王金玲,晏雨辰,李巧月,張福舜,李鑫,盧志全
(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040)(2.黑龍江省森林食品資源利用重點(diǎn)實驗室,黑龍江 哈爾濱150040)(3.黑龍江省賓縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,黑龍江 哈爾濱 150001)
檸檬酸(citric acid),化學(xué)名為 2-羥基丙烷-1,2,3-三羧酸,分子式為 C6H8O7,是三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle,TCA)重要的代謝中間產(chǎn)物,其結(jié)構(gòu)如圖1所示。以檸檬酸為成熟果實中含量最高的有機(jī)酸的水果屬于檸檬酸優(yōu)勢型[1],也可稱為檸檬酸型水果;如檸檬、紅樹莓、百香果、藍(lán)靛果、楊梅、獼猴桃等。由于果實中檸檬酸含量較高,用這些原料加工的果汁、果酒會出現(xiàn)口感酸澀、適口性差等問題,要進(jìn)行一定程度的降酸處理。果酒常用的降酸方法分為物理降酸、化學(xué)降酸和生物降酸[2]?;瘜W(xué)降酸和物理降酸有一定的局限性,會產(chǎn)生酒體不穩(wěn)定、苦澀味及風(fēng)味物質(zhì)、有益成分的損失和顏色的吸附等影響[3]。生物降酸是利用微生物的生長代謝分解有機(jī)酸,與物理降酸和化學(xué)降酸相比具有條件綠色、反應(yīng)溫和、食用安全性高等優(yōu)點(diǎn)[4]。
目前生物降酸常用的降酸菌株主要對蘋果酸發(fā)揮作用,常采用蘋果酸-乳酸發(fā)酵(malo-lactic fermentation,MLF)和蘋果酸-乙醇發(fā)酵(malo-alcohol fermentation,MAF)。
MLF(圖2)是指酒精發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行的將L-蘋果酸轉(zhuǎn)化為 L-乳酸的第二次發(fā)酵過程[5]。在蘋果酸-乳酸發(fā)酵期間,乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)降解檸檬酸產(chǎn)生乙酸導(dǎo)致?lián)]發(fā)酸成分增加[6]。葡萄酒中適量的乙酸(200~700 mg/L)可以通過乙酰輔酶 A(Ac-CoA)形成水果乙酸酯改善酒的香氣,但超過700 mg/L會導(dǎo)致醋酸異味[7]。另外,乳酸菌的檸檬酸代謝有助于葡萄酒形成重要的羰基風(fēng)味化合物即雙乙酰、乙偶姻和 2,3-丁二醇,根據(jù)其濃度對葡萄酒質(zhì)量和香氣產(chǎn)生正或負(fù)影響,1~4 mg/L的雙乙酰濃度有助于產(chǎn)生理想的葡萄酒香氣,超過5 mg/L則會掩蓋水果或植物原本的香氣[8]。乙偶姻在葡萄酒中含量超過150 mg/L閾值時,感官上具有黃油或奶油味[9];2,3-丁二醇的濃度超過600 mg/L閾值時,葡萄酒略有苦味[10],故蘋果酸-乳酸發(fā)酵降酸往往需要嚴(yán)格控制。
MAF(圖3)屬于酵母菌降酸途徑,利用酵母菌將蘋果酸分解為乙醇和CO2,從而降低酒的酸度,典型的有粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe,S.pombe),該方法能實現(xiàn)發(fā)酵的同時降酸?;谝陨蟽煞N途徑的生物降酸技術(shù)對于檸檬酸型水果的降酸效果不佳[11,12],檸檬酸型水果深加工中酸度過高問題仍是食品加工行業(yè)亟待解決的難題之一,因此生物降解檸檬酸逐漸成為降酸研究的新突破點(diǎn)。
乳酸菌有降解檸檬酸的潛力,乳制品乳酸菌和葡萄酒乳酸菌的降酸機(jī)制研究比較深入。最近,胡麗云等[13]從青梅中篩選出一株能高效降解檸檬酸的乳酸菌,經(jīng)鑒定為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum,L.fermentum)。一些非釀酒酵母的降酸現(xiàn)象也開始受到關(guān)注,有研究發(fā)現(xiàn)部分非釀酒酵母可以有效降低果汁、果酒的有機(jī)酸含量,增加總酚、花青素的含量,改善產(chǎn)品的感官品質(zhì)。王冰倩等[14]篩選鑒定了3株紅樹莓降酸酵母:發(fā)酵畢赤酵母M-1(Pichia fermentansM-1,P.fermentansM-1)、美極梅奇酵母 M-4(Metschnikowia pul-cherrimaM-4,M.pul-cherrimaM-4)和近玫紅鎖擲孢酵母 M-5(Sporidiobolus pararoseusM-5,S.pararoseusM-5),利用M.pul-cherrimaM-4發(fā)酵檸檬酸含量為8775.24 mg/L的紅樹莓果汁,得到的功能型飲料檸檬酸含量較未發(fā)酵紅樹莓果汁降低了74%,總酚較未發(fā)酵紅樹莓果汁提高了84%,抗氧化活性顯著提高。由于非釀酒酵母一般難以完成酒精發(fā)酵,故實際應(yīng)用中常采用非釀酒酵母與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,S.cerevisiae)混合發(fā)酵,但混合發(fā)酵目前的降酸幅度較小。Zhong等[15]研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母 JT-1-3在與商業(yè)釀酒酵母菌RV002的聯(lián)用中具有較高的檸檬酸降解能力和強(qiáng)耐受力,在獼猴桃汁中純培養(yǎng),結(jié)果表明檸檬酸、蘋果酸和酒石酸分別從12.30、3.09和0.61 g/L顯著下降至11.00、2.02和0.41 g/L。
