• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于酶聯(lián)適配體快速檢測食品中葡萄球菌腸毒素A

    2022-03-07 07:01:02林祥群楊國江盧春霞陶思樺閆圣坤
    現(xiàn)代食品科技 2022年2期
    關(guān)鍵詞:吸光精密度緩沖液

    林祥群,楊國江,盧春霞,陶思樺,閆圣坤

    (1.新疆石河子職業(yè)技術(shù)學(xué)院輕紡化工分院,新疆 石河子 832000)(2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院水土研究所,新疆 石河子 832000)(3.長江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院,重慶 408100)(4.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)機(jī)械化研究所,新疆 烏魯木齊 830091)

    金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引發(fā)食源性疾病的主要致病菌之一,而引起金黃色葡萄球菌食物中毒的主要致病因子是葡萄球菌腸毒素(Staphylococcus enterotoxin,SEs)。據(jù)統(tǒng)計(jì),在世界上由SEs引起的食物中毒事件占細(xì)菌性食物中毒總事件的25%~45%,其中SEA引起的食物中毒事件占所報道的葡萄球菌中毒病例的80%[1]。因此,如何快速、及時、準(zhǔn)確地檢出SEA是保障食品安全及有效預(yù)防食源性疾病的先決條件。

    目前,SEA的鑒定和檢測方法主要包括:(1)分子生物學(xué)方法:該法是基于SEs特異基因序列作為檢測目標(biāo),采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)[2]、基因芯片技術(shù)[3]等對目標(biāo)物進(jìn)行快速檢測。該法需要昂貴的儀器和專業(yè)的技術(shù)人員,無法滿足現(xiàn)場快速檢測的要求。(2)基于抗原-抗體識別的免疫分析技術(shù),是目前最常用SEA快速檢測技術(shù),主要包括酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)[4]、膠體金試紙條[5]和各種生物傳感器[6,7]。但是抗體的制備需要免疫動物,制備周期長、成本高。因此,迫切需要建立簡便、經(jīng)濟(jì)、靈敏、快速的SEA檢測方法,作為現(xiàn)有檢測技術(shù)的補(bǔ)充,滿足批量樣品中SEA的快速篩查。而核酸適配體可彌補(bǔ)抗體在檢測應(yīng)用中的不足,為SEA檢測提供了新的思路。

    核酸適配體(Aptamer)是能與特定靶標(biāo)結(jié)合的一段單鏈寡核苷酸,通過折疊成發(fā)夾、莖環(huán)、假結(jié)體及G-四聚體等結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)進(jìn)行特異性分子識別。基于隨機(jī)文庫的龐大庫容和單鏈核苷酸空間結(jié)構(gòu)的多樣性,適配體幾乎可與所有種類的靶標(biāo)包括大到微生物小到有機(jī)小分子[8-16]發(fā)生結(jié)合。相較與抗體,核酸適配體還具有制備簡單、生產(chǎn)成本低、應(yīng)用范圍廣、易于修飾和標(biāo)記等特點(diǎn)[17]。因此,適配體作為一種新型識別探針在食品安全領(lǐng)域成為人們研究的焦點(diǎn)[18-22]。2014年,Huang等[23]篩選出SEA核酸適配體,適配體親和力達(dá)到 nmol/L級別,并通過氧化石墨烯與標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)的SEA適配體之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理,實(shí)現(xiàn)了對牛奶中SEA的檢測,方法檢出限達(dá)8.7 ng/mL。馬欣月[24]以熒光標(biāo)記的SEA適配體為分子識別元件,利用帶正電荷的金納米棒對核酸的靜電吸附作用,以及對熒光基團(tuán)的猝滅原理,建立一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的SEA檢測方法。在優(yōu)化條件下,SEA線性檢測范圍為0.01~0.8 μg/mL,檢出限為5.66 ng/mL,并將其成功應(yīng)用于牛奶樣品中的SEA檢測。

