自由基的清除率分別為82.53%、69.60%、79.85%）[21]，以及添加到發(fā)酵酸奶中[24]促進乳酸菌發(fā)酵（縮短發(fā)酵時長45 min），還可將其添加到葵花籽油中，延緩葵花籽油和葵花籽油水乳狀液的脂質(zhì)氧化速度和程度[15]。綠豆肽本身具有苦味，故添加到食品中對其風味口感等會具有一定程度的影響，所以綠豆肽應(yīng)用到食品中的添加量及對食品本身食味品質(zhì)的影響應(yīng)著重注意，盡管仍存在一定問題，但其功能作用在食品工業(yè)生產(chǎn)強化食品方面已展現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。

4 展望

4.1 目前，綠豆肽的研究多集中在分離純化技術(shù)上，對于功能活性的研究面廣而不深，也多集中在體外檢測和細胞水平上，但不可否認的是綠豆肽展現(xiàn)出了多種多樣的生物活性，是一種極具開發(fā)潛力的生物活性肽。從來源的角度看，綠豆屬于雜糧豆類，且具有藥食同源性，故其可能具有更廣泛的應(yīng)用前景，但由于其作為外源性代謝調(diào)節(jié)物的作用靶點及生理活性調(diào)控的作用機制尚未清晰，制約了其在食品及相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。

4.2 綠豆肽的研究主要存在幾個問題，一是蛋白酶種類對綠豆肽功能活性影響不明確，尚缺乏體系性的研究，如相同蛋白酶不同水解程度得到的不同分子量肽其功能活性差異，以及不同蛋白酶相同水解程度得到的肽功能活性差異。二是綠豆肽構(gòu)效關(guān)系尚不明確，具體氨基酸組成對其功能活性的影響不得而知。三是功能活性作用機制研究不透徹，目前僅證實其具有多種功能，但作用機制鮮有報道，從體外相應(yīng)指標檢測到細胞水平分子調(diào)控機制研究，再到體內(nèi)動物實驗作用機理解析可更系統(tǒng)性的對機制進行明確；其次功能活性作用機制研究方法也不全面，目前的機制研究深層次的落在細胞層面的信號通路方向，而作為食源性蛋白肽，腸道消化吸收后如何發(fā)揮作用的機制未有證實，機制研究中可結(jié)合分子生物學、蛋白組學以及代謝組學等平臺綜合進行驗證。綠豆肽無論在食品還是醫(yī)藥領(lǐng)域均表現(xiàn)出良好的作用，所以有針對性的根據(jù)原材料特點合理開發(fā)“定向功能活性肽”具有較好的現(xiàn)實意義，對于具有相應(yīng)活性但不是主要活性的功能，則可與其他肽進行復(fù)配，研發(fā)“多功能復(fù)合型肽”產(chǎn)品。