我國檸檬、百香果等檸檬酸型水果栽培面積大,產(chǎn)量高,加工產(chǎn)品種類少,利用乳酸菌和酵母菌在此類水果加工中進(jìn)行生物降解檸檬酸具有廣闊的應(yīng)用前景。本文綜述了檸檬酸生物降解菌種及其現(xiàn)有的代謝途徑及代謝產(chǎn)物研究、代謝影響因素及應(yīng)用,以期為生物降酸技術(shù)在檸檬酸型水果的降酸研究及應(yīng)用方面提供參考。
檸檬酸降解相關(guān)的代謝活動廣泛存在于乳酸菌中,如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)、明串珠菌屬(Leuconostocspp.)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei,L.casei)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum,L.plantarum)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus,L.rhamnosus)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis,E.faecalis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium,E.faecium)和酒類酒球菌(Oenococcus oeni,O.oeni)[16]、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum,L.fermentum)等[17]。檸檬酸降解僅出現(xiàn)在具有檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)和降解能力的乳酸菌內(nèi),這種乳酸菌含有必需的編碼檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶和檸檬酸裂解酶亞基的基因,被稱為檸檬酸陽性(cit+)菌。相對的,缺乏一個或多個這些基因的乳酸菌,被稱為檸檬酸陰性(cit-)菌[18]。最初大多數(shù)涉及檸檬酸降解途徑的相關(guān)知識來源于乳制品中的乳酸菌,一個多世紀(jì)前,在奶油成熟過程中研究人員發(fā)現(xiàn)了第一批能夠降解檸檬酸的產(chǎn)香菌,這批細(xì)菌被鑒定為明串珠菌屬和乳酸乳球菌亞種雙乙酰變種(Lactococcus lactissubsp.lactisbiovar.diacetylactis,L.lactisbiovardiacetylactis)[19]。葡萄酒乳酸菌在檸檬酸鹽的降解方面有著與乳制品乳酸菌相似的代謝途徑[20]。Ramos等[21]通過13C核磁共振技術(shù)顯示出的O.oeni檸檬酸降解途徑與乳制品乳酸菌基本相同。Aline等[22]研究發(fā)現(xiàn)了異型發(fā)酵的球桿菌(LeuconostocandOenococcusspp.)或兼性異型發(fā)酵的乳桿菌(L.plantarumandL.casei)通過MLF降解葡萄酒中的檸檬酸;酒中檸檬酸初始濃度為250~300 mg/L,根據(jù)MLF速率的差異,最終濃度在0~100 mg/L之間,并且亞硫酸處理后檸檬酸仍能繼續(xù)降解至完全消失。除了乳酸菌,最近研究還發(fā)現(xiàn)一些酵母菌具有突出的檸檬酸降解能力,主要有非釀酒酵母伊薩酵母屬(Issatchenkiasp.)和畢赤酵母屬(Pichiaspp.),以及假絲酵母屬(Candidasp.)的一些菌種[23]。
2.1 乳酸菌
乳酸菌是典型的兼性厭氧菌,由于厭氧菌的TCA循環(huán)是不完整的,一般情況下不能通過 TCA循環(huán)降解檸檬酸,而是形成了一種獨(dú)特的途徑[25],主要包括檸檬酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、裂解和丙酮酸代謝(見圖4)。編碼檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)和降解基因的組成有三種類型,L.lactisbiovardiacetylactis原型菌株CRL264中由位于乙酰乳酸合成酶基因als旁的染色體cit簇citM-I-CDEFXG和一個編碼檸檬酸滲透酶(citrate permease,CitP)的8.5 kb質(zhì)粒組成;L.lactisbiovardiacetylactisBpl1和KF67與前者不同在于其染色體cit簇citM-I-CDEFXG位于脂磷壁酸合成酶基因ltaS旁;L.lactisbiovardiacetylactisGL2的檸檬酸降解相關(guān)基因編碼在一個大的23 kb質(zhì)粒中[26]。缺乏草酰乙酸鹽脫羧酶的乳酸菌在嚴(yán)格的通氣條件下,通過 TCA循環(huán)的一部分將OAA進(jìn)一步由蘋果酸脫氫酶、富馬酸酶和富馬酸還原酶轉(zhuǎn)化為琥珀酸[25]。Ramos等[21]利用13C的核磁共振光譜學(xué)研究了O.oeni非生長細(xì)胞的檸檬酸降解途徑,發(fā)現(xiàn)大約有10%的檸檬酸轉(zhuǎn)化為天冬氨酸保留在細(xì)胞內(nèi),在此基礎(chǔ)上還能生成以天冬氨酸前體合成的亮氨酸、纈氨酸、天冬酰胺等必需氨基酸。