    酶聯(lián)適配體分析技術(shù)是將傳統(tǒng) ELISA中的識別元件抗體替換為核酸適配體,借助酶催化顯色及信號放大作用實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的高靈敏度、高特異性檢測。因此酶聯(lián)適配體分析法有望發(fā)展成為商業(yè)化試劑盒,具有廣闊的市場前景。但目前尚未見到基于酶聯(lián)適配體檢測SEA的研究報道。因此,本研究以SEA適配體為識別分子,基于夾心模式建立了一種簡便、經(jīng)濟(jì)、靈敏的檢測新方法,為SEA檢測提供新的技術(shù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    本研宄中所用核酸適配體[23]由生物工程(上海)股份有限公合成并純化。生物素化適配體 1:5’-bio-TACTTATGCATTTCCTCCCACGATCTTATTT GAGAGTGAC-3’;生物素化適配體 2:5’-bio-AGGCGATTACGCTTCTTGTACTTCAATAAC GACTCAACTC-3’。

    SEA、SEB、SEC1,上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司;牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)、卵清蛋白(Oval abumin,OVA)、吐溫-20(Tween-20)、鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(Streptavidin-horseradish peroxidase,SA-HRP)、TMB顯色試劑盒,生物工程(上海)股份有限公司;其余分析純試劑國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;SEA ELISA檢測試劑盒,南京卡米洛生物工程有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2 MΩ·cm);鏈霉親和素包被的酶標(biāo)板,蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司;雞肉和牛奶等食品樣品,本地超市。

    1.2 儀器設(shè)備

    Thermo Scientific?Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀,美國Thermo公司;5MX 96孔板混勻儀,美國Scilogex公司;5424R臺式冷凍離心機(jī),德國Eppendorf公司;Milli-Q Reference超純水系統(tǒng),美國密理博公司;萬分之一天平,德國Sartorius公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 酶聯(lián)適配體分析(ELAA)的建立

    酶標(biāo)板使用前用PBST緩沖液(10 mmol/LPBS,0.05% Tween-20)洗滌3~5次,拍干。加入200 μL適配體1溶液,室溫孵育,PBST洗滌、拍干。隨后加入300 μL的BSA封閉液,室溫孵育,PBST洗滌。加入200 μL待測樣品,室溫孵育,PBST洗滌。加入200 μL適配體2溶液,室溫孵育一定時間,PBST洗滌。然后加入 200 μL SA-HRP,室溫孵育20 min,PBST洗滌。加入100 μL TMB底物顯色液,反應(yīng)5~7 min后,加入100 μL終止液終止反應(yīng),通過顏色變化定性檢測SEA。定量檢測時,采用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀在450 nm處測其吸光值。

    實(shí)驗(yàn)過程中對適配體濃度、封閉劑BSA濃度、封閉時間、SA-HRP濃度、反應(yīng)體系、靶標(biāo)與適配體反應(yīng)時間等條件進(jìn)行優(yōu)化。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.3.2 ELAA檢測性能評價

    1.3.2.1 靈敏度

    在優(yōu)化條件下,將SEA稀釋成系列梯度濃度,采用ELAA方法進(jìn)行測定,以不同SEA濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo),以SEA各濃度對應(yīng)的OD450nm值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,對標(biāo)曲進(jìn)行進(jìn)行線性擬合,求得線性方程和相關(guān)系數(shù)。計(jì)算ˉx0+2s(ˉx0和s為10份零標(biāo)準(zhǔn)濃度的吸光值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差),以此該數(shù)據(jù)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出對應(yīng)的濃度,即為檢出限(Limit of detection,LOD)[25]。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.3.2.2 特異性

    采用建立的 ELAA方法分別檢測 SEA、SEB、SEC1、BSA、OVA,同時設(shè)置空白對照(SEA 適配體篩選緩沖液),以評估方法的特異性。

    1.3.2.3 加標(biāo)回收率

    采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)來考察該 ELAA方法的準(zhǔn)確性。取雞肉和牛奶空白樣品,分別添加低、中、高三種濃度水平的SEA。參照GB/T 4789.10-2016[26]中附錄B4.2的方法提取食品中SEA,按照ELAA方法進(jìn)行檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中各SEA濃度,然后計(jì)算加標(biāo)回收率和其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation,RSD)。每個添加水平設(shè)置3個重復(fù)。

    1.3.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

    采用批內(nèi)和批間誤差以評估ELAA的精密度。批內(nèi)精密度:分別采集3份SEA添加(陽性)樣品及2份空白(陰性)樣品,采用同一批次的適配體,在同一塊酶標(biāo)板上對樣品進(jìn)行3次重復(fù)檢測,測定OD450nm值,計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。批間精密度:按照建立的ELAA方法,采用3個批次的適配體,在同一酶標(biāo)上分別檢測3份陽性樣品和2份陰性樣品,每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,測定OD450nm值,計(jì)算RSD。