2.1.1 檸檬酸的轉(zhuǎn)運(yùn)
檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)是限制檸檬酸降解的關(guān)鍵步驟,需要各種相關(guān)的膜滲透酶做載體,比如檸檬酸滲透酶(citrate permease,CitP)或蘋果酸滲透酶(malate permease,MaeP)。大多數(shù)乳酸菌例如Lactococcus lactis、Leuconostoc mesenteroides、L.plantarum通過CitP實現(xiàn)檸檬酸的轉(zhuǎn)運(yùn)[2]。Oscar等通過量化pH、檸檬酸含量分別對L.lactisbiovardiacetylactis內(nèi)質(zhì)??截悢?shù)、citP轉(zhuǎn)錄水平、citPmRNA加工、檸檬酸鹽利用能力四個方面變化的貢獻(xiàn)程度,構(gòu)建了該菌株檸檬酸利用情況調(diào)控模型;培養(yǎng)基中提供了檸檬酸和乳糖,結(jié)果表明,低pH和檸檬酸都能誘導(dǎo)citP基因加倍表達(dá)且檸檬酸的誘導(dǎo)效果更好,citP基因表達(dá)從最低達(dá)最高的同時,檸檬酸利用率大約從每分鐘每克原料干重中利用1 μmol提高到65 μmol[27]。根據(jù)不同的環(huán)境條件,CitP轉(zhuǎn)運(yùn)檸檬酸的方式隨之變化。檸檬酸作為乳酸菌的唯一能量來源時,除了CitP催化二價檸檬酸鹽離子和質(zhì)子的同向運(yùn)輸,還可以進(jìn)行單價檸檬酸鹽離子的單端口運(yùn)輸。Pudlik等[28]在CitP的動力學(xué)研究的基礎(chǔ)上完善了檸檬酸的運(yùn)輸方式,結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)存在單價乳酸根離子(monovalent lactate,lactate-)、或者中間產(chǎn)物α-乙酰乳酸、丙酮酸、終產(chǎn)物乙酸時,CitP催化二價檸檬酸鹽離子(divalent citrate,CitH2-)與上述四種底物對向運(yùn)輸;而四種底物均不存在時,二價檸檬酸鹽離子和質(zhì)子通過緩慢的同向運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞。還有一部分乳酸菌例如O.oeni通過蘋果酸滲透酶MaeP轉(zhuǎn)運(yùn)檸檬酸。這兩種滲透酶都屬于 2-羥基羧酸鹽(2-hydroxycarboxylate,2-HCT)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,分別由citP和maeP基因編碼。與其他乳酸菌相反,檸檬酸鹽和低pH都不能誘導(dǎo)O.oeni中maeP的轉(zhuǎn)錄[29],這種轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。
CitP是目前在Lactococcus lactis中發(fā)現(xiàn)的檸檬酸唯一的轉(zhuǎn)運(yùn)體,但最近研究發(fā)現(xiàn)可能存在其他的轉(zhuǎn)運(yùn)體系。Delphine等[30]測定了16種不同菌株包括環(huán)境菌株和L.lactisbiovar.diacetylactis馴化菌株30 ℃下培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)基中的檸檬酸含量,發(fā)現(xiàn)UCMA5716(cit(M-G)+,citP-)是其中唯一能夠代謝少量檸檬酸的環(huán)境菌株,但代謝速率僅是馴化菌株 LD61(cit(M-G)+,citP+)的十分之一,推測該菌株中可能有其他的檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。L.lactisbiovar.diacetylactis菌株M20、TIFN2、TIFN4和KF67的cit基因簇中存在編碼一種CitO轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的全長拷貝,這種假定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與O.oeni及其他相關(guān)細(xì)菌中蘋果酸乳酸酶相關(guān)的蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)體有高度的氨基酸相似性[26]。許多研究表明蘋果酸存在時,檸檬酸的降解會受到抑制直至蘋果酸消耗盡。出現(xiàn)這種降解先后順序的原因尚不明確,存在幾種猜測有待證實。檸檬酸和蘋果酸互相作為蘋果酸乳酸酶活性位點(diǎn)的競爭性抑制劑[31-32],從轉(zhuǎn)運(yùn)的角度推測,蘋果酸滲透酶MaeP作為兩種酸共同的轉(zhuǎn)運(yùn)體,由于該酶以蘋果酸為底物的 Km值很高,在兩種酸都存在的情況下可能優(yōu)先轉(zhuǎn)運(yùn)蘋果酸;除此之外,蘋果酸還可能抑制檸檬酸滲透酶CitP或檸檬酸裂解酶的合成[33]。Palles等[34]觀察到在含檸檬酸和半乳糖的培養(yǎng)基上預(yù)生長的L.plantarum1919和L.caseiATCC393的檸檬酸降解量比不含檸檬酸預(yù)生長時分別增加了6和22倍,推測是培養(yǎng)基中加入的檸檬酸誘導(dǎo)產(chǎn)生了更多的檸檬酸裂解酶引起的。由此可見,在含有檸檬酸的培養(yǎng)基上預(yù)生長誘導(dǎo)相關(guān)酶的合成可以用于應(yīng)對蘋果酸的抑制作用,顯著提高菌株的檸檬酸降解能力,但對不同菌株發(fā)揮的效果不同。另外,一些腸球菌和乳桿菌的檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來自檸檬酸鹽-金屬同源物 (CitMHS)家族[35],以檸檬酸和 Ca2+、Mn2+、Fe3+復(fù)合物形式運(yùn)輸。
2.1.2 檸檬酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸進(jìn)而產(chǎn)生香氣化合物
運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的檸檬酸被檸檬酸裂解酶轉(zhuǎn)化為乙酸和草酰乙酸(oxaloacetate,OAA),OAA 在草酰乙酸脫羧酶的作用下,進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為代謝中間體丙酮酸,脫羧反應(yīng)消耗質(zhì)子形成了檸檬酸跨膜運(yùn)輸?shù)馁|(zhì)子動力(protonmotive force,PMF)[36,37]。檸檬酸裂解酶由α、β、γ三個亞基組成,分別由citD、citE和citF基因編碼[38]。
乳酸和乙酸是乳酸菌降解檸檬酸產(chǎn)生的主要代謝物(如圖4)。由于條件不同,乳酸菌的代謝產(chǎn)物也隨之改變,與丙酮酸代謝途徑的差異和外源電子受體的使用有關(guān)[39]。α-乙酰乳酸合成酶可以消耗丙酮酸生成α-乙酰乳酸,其中大部分產(chǎn)物經(jīng)α-乙酰乳酸脫羧酶脫羧形成乙偶姻,少部分經(jīng)過非酶反應(yīng)的氧化脫羧形成雙乙酰,這兩種產(chǎn)物是賦予乳制品奶油風(fēng)味的香氣化合物[28],其他途徑的代謝產(chǎn)物主要有D-乳酸、乙酸、2,3-丁二醇和乙醇[40]。乙醇影響O.oeni檸檬酸代謝的代謝活性和代謝通量。Olguin的研究證實MLF期間乙醇在低pH下誘導(dǎo)了參與檸檬酸降解的基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng),乙醇不存在的條件下,O.oeniPSU-1檸檬酸降解與MLF同時進(jìn)行;乙醇存在的條件下,檸檬酸降解雖延遲于MLF,但檸檬酸消耗摩爾數(shù)與菌生物量的摩爾比明顯增高,并且檸檬酸到乙酸的代謝通量增加[29]。
乳酸乳球菌的丙酮酸分解代謝途徑受到生長條件的影響,比如氧氣條件、碳和能源、NADH/NAD+的比例、pH以及輔助因素等[41]。Cretenet等的研究表明,N2條件下產(chǎn)生更多的甲酸和乙醇,O2條件下產(chǎn)生更多的乙酸、2,3-丁二醇和乙偶姻;氧是α-乙酰乳酸形成雙乙酰的關(guān)鍵組成部分,編碼丙酮酸脫氫酶、α-乙酰乳酸合酶和α-乙酰乳酸脫羧酶E1α亞基的基因在O2存在的條件下過表達(dá),產(chǎn)生更多的雙乙酰、乙偶姻、2,3-丁二醇[42]。NADH/NAD+的比例也與 O2有關(guān),通氣條件下,NADH氧化增加同時引發(fā)同型發(fā)酵向混合酸發(fā)酵轉(zhuǎn)變,伴隨較少的乳酸和較多乙酸、雙乙酰、乙偶姻形成[43]。pH為4時有利于乙偶姻產(chǎn)生,較高pH下乳酸、乙酸顯著增加。
目前已有許多研究通過涉及幾種酶活性的代謝工程的調(diào)控或基因工程菌的構(gòu)建,得到丙酮酸代謝通量顯著改變的菌株。在這些研究的基礎(chǔ)上,與生物降解檸檬酸技術(shù)聯(lián)系,我們可以更好地解決降解途徑產(chǎn)生的香氣化合物難以控制的問題。Curic等[41]通過破壞α-乙酰乳酸脫氫酶提高雙乙酰的產(chǎn)量。L.lactisbiovar.diacetylactisIL1403是不含質(zhì)粒的L.lactisbiovar.diacetylactis檸檬酸滲透酶突變體,Pudlik等[44]通過將質(zhì)粒pFL3轉(zhuǎn)移到L.lactisbiovar.diacetylactisIL1403,構(gòu)建了有產(chǎn)生乙偶姻和雙乙酰能力的菌株,質(zhì)粒pFL3在肺炎鏈球菌polA啟動子的控制下使L.lactisbiovar.diacetylactisIL1403含有乳球菌citP基因,且轉(zhuǎn)運(yùn)體和質(zhì)??截悢?shù)的表達(dá)都不受檸檬酸或培養(yǎng)基pH的控制。這種基因工程菌能更可控地完成檸檬酸降解任務(wù),但實際操作的可行性和降酸效果還需要進(jìn)一步實驗探索。