    1.4 ELAA方法的應(yīng)用

    參照GB/T 4789.10-2016[27]中附錄B4.2的方法提取不同食品中SEA。取200 μL樣品提取液,按照上述ELAA方法進(jìn)行檢測,計(jì)算樣品中SEA含量。同時采用國標(biāo)法(GB/T 4789.10-2016)進(jìn)行檢測,并與檢測結(jié)果對比驗(yàn)證,以評價本方法的準(zhǔn)確性和可靠性。

    1.5 數(shù)據(jù)處理

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差方式表示,采用單因素方差分析(One-WayANOVA)方法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),顯著性水準(zhǔn)為α=0.05,使用Origin 8.5軟件制圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 檢測條件優(yōu)化

    2.1.1 適配體濃度

    適配體1(bio-apt1)的包被濃度對檢測靈敏度有一定影響。因此,本實(shí)驗(yàn)固定SEA濃度為500 ng/mL,適配體2濃度為100 nmol/L,結(jié)合時間1 h,SA-HRP稀釋比例為 1:40000,考察了不同 bio-apt1包被濃度(10~200 nmol/L)對檢測靈敏度的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1a所示。從圖中可以看出,吸光值隨著bio-apt1包被濃度的增加而增加,意味著結(jié)合SEA的量也逐漸增加,當(dāng)bio-apt1包被濃度超過40 nmol/L后,吸光值變化趨于平緩。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇40 nmol/L為bio-apt1的包被濃度。

    固定適配體1包被濃度,考察適配體2不同濃度(10~200 nmol/L)對檢測性能的影響,結(jié)果如圖1b所示,吸光值隨著適配體2濃度的增加而增加,當(dāng)濃度為40 nmol/L時,吸光值變化趨勢平緩。因此,適配體2濃度也選擇40 nmol/L。

    2.1.2 封閉條件

    在酶聯(lián)適配體分析中,封閉酶標(biāo)版上多余位點(diǎn)至關(guān)重要,若封閉不完全,SA-HRP會與聚苯乙烯板發(fā)生非特異性結(jié)合,造成較高的背景值[27]。本實(shí)驗(yàn)固定適配體濃度為40 nmol/L,采用1% BSA封閉后直接加入 SA-HRP(1:40000,V/V),觀察 BSA濃度和封閉時間對SA-HRP非特異性吸附的影響。結(jié)果顯示(圖2),當(dāng)BSA封閉濃度低于0.5%,封閉不完全,隨著BSA濃度的增加,吸光值逐漸下降,說明SA-HRP非特異性吸附降低。另外,非特異性吸附隨著封閉時間的延長而降低,當(dāng)封閉時間超過4 h后,吸光值無明顯變化。綜上分析,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇1% BSA封閉4 h。

    2.1.3 反應(yīng)體系對檢測性能的影響

    適配體的動態(tài)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性易受環(huán)境變化影響,即反應(yīng)溶液pH、離子成分及濃度等顯著影響適配體的親和力及特異性[28,29],因此最佳的反應(yīng)緩沖液對檢測性能至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)分別采用SEA適配體篩選緩沖液(20 mmol/L Tris,100 mmol/L NaCl,5 mmol/L KCl,1 mmol/L CaCl2和 1 mmol/L MgCl2·6H2O,pH 7.4)[23]和10 mmol/L PBS緩沖液(pH 7.4)作為反應(yīng)溶液用于稀釋適配體、樣品和 SA-HRP等,考察不同反應(yīng)體系對檢測性能的影響。結(jié)果如圖3所示,篩選緩沖液作為反應(yīng)體系時,吸光顯著高于10 mmol/L PBS緩沖液。有研究證明,在分析過程中,改變適配體反應(yīng)體系及離子強(qiáng)度等環(huán)境條件可能影響適配體的折疊結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響靶標(biāo)與適配體的相互作用[28],故檢測體系與配體篩選體系之間的一致性對提高檢測性能至關(guān)重要。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇SELEX緩沖液作為檢測體系。