2.2 酵母菌
與乳酸菌不同的是酵母菌可以通過三羧酸(TCA)循環(huán)降解檸檬酸,能產(chǎn)生更多的NADH為生長代謝提供能量。丙酮酸是 TCA循環(huán)的起始點(diǎn),首先,在丙酮酸脫氫酶系的作用下丙酮酸脫羧形成乙酰輔酶 A,在檸檬酸合酶(Citrate synthase,CS)的催化下乙酰輔酶A再與線粒體中的草酰乙酸縮合為檸檬酸[45]。在順烏頭酸酶的催化作用下檸檬酸生成中間產(chǎn)物順烏頭酸,繼而轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕?。隨后,異檸檬酸經(jīng)過異檸檬酸脫氫酶的作用生成α-酮戊二酸,接著在α-酮戊二酸脫氫酶催化下形成琥珀酰-CoA和CO2。在琥珀酰-CoA合成酶作用下琥珀酰-CoA形成琥珀酸。琥珀酸又能在琥珀酰脫氫酶、富馬酸酶和蘋果酸脫氫酶的作用下生成草酰乙酸。乙醛酸支路[46]是酵母降解檸檬酸的另一條路徑。在順烏頭酸酶作用下檸檬酸轉(zhuǎn)化為異檸檬酸,異檸檬酸在異檸檬酸裂解酶的作用下生成乙醛酸和琥珀酸。隨后,乙醛酸和乙酰輔酶A在蘋果酸合酶作用下生成蘋果酸,蘋果酸在蘋果酸脫氫酶作用下生成草酰乙酸。當(dāng)體系中存在葡萄糖時,釀酒酵母的乙醛酸通路中位于細(xì)胞質(zhì)中的酶以及位于線粒體中的蘋果酸脫氫酶受到抑制不表達(dá)[47]。除此之外,檸檬酸可以被細(xì)胞質(zhì)中的 ATP檸檬酸裂解酶(ATP citrate lyase,ACL)裂解為乙酰輔酶A和草酰乙酸。
酵母菌降解的檸檬酸的代謝途徑(圖5)較為復(fù)雜,代謝中間產(chǎn)物有蘋果酸、琥珀酸、乙醛酸等其他有機(jī)酸,檸檬酸的含量也受其降解和合成兩個方面因素的共同調(diào)控。酵母菌的代謝中間產(chǎn)物丙酮酸沒有生成乳酸菌代謝產(chǎn)生的的乙酸、雙乙酰、乙偶姻、2,3-丁二醇等香氣化合物,而是大部分進(jìn)入了TCA循環(huán)。酵母菌的有完整的TCA酶系,乳酸菌TCA相關(guān)酶僅有蘋果酸脫氫酶、富馬酸酶和富馬酸還原酶。葡萄糖不存在時,酵母菌能通過將乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A的機(jī)制應(yīng)對乙酸脅迫,而乳酸菌內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)類似機(jī)制。推測酵母菌的檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)模式與乳酸菌有相似之處,假絲酵母(Candida utilis)在檸檬酸培養(yǎng)基上能夠通過兩種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在質(zhì)膜上實現(xiàn)檸檬酸的轉(zhuǎn)運(yùn),一種專門用于單羧酸、二羧酸和三羧酸的質(zhì)子系統(tǒng),以及一種能夠接受酸未解離形式的運(yùn)輸系統(tǒng),這兩種運(yùn)輸系統(tǒng)都是可誘導(dǎo)的,并受到葡萄糖抑制[46],但還未證實兩種菌運(yùn)輸檸檬酸的相關(guān)酶是否有所聯(lián)系。對篩選出的具有高濃度檸檬酸降解能力的酵母菌的研究大多集中在應(yīng)用層面,而酵母菌降酸的具體代謝機(jī)制及代謝途徑鮮有報道,降酸酵母如何應(yīng)對高濃度檸檬酸脅迫,哪些基因和酶參與了檸檬酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和降解等,都有待繼續(xù)深入研究。
3.1 pH對生物降解檸檬酸的影響
Lactococcus lactis的檸檬酸利用率有pH依賴性,這種 pH依賴性是由檸檬酸滲透酶的活性決定的,Starrenburg等[48]對L.lactis的檸檬酸鹽滲透酶進(jìn)行克隆、測序和表征,得出該蛋白的最適 pH范圍為5.5~6.0,與研究中發(fā)現(xiàn)的降解檸檬酸最佳pH范圍一致。較低的pH對L.plantarum檸檬酸的降解有抑制作用,通過調(diào)整發(fā)酵果汁的 pH可以使Lactobacillus plantarum更傾向于降解檸檬酸。Wei等[49]采用L.plantarumB7和或C8-1菌株對不同pH條件下的篤斯越桔汁進(jìn)行發(fā)酵,結(jié)果顯示L.plantarum在非pH調(diào)整果汁(pH=2.65)中主要代謝蘋果酸和還原糖,在pH調(diào)整果汁(pH=3.50)中檸檬酸和奎寧酸被大量消耗。一些研究表明pH在4.0~5.0范圍內(nèi)時,L.plantarum消耗檸檬酸的速度較其他的pH條件下更快。Kennes等[50]實驗得到的發(fā)酵橙汁中L.plantarumDSM 20174檸檬酸降解的最佳pH為4.0。Pretorius等[18]評估了不同pH下L.plantarum在合成酒基質(zhì)中的檸檬酸降解特性,觀察到pH 4.0和5.0時cit+L.plantarumIWBT B382均將合成酒基質(zhì)中的檸檬酸(0.5 g/L)消耗盡,而cit+O.oeni菌株在培養(yǎng)基pH 5.0時幾乎不能降解檸檬酸。