    2.1.4 反應(yīng)時間

    充足的反應(yīng)時間可保障SEA與適配體充分結(jié)合,但反應(yīng)時間過長,則會影響檢測效率。因此,本實(shí)驗(yàn)調(diào)查了不同反應(yīng)時間對檢測性能的影響。結(jié)果如圖4顯示,隨著結(jié)合時間的增加,吸光值逐漸增大,當(dāng)反應(yīng)時間超過 30 min后,吸光值沒有明顯變化。表明SEA與適配體反應(yīng)30 min即達(dá)到平衡狀態(tài),延遲反應(yīng)時間并沒有提高檢測靈敏度。所以,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)時間為30 min。

    2.1.5 SA-HRP稀釋比例

    SA-HRP是酶聯(lián)適配體顯色反應(yīng)的關(guān)鍵因素,SA-HRP濃度低,顯色反應(yīng)不充分,濃度過高易引起非特異性吸附。本研究固定以上優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件,將SA-HPR稀釋不同比例(1:10000~1:100000),檢測結(jié)果如圖5所示,當(dāng) SA-HRP稀釋比例在 1:10000~1:40000范圍時,吸光值無明顯變化,隨著稀釋比例進(jìn)一步增大,吸光值顯著降低。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇SA-HRP稀釋比例為1:40000。

    2.2 檢測性能評價

    2.2.1 靈敏度

    在優(yōu)化條件下,采用ELAA方法測定不同濃度的SEA(0、1、5、10、50、100、500、1000、5000 ng/mL),以SEA不同濃度為橫坐標(biāo),以各濃度對應(yīng)的OD450nm值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖6為SEA的劑量反應(yīng)曲線(外)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(內(nèi)),如圖6a所示,OD450nm值隨SEA濃度的增加而增大,SEA在5~500 ng/mL濃度范圍內(nèi)與OD值呈良好線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R)為0.996。基于ˉx0+2s計(jì)算方法檢出限為0.18 ng/mL。同時溶液顏色的變化與 OD450nm值的變化一致(圖6b),在SEA濃度1 ng/mL時,溶液顯色呈藍(lán)色,故該方法目測可視化檢測限為1 ng/mL。以上結(jié)果表明,本方法具有高的靈敏度。

    2.2.2 特異性分析

    采用ELAA分別檢測SEA、SEB、SEC1、BSA、OVA,同時設(shè)置空白對照(結(jié)合緩沖液),以評估方法的特異性。結(jié)果見圖7所示,BSA、OVA不產(chǎn)生識別信號,與空白對照吸光值相近,說明適配體與無關(guān)蛋白沒有交叉反應(yīng)。但適配體與SEB和SEC1有一定交叉反應(yīng),吸光值約 0.12~0.13。這與適配體本身特異性有關(guān),推斷原因在于 SEA與 SEB、SEC1具有40%~60%序列同源性,適配體對該共同結(jié)構(gòu)域具有相同的識別位點(diǎn)[23]。

    2.2.3 加標(biāo)回收率

    利用所建立的檢測方法,對空白樣品進(jìn)行添加回收測定,進(jìn)一步評價該方法的準(zhǔn)確性和精密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示,SEA在空白樣品中的平均回收率為91.22%~101.30%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于6.00%。以上結(jié)果說明所建立的 ELAA方法具有較高的準(zhǔn)確性。

    表1 本方法檢測食品中SEA的加標(biāo)回收率(n=3)Table 1 Recovery rates of SEA spiked from the food by the developed method (n=3)

    2.2.4 重復(fù)性

    采用批內(nèi)和批間誤差評估本方法的精密度。研究結(jié)果顯示,批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.82%~5.00%(表2),批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.33%~7.50%(表3),結(jié)果表明批間和批內(nèi)重復(fù)性良好,本方法具有高的精密度。

    表2 批內(nèi)精密度(n=3)Table 2 The precision of intra-batch (n=3)

    表3 批間精密度(n=3)Table 3 The precision of inter-batch (n=3)

    2.3 SEA檢測方法比較

    本研究以適配體代替抗體建立的ELAA方法,具有較高的靈敏度和回收率(見表4),與基于適配體的熒光傳感檢測方法比較,本方法不需要制備納米材料和對適配體過多修飾,不需要特殊的儀器,簡化了操作步驟。與基于抗體的免疫檢測技術(shù)比較,本方法所用適配體可體外篩選獲得(1~2周)和人工合成,具有制備周期短、成本低等優(yōu)勢,可極大降低檢測成本。