pH在檸檬酸鹽代謝的一些基因的調(diào)控中也起著重要作用,因此影響檸檬酸降解途徑中代謝物的濃度。Quintans等[51]發(fā)現(xiàn)酸性生長條件會對L.lactisbiovardiacetylactis檸檬酸降解的相關(guān)基因產(chǎn)生誘導(dǎo)作用,pH 7.0轉(zhuǎn)變?yōu)?5.5后,檢測到組成檸檬酸裂解酶亞基的CitE和CitF、草酰乙酸脫羧酶、α-乙酰乳酸合成酶的多肽表達(dá)水平增加,消耗的檸檬酸最終由生成乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)橹划a(chǎn)生較少的酸性和中性化合物。Ramos等[21]觀察到,O.oeni中調(diào)控雙乙酰脫羧為乙偶姻的基因在pH低于4.0時受到刺激表達(dá)。需要注意的是在含有檸檬酸鹽的培養(yǎng)基中初始外部pH低于4.5時,檸檬酸代謝產(chǎn)物之一的乙酸在含有檸檬酸的介質(zhì)中迅速積累并進(jìn)入細(xì)胞,O.oeniATCC BAA-1163的生長受到很強(qiáng)的抑制,因而只觀察到較弱的脫酸,這些結(jié)果表明,O.oeni不適用于環(huán)境pH低于4.5時檸檬酸的降解[52]。乙酸積累對O.oeni生長的抑制限制了其降酸的pH,而東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis,I.orientalis)不僅具有良好的乙酸抗性[53],甚至可以耐受pH 2.0的酸性條件[54],在高酸環(huán)境的生物降酸中形成了天然的優(yōu)勢。
3.2 碳源對生物降解檸檬酸的影響
細(xì)菌降解檸檬酸的同時會釋放能量,這些能量可以用于維系或促進(jìn)細(xì)菌的生長[55]。許多降解檸檬酸的乳酸菌使用檸檬酸作為電子受體與提供 NADH的葡萄糖、果糖、乳糖或木糖一起共代謝(檸檬酸+2[H]→乳酸+乙酸+CO2),研究表明只有少數(shù)乳酸菌可以以檸檬酸為唯一碳源生長[56]。O.oeni可以在乙醇發(fā)酵后將剩余葡萄糖和檸檬酸一起代謝,這種代謝方式對這些細(xì)菌增加ATP合成底物的磷酸化很重要[57]。培養(yǎng)基中存在檸檬酸和另一種碳源時,以L.rhamnosusATCC 7409為例,該菌株可以用檸檬酸作為能量來源,在葡萄糖加檸檬酸鹽的培養(yǎng)基上會發(fā)生兩峰生長,檸檬酸在誘導(dǎo)其降解的相關(guān)酶合成后才能被利用,故直到葡萄糖耗盡才開始被消耗[34]。L.lactis是乳制品發(fā)酵劑中降解檸檬酸的主要菌種之一,L.lactisbiovardiacetylactis可以在檸檬酸是唯一碳源的培養(yǎng)條件下生長[58]。乳桿菌和酒類酒球菌不能代謝檸檬酸作為唯一能量來源。近年來,Yu等[59]從青梅中篩選出一株能有效降解檸檬酸的L.fermentum,不消耗(或僅少量消耗)果汁中糖的情況下優(yōu)先利用檸檬酸維持生長。L.plantarum不能使用檸檬酸作為唯一能源,但能夠在處于靜止生長期的培養(yǎng)物中將檸檬酸轉(zhuǎn)化為乙酸,且如果菌數(shù)足夠多,可以在無能量來源的情況下代謝檸檬酸[34]。腸球菌與乳酸菌的不同之處在于不能共代謝檸檬酸和葡萄糖[60]。
葡萄糖對不同菌株降酸能力的影響存在差異,郝愛林等[12]通過初篩獲得了 20株降解檸檬酸效果好且發(fā)酵性能優(yōu)良的非釀酒酵母菌,與利用 YPD-檸檬酸培養(yǎng)基(含1%檸檬酸,2%葡萄糖)復(fù)篩時相比,大多數(shù)菌株的檸檬酸降解率明顯降低,相反東方伊薩菌B9S-2、M130的檸檬酸降解率卻有所增高。葡萄糖的存在也會影響檸檬酸代謝產(chǎn)物的生成,在有葡萄糖的條件下,乳酸菌檸檬酸代謝生成乳酸和丁二醇的含量會增加;在缺乏葡萄糖的條件下,檸檬酸代謝的主要產(chǎn)物是乙偶姻。葡萄糖還與檸檬酸代謝相關(guān)酶的活性和基因的表達(dá)相關(guān),Pretorius等[18]評價了不同水平的葡萄糖(2.5、50和115 g/L),果糖(2.5、50和115 g/L)和pH(3.0、3.5、4.0和5.0)對cit+、cit-的O.oeni和L.plantarumcitE基因表達(dá)的影響,研究發(fā)現(xiàn)cit+L.plantarum和O.oeni在果糖和pH處理中比在葡萄糖處理中消耗更多的檸檬酸鹽,特別是在果糖處理中citE基因表達(dá)最高,葡萄糖處理中cit+O.oeni菌株citE基因相對表達(dá)較低,不產(chǎn)生任何雙乙酰和乙偶姻,可以解釋之前研究發(fā)現(xiàn)的葡萄糖能刺激雙乙酰和乙偶姻還原為2,3-丁二醇的現(xiàn)象[37]。此外,曾有學(xué)者觀察到葡萄糖的分解代謝物能抑制檸檬酸滲透酶和檸檬酸裂解酶的表達(dá)[33,60]。說明葡萄糖的存在對L.plantarum和O.oeniL.plantarum和O.oeni的檸檬酸降解是不利的。
一些畢赤酵母降解檸檬酸也出現(xiàn)了受葡萄糖抑制的現(xiàn)象。發(fā)酵畢赤酵母JT-1-3(P.fermentans,JT-1-3)和季也蒙畢赤酵母(Meyerozyma guilliermondii,M.guilliermondii)JP-4-2在培養(yǎng)基中同時存在檸檬酸和葡萄糖的情況下檸檬酸利用率比檸檬酸單獨(dú)存在時明顯降低[61]。龔麗娟等[61]以S.cerevisiaeRV002為對照,將M.guilliermondiiJP-4-2接種于以檸檬酸、葡萄糖和乙醇為單一碳源或雙碳源的培養(yǎng)基中,測定酵母生物量及碳源代謝動態(tài)變化。結(jié)果表明,M.guilliermondiiJP-4-2對檸檬酸的代謝率最高(28.30%),乙醇或葡萄糖的存在會抑制其對檸檬酸的利用,與趙玉平等[62]的研究結(jié)果一致。
乳酸菌降解檸檬酸較多應(yīng)用于果汁的降酸領(lǐng)域,Yu等[59]利用一株不損失糖分的情況下優(yōu)先利用檸檬酸的L.fermentum調(diào)整茶枝柑果汁(檸檬酸含量為39.3 g/kg)的糖酸比,該菌株在30 ℃發(fā)酵6 h后將柑橘汁的糖酸比由12:1提高到22:1。胡麗云等從青梅中篩選出一株能高效降解檸檬酸的L.fermentum,結(jié)果表明在基礎(chǔ)培養(yǎng)液(含10 g/L的檸檬酸)中經(jīng)過36 h的發(fā)酵后培養(yǎng)液中檸檬酸減少了86.2%,可滴定酸含量降低50%以上,但低pH對菌株的生長產(chǎn)生了明顯的抑制作用;進(jìn)一步探究該菌的生理生化特性以及對乙醇、亞硫酸鹽等的耐受性發(fā)現(xiàn),該菌株的乙醇耐受性較高但對亞硫酸敏感,培養(yǎng)液中僅添加0.5 mmol/L的亞硫酸鈉后,菌株的檸檬酸代謝將會被完全抑制[13]。在高酸果汁的降酸實際應(yīng)用中,緩解低pH對菌株生長的抑制作用可以采用固定化細(xì)胞的方式。固定化技術(shù)(immobilization technology)是利用化學(xué)或物理手段,將游離微生物或酶定位在限定的空間區(qū)域里,提高微生物細(xì)胞或酶的濃度,從而保持較高的生物活性,并實現(xiàn)反復(fù)利用的方法[63]。L.fermentum對乙醇的高耐受性為其應(yīng)用于果酒降酸創(chuàng)造了可能,但亞硫酸敏感的特征對該菌株應(yīng)用于果酒降酸有一定限制。目前的研究對于接種O.oeni能否有效降解果酒中的檸檬酸存在一定爭議,Lasik-Kurdy?等[64]比較了酒精發(fā)酵后接種乳酸菌、共接種酵母菌和乳酸菌、酒精發(fā)酵后避免MLF發(fā)生以及酒精發(fā)酵后自然MLF四種不同的發(fā)酵工藝,只有在不接種O.oeniVP41的自發(fā)性MLF過程中才記錄到葡萄酒中檸檬酸濃度的顯著降低,在這一過程中,檸檬酸的濃度降低了 26.8%~39.3%。Balmaseda等[6]接種釀酒酵母前接種非釀酒酵母完成連續(xù)酒精發(fā)酵,再對赤霞珠葡萄酒進(jìn)行自發(fā) MLF或接種O.oeni,結(jié)果與Lasik-Kurdy?的結(jié)論相反,接種了O.oeni的赤霞珠葡萄酒MLF結(jié)束后檸檬酸含量更低。
酵母菌中的非釀酒酵母廣泛用于果汁和果酒降酸領(lǐng)域,較高的檸檬酸一般會對菌種的生長造成脅迫,非釀酒酵母菌伊薩酵母屬、畢赤酵母屬以及假絲酵母屬對高檸檬酸含量有較高的耐受力,非常適用于檸檬酸型水果果汁的降酸。文連奎等[65]利用I.terricola對檸檬酸進(jìn)行降解,培養(yǎng)時間為 60 h時,接種量在1.25×106~7.5×106CFU/mL的條件下,質(zhì)量濃度為8~12 g/L檸檬酸降解率均能達(dá)到90%以上,該菌株對SO2的抵抗力較弱但對酸性環(huán)境的耐受性強(qiáng),I.terricola可耐受最大質(zhì)量濃度為450 mg/L的SO2、體積分?jǐn)?shù)5%的酒精、最低pH為2的酸度。對降酸條件進(jìn)行優(yōu)化,而I.terricola對高檸檬酸果汁的降酸效果顯著,陳思睿等[66]對紅樹莓果園土壤和紅樹莓鮮果上的微生物進(jìn)行分離純化得到兩株降酸菌,經(jīng)過菌株形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗及分子生物學(xué)鑒定,兩株菌均為I.terricola,分別定名為I.terricolaWJL-T2、I.terricolaWJL-G4;采用靜置和振蕩兩種發(fā)酵方式進(jìn)行發(fā)酵,結(jié)果表明,接種量為4%(V/V),28 ℃靜置發(fā)酵8 d時紅樹莓果汁總酸降酸率分別達(dá)55.32%和60.41%;120 r/min振蕩發(fā)酵3 d,總酸降酸率分別達(dá)89.82%和94.66%,適合用在高濃度檸檬酸的果汁降酸[66,67],該研究同時發(fā)現(xiàn)有氧發(fā)酵顯著加快降酸速度并提高降酸效果。