    表4 本方法與文獻(xiàn)報道方法的檢測性能比較Table 4 Comparison of detection performance of between proposed method and reported methods

    2.4 檢測方法應(yīng)用

    為了驗(yàn)證本方法在實(shí)際樣品中的應(yīng)用效果,分別采用本方法與國標(biāo)方法測定10組加標(biāo)樣本,計(jì)算樣品中SEA含量。以本方法測定值為X軸,國標(biāo)法測定值為Y軸作圖,將二者濃度值進(jìn)行相關(guān)性分析。從圖8中可以看出,兩種方法的檢測結(jié)果具有高的相關(guān)性(R2=0.994),表明建立的方法準(zhǔn)確度和可靠性較好。

    3 結(jié)論

    本研究以SEA適配體為識別分子,代替抗體建立了一種酶聯(lián)適配體分析方法,在優(yōu)化條件下,該方法具有低的檢測限(0.18 ng/mL)、高的回收率(91.22%~101.30%)和精密度(RSD<8%)。將建立的ELAA應(yīng)用于食品中SEA檢測,檢測結(jié)果與國標(biāo)法相關(guān)性較高(R=0.994)。且該方法操作簡單,適用于批量樣品中SEA的高通量快速篩查。本研究為SEA檢測提供一張簡便、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的快速檢測新技術(shù)。

    猜你喜歡
    吸光精密度緩沖液
    金色的吸管
    新型醋酸纖維素薄膜電泳緩沖液的研究
    Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate dependent Rac exchange factor 1 is a diagnostic and prognostic biomarker for hepatocellular carcinoma
    副波長對免疫比濁法檢測尿微量清蛋白精密度的影響
    卵磷脂/果膠鋅凝膠球在3種緩沖液中的釋放行為
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:12
    你把空氣全部吸光
    初中生(2016年1期)2016-04-14 20:13:15
    海水U、Th長壽命核素的高精密度MC-ICP-MS測定方法
    半菁染料作為染料敏化太陽能電池吸光材料的理論研究
    2014年全國452家實(shí)驗(yàn)室全血銅、鋅、鈣、鎂、鐵檢驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不精密度分析
    2種緩沖液對血清蛋白醋酸纖維膜電泳效果對比研究
    久久久久久九九精品二区国产 | 在线观看免费日韩欧美大片| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲欧美激情综合另类| 日日爽夜夜爽网站| 又紧又爽又黄一区二区| 五月伊人婷婷丁香| a级毛片a级免费在线| av超薄肉色丝袜交足视频| xxxwww97欧美| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 日韩欧美国产一区二区入口| 99在线人妻在线中文字幕| 久久精品成人免费网站| 成人18禁在线播放| 老司机在亚洲福利影院| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 日韩国内少妇激情av| 五月玫瑰六月丁香| 九色成人免费人妻av| 天堂√8在线中文| 黄色视频,在线免费观看| 麻豆av在线久日| 青草久久国产| x7x7x7水蜜桃| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美zozozo另类| 天天添夜夜摸| 我要搜黄色片| 51午夜福利影视在线观看| 国产精华一区二区三区| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲欧美日韩东京热| 村上凉子中文字幕在线| 国产亚洲精品久久久久5区| 99热6这里只有精品| 最新美女视频免费是黄的| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产精品精品国产色婷婷| 午夜a级毛片| 精品欧美一区二区三区在线| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美日韩一级在线毛片| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 日本一本二区三区精品| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 大型黄色视频在线免费观看| 国产成人系列免费观看| 久久这里只有精品中国| 日本 av在线| 日韩欧美三级三区| 久99久视频精品免费| 丁香六月欧美| 午夜福利在线在线| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 香蕉久久夜色| 久久亚洲精品不卡| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲 国产 在线| 久久香蕉国产精品| 女人被狂操c到高潮| 香蕉久久夜色| 少妇被粗大的猛进出69影院| 成人手机av| 久久久精品大字幕| 国产爱豆传媒在线观看 | 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产乱人伦免费视频| 黄色女人牲交| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 此物有八面人人有两片| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲最大成人中文| 国产精品一及| 成年人黄色毛片网站| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲无线在线观看| 精品日产1卡2卡| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 哪里可以看免费的av片| 精品无人区乱码1区二区| 在线国产一区二区在线| 国产精品影院久久| 成在线人永久免费视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 岛国在线观看网站| av欧美777| 亚洲五月天丁香| 天堂影院成人在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 天堂动漫精品| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲av成人一区二区三| avwww免费| 亚洲精华国产精华精| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲精品中文字幕在线视频| 免费看美女性在线毛片视频| 精品久久久久久成人av| 老司机靠b影院| 国产亚洲欧美在线一区二区| 免费在线观看成人毛片| 国产乱人伦免费视频| 免费电影在线观看免费观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 麻豆一二三区av精品| 欧美日本亚洲视频在线播放| 狠狠狠狠99中文字幕| 99热这里只有精品一区 | 老司机靠b影院| 亚洲无线在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 757午夜福利合集在线观看| av欧美777| 男插女下体视频免费在线播放| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲人成77777在线视频| 首页视频小说图片口味搜索| 免费无遮挡裸体视频| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲国产欧美网| 在线视频色国产色| 色播亚洲综合网| 最新美女视频免费是黄的| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲无线在线观看| 久久草成人影院| 午夜激情av网站| 国产精品免费一区二区三区在线| 午夜福利视频1000在线观看| 国产99久久九九免费精品| 亚洲成人久久性| 国产一区在线观看成人免费| cao死你这个sao货| 夜夜夜夜夜久久久久| 丁香六月欧美| 最好的美女福利视频网| 成人午夜高清在线视频| 伦理电影免费视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精品精品国产色婷婷| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产视频一区二区在线看| 亚洲av成人av| 在线看三级毛片| 搞女人的毛片| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲av电影不卡..在线观看| 日本成人三级电影网站| 久久久水蜜桃国产精品网| 桃色一区二区三区在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 免费在线观看完整版高清| 免费在线观看黄色视频的| 特级一级黄色大片| 一进一出好大好爽视频| 日本一区二区免费在线视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 午夜免费观看网址| 女警被强在线播放| 亚洲一区中文字幕在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产精品国产高清国产av| 99热只有精品国产| 很黄的视频免费| 成人永久免费在线观看视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 欧美日韩一级在线毛片| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产精品一及| 三级毛片av免费| 白带黄色成豆腐渣| 十八禁网站免费在线| 女人被狂操c到高潮| 熟女电影av网| a级毛片a级免费在线| 国产激情久久老熟女| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲人成77777在线视频| 午夜成年电影在线免费观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 露出奶头的视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲精品在线美女| 丝袜美腿诱惑在线| 国产片内射在线| 老汉色∧v一级毛片| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| √禁漫天堂资源中文www| 国产一区二区三区视频了| 久久久精品欧美日韩精品| www.