已有的兩種接種方式有各自的優(yōu)勢和缺陷,先接種降酸酵母菌株S8、加熱殺菌后再接種釀酒酵母不會對起降酸作用的I.terricola產(chǎn)生抑制,但發(fā)酵出的果酒有異味;共接種降酸菌株 S8和釀酒酵母降酸幅度小,但發(fā)酵出的樹莓酒感官更佳,釀造時間更短,產(chǎn)生的酒精可以較好的抑制雜菌生長。隋韶奕等[68]利用一株以L-蘋果酸和檸檬酸為碳源的I.terricola(代號S8)采用在生物降酸的同時進(jìn)行酒精發(fā)酵,通過正交試驗得到了最佳生物降酸條件為I.terricola接種量3%、釀酒酵母接種量0.08%、降酸溫度為28 ℃、降酸時間為5 d,樹莓酒中可滴定酸含量下降1.13%,釀酒酵母會在接種初期,與同處于對數(shù)生長期的I.terricolaS8爭奪生長所需的碳源和氮源,而且會提高產(chǎn)酒精的速度,過早的抑制了 S8的活性,降酸幅度小,不適用于高濃度檸檬酸水果的降酸。綜上,可以考慮優(yōu)化先對果汁降酸,再釀酒的工藝,怎樣的接種方式能從而更好地發(fā)揮非釀酒酵母在釀酒中的降酸能力。非釀酒酵母也具有一定的酒精發(fā)酵能力,有學(xué)者嘗試用I.orientalis或P.fermentans降酸并直接完成酒精發(fā)酵。郝愛玲等[69]通過實驗篩選出的I.orientalisM130在獼猴桃酒純發(fā)酵試驗中綜合評價最優(yōu),348 h發(fā)酵結(jié)束后的酒精度為7.67%(V/V),能夠?qū)J猴桃酒 13.12 g/L的檸檬酸降到 10.74 g/L,降酸率達(dá)18.12%,且發(fā)酵結(jié)束后酒體澄清、透明,香氣濃郁,酒精度。Zhong等[70]將P.fermentansJT1-3接種到藍(lán)莓汁中進(jìn)行發(fā)酵,釀造出酒精度為 6.25%(V/V),殘?zhí)菫?.83%(m/m)的果酒,檸檬酸顯著下降了43.35%。非釀酒酵母還能夠降低酒中的中鏈脂肪酸含量,有利于MLF的進(jìn)行[6]。
環(huán)境中也篩選出了檸檬酸降酸菌株,但是否能用于食品行業(yè)降酸有待評估。張鐸等[23]從檸檬酸廢水廢渣中分離培養(yǎng)純化獲得5株具有較強(qiáng)的降檸檬酸能力的菌株,發(fā)酵5 d降解了培養(yǎng)基中70%以上的檸檬酸,其中菌株NS2、NL2的酒精耐受能力相對較強(qiáng),可以耐受0%~4%vol的酒精度,NS2經(jīng)鑒定為庫德里阿茲威畢赤酵母(Pichia kudriavzevii,P.kudriavzevii),NL2經(jīng)鑒定為熱帶假絲酵母菌(Candida,C.tropicalis)。但關(guān)于假絲酵母降解檸檬酸的研究較少,未見其應(yīng)用于果汁果酒降酸領(lǐng)域。
5.1 早在一個多世紀(jì)以前,乳酸菌降解檸檬酸的代謝機(jī)制研究就比較深入,但研究方向局限于在乳制品工業(yè)中增加雙乙酰生成和葡萄酒中復(fù)雜香氣的形成,少有在果汁或果酒的生物降酸領(lǐng)域的應(yīng)用。目前生物降酸已逐漸成為降酸技術(shù)未來的發(fā)展趨勢,由于檸檬酸是許多水果中主要的有機(jī)酸,逐漸有學(xué)者分離并篩選出有檸檬酸降解能力的乳酸菌,并取得一定的降酸效果。就目前的研究來看,乳酸菌雖然具有降解檸檬酸的能力,但檸檬酸降解率不高,不適合高檸檬酸水果的降酸。另外,利用乳酸菌降解檸檬酸耗時久,往往滯后于蘋果酸的降解。故近年來有研究人員主要研究各種因素以及接種方式對乳酸菌檸檬酸代謝的影響,今后可以以此為依據(jù)進(jìn)一步充分探討乳酸菌應(yīng)用于果汁、果酒降酸的可能性。或許可以通過構(gòu)建基因工程菌、調(diào)控檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)和降解相關(guān)基因表達(dá)、誘導(dǎo)相關(guān)酶的合成,來強(qiáng)化乳酸菌的檸檬酸降解能力。
5.2 近年來發(fā)現(xiàn)了新的降解檸檬酸的微生物,伊薩酵母和畢赤酵母、以及假絲酵母,其中的一些酵母菌株甚至在高檸檬酸含量的果酒中仍能發(fā)揮出較好的降酸效果,但這些酵母菌的降解檸檬酸機(jī)理方面仍有待研究,下一步可以就其降解檸檬酸的機(jī)理、影響因素、代謝途徑等進(jìn)行深入研究。此外,非釀酒酵母和釀酒酵母之間也會相互作用,聯(lián)用時有諸多因素考慮,在聯(lián)用兩種酵母時可能使非釀酒酵母活性比單獨(dú)接種時降低,如果能解決異味問題,使降酸過程先進(jìn)行可能會得到更好的降酸率。一般非釀酒酵母不能完成酒精發(fā)酵,郝愛玲等[69]成功嘗試僅接種東方伊薩酵母M130將13.12 g/L的檸檬酸降低到10.74 g/L,同時完成了酒精發(fā)酵,說明有可能利用一些降酸酵母純發(fā)酵釀酒。降酸效果較好的L.fermentum和I.terricola都表現(xiàn)出亞硫酸敏感性,而亞硫酸是釀酒工藝中的一環(huán),可能對發(fā)酵工藝造成影響,采用先進(jìn)行果汁降酸再釀酒的工藝、通過現(xiàn)代分子生物技術(shù)或者基因工程得到耐受亞硫酸的菌種去突破這個限制因素也是今后的研究方向之一。