精华液| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲精品美女久久av网站| 91麻豆av在线| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| or卡值多少钱| 国产精品 欧美亚洲| 999久久久国产精品视频| 亚洲国产精品成人综合色| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产野战对白在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲av成人一区二区三| 国产av一区二区精品久久| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 超碰成人久久| 亚洲精品色激情综合| 性欧美人与动物交配| 动漫黄色视频在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产成人啪精品午夜网站| 好男人电影高清在线观看| 欧美黑人巨大hd| 国产激情欧美一区二区| 一a级毛片在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 色老头精品视频在线观看| 哪里可以看免费的av片| 亚洲精品国产一区二区精华液| 999久久久国产精品视频| 亚洲五月天丁香| www.www免费av| 国产亚洲精品av在线| 欧美午夜高清在线| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲国产精品合色在线| 国产高清视频在线观看网站| 人妻久久中文字幕网| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产99久久九九免费精品| 国产一区二区在线观看日韩 | av在线天堂中文字幕| 婷婷丁香在线五月| 午夜视频精品福利| a级毛片在线看网站| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲激情在线av| 成人国语在线视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 日韩av在线大香蕉| 国产激情欧美一区二区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产成人av教育| av福利片在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 久久久久久久久免费视频了| 欧美av亚洲av综合av国产av| av福利片在线| 亚洲色图av天堂| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 久久久精品大字幕| 美女午夜性视频免费| 成人av在线播放网站| 成人国产综合亚洲| 91成年电影在线观看| 欧美大码av| 国产亚洲精品第一综合不卡| 一本一本综合久久| 白带黄色成豆腐渣| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 可以在线观看毛片的网站| www日本黄色视频网| 最近在线观看免费完整版| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久久久久国产a免费观看| www.熟女人妻精品国产| 成人国产一区最新在线观看| 十八禁人妻一区二区| 国产伦在线观看视频一区| 日韩欧美三级三区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产高清视频在线播放一区| 麻豆av在线久日| 99国产精品一区二区三区| 久久精品影院6| 日韩欧美在线二视频| 最好的美女福利视频网| 久久久国产成人免费| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 日本免费a在线| 一区二区三区国产精品乱码| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产成人av教育| 久久精品91蜜桃| 男女视频在线观看网站免费 | 国产精品久久久久久人妻精品电影| 在线国产一区二区在线| 亚洲18禁久久av| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 午夜两性在线视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 91在线观看av| 日韩三级视频一区二区三区| 高清在线国产一区| 美女午夜性视频免费| 无人区码免费观看不卡| 熟女电影av网| 精品久久久久久久末码| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| videosex国产| 看免费av毛片| 香蕉av资源在线| 老司机福利观看| 男人舔奶头视频| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲欧美日韩东京热| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产在线观看jvid| 久99久视频精品免费| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| av视频在线观看入口| 日韩欧美在线乱码| 亚洲熟妇熟女久久| 91大片在线观看| 美女午夜性视频免费| 两人在一起打扑克的视频| 午夜福利高清视频| 亚洲五月婷婷丁香| 白带黄色成豆腐渣| 国产伦人伦偷精品视频| 麻豆一二三区av精品| 香蕉av资源在线| www国产在线视频色| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 母亲3免费完整高清在线观看| 不卡av一区二区三区| 久久久久久国产a免费观看| 男女那种视频在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 久久香蕉精品热| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 深夜精品福利| 一级作爱视频免费观看| 色综合婷婷激情| 少妇人妻一区二区三区视频| 一级片免费观看大全| 国产成人av激情在线播放| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产黄色小视频在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 身体一侧抽搐| 俄罗斯特黄特色一大片| 正在播放国产对白刺激| 久久久久久人人人人人| 亚洲九九香蕉| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 欧美日本视频| av视频在线观看入口| 好男人在线观看高清免费视频| 国内精品久久久久精免费| 悠悠久久av| 九九热线精品视视频播放| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 老司机深夜福利视频在线观看| 免费av毛片视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产主播在线观看一区二区| 日韩高清综合在线| 一级毛片女人18水好多| 久久人人精品亚洲av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产三级在线视频| 中国美女看黄片| 国产激情偷乱视频一区二区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久九九热精品免费| 一区二区三区国产精品乱码| АⅤ资源中文在线天堂| 好男人在线观看高清免费视频| 中文亚洲av片在线观看爽| www.www免费av| 小说图片视频综合网站| 国产成人精品无人区| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲av第一区精品v没综合| 欧美乱色亚洲激情| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲,欧美精品.| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产精品,欧美在线| 最近最新中文字幕大全电影3| 搡老岳熟女国产| e午夜精品久久久久久久| 亚洲美女黄片视频| 美女 人体艺术 gogo| 大型黄色视频在线免费观看| 99久久国产精品久久久| 婷婷精品国产亚洲av在线| 日韩有码中文字幕| 伊人久久大香线蕉亚洲五| xxxwww97欧美| 亚洲真实伦在线观看| 无人区码免费观看不卡| 亚洲真实伦在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 精品久久久久久,| 成人国语在线视频| 国产在线观看jvid| 中出人妻视频一区二区| 搡老岳熟女国产| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久久99热这里只有精品18| 日韩欧美国产在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 91麻豆精品激情在线观看国产| 级片在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av | 舔av片在线| 亚洲av成人一区二区三| 天天添夜夜摸| www日本在线高清视频| 欧美zozozo另类| 欧美不卡视频在线免费观看 | 男人舔女人的私密视频| 亚洲欧美激情综合另类| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 精品午夜福利视频在线观看一区| av欧美777| 伦理电影免费视频| 亚洲精品色激情综合| 国产探花在线观看一区二区| videosex国产| 欧美日韩国产亚洲二区| 香蕉丝袜av| 国产亚洲精品av在线| 男女之事视频高清在线观看| 午夜激情av网站| 1024视频免费在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲精品在线观看二区| av片东京热男人的天堂| 亚洲国产精品999在线| 99热这里只有精品一区 | 最近视频中文字幕2019在线8| 国产成+人综合+亚洲专区| 我要搜黄色片| 精品福利观看| a级毛片在线看网站| 国产精华一区二区三区| 丰满人妻一区二区三区视频av | 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久久久久久久中文| 天天添夜夜摸| 国内精品一区二区在线观看| 十八禁人妻一区二区| 999精品在线视频| 一级作爱视频免费观看| 国产野战对白在线观看| 国产片内射在线| 长腿黑丝高跟| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲国产高清在线一区二区三| 女警被强在线播放| 精品久久久久久,| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产黄a三级三级三级人| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美成人性av电影在线观看| 在线国产一区二区在线| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲av电影在线进入| 国产成人精品久久二区二区91| 一级毛片精品| 日本 av在线| 很黄的视频免费| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美在线一区亚洲| netflix在线观看网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产人伦9x9x在线观看| 国产精品久久久av美女十八| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 操出白浆在线播放| 在线观看www视频免费| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产精品日韩av在线免费观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 在线永久观看黄色视频| 精品日产1卡2卡| av国产免费在线观看| 国产97色在线日韩免费| 久久99热这里只有精品18| 黄色毛片三级朝国网站| 国产伦人伦偷精品视频| 日本成人三级电影网站| 久久久久性生活片| 国内揄拍国产精品人妻在线| 91老司机精品| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美精品亚洲一区二区| 给我免费播放毛片高清在线观看| 久久久国产欧美日韩av| svipshipincom国产片| 99热只有精品国产| 无限看片的www在线观看| 在线观看午夜福利视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产激情久久老熟女| 十八禁网站免费在线| 在线观看舔阴道视频| www.www免费av| 波多野结衣高清无吗| 午夜福利成人在线免费观看| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲专区字幕在线| 久久精品91无色码中文字幕| 嫩草影视91久久| 成人18禁在线播放| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 激情在线观看视频在线高清| 久久九九热精品免费| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久久久精品国产欧美久久久| 麻豆国产97在线/欧美 | 国产精品日韩av在线免费观看| 岛国在线观看网站| 麻豆成人午夜福利视频| 村上凉子中文字幕在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 日韩精品中文字幕看吧| 最近在线观看免费完整版| 成人三级黄色视频| 久久国产精品人妻蜜桃| a级毛片a级免费在线| 成年版毛片免费区| 一本一本综合久久| 亚洲国产看品久久| 窝窝影院91人妻| cao死你这个sao货| 欧美+亚洲+日韩+国产| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲国产欧美人成| 国产乱人伦免费视频| 欧美色视频一区免费| 国产又色又爽无遮挡免费看| 淫妇啪啪啪对白视频| 欧美日韩乱码在线| 一二三四在线观看免费中文在| 操出白浆在线播放| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲精华国产精华精| 日韩欧美国产一区二区入口| 人妻久久中文字幕网| 免费av毛片视频| 久久热在线av| 色综合站精品国产| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 老鸭窝网址在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 精品久久久久久久毛片微露脸| 精品不卡国产一区二区三区| 三级毛片av免费| 欧美午夜高清在线| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 真人一进一出gif抽搐免费| 男人舔女人下体高潮全视频| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲av熟女| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美中文综合在线视频| 国产av不卡久久| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲成人久久爱视频| 国产av一区二区精品久久| 黑人操中国人逼视频| 久久精品成人免费网站| 国产精品久久久av美女十八| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产99白浆流出| 中出人妻视频一区二区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久国产精品影院| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲av成人av| 精品福利观看| aaaaa片日本免费| 十八禁网站免费在线| 曰老女人黄片| 国产97色在线日韩免费| 黄片小视频在线播放| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 18禁国产床啪视频网站| 国产伦一二天堂av在线观看| 麻豆国产av国片精品| 国产av一区二区精品久久| 亚洲av片天天在线观看|