返魂草資源調(diào)查及分子鑒別研究

孫仁爽，張立秋，楊洪凱，鄧 琦，薛長松

（通化師范學(xué)院·吉林通化·134002）

返魂草為菊科多年生宿根草本植物麻葉千里光和單麻葉千里光的花期干燥全草[1]，是中成藥肺寧沖劑的原料藥。在民間廣泛用于抗病毒性感冒、抗炎及感染性疾患的治療。返魂草具有清熱解毒、舒肝理氣等作用，外用還可用于止血及分娩的鎮(zhèn)痛等[2]。 這兩種植物主要分布于吉林省的長白山區(qū)，另外黑龍江、內(nèi)蒙古及朝鮮、日本、俄羅斯（遠(yuǎn)東地區(qū)）也有分布[4]。主要生于海拔 700～1100 m的林間濕地、山溝林緣及濕草甸子[5]。另外在長白山區(qū)還分布另外一種千里光屬植物-林蔭千里光，與返魂草形態(tài)相似，容易被采集混入藥材市場。

為了解返魂草分布及基原情況，本研究對長白山返魂草進(jìn)行了調(diào)查，并采集了三種藥用植物的葉片，進(jìn)行DNA分析，為返魂草合理應(yīng)用提出合理建議。

1 調(diào)查及研究方法

在近三年時間對長白山返魂草進(jìn)行調(diào)查，并收集返魂草及林蔭千里光葉片裝入硅膠袋中迅速脫水干燥處理，形成待測樣品。

2 DNA處理

將待測樣用植物DNA提取試劑盒提取總DNA；參考羅焜等[6]研究方法，對提取的總DNA進(jìn)行處理和分析[7，8]。 應(yīng)用 MEGA6.0 計算分析[9]，構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹。

3 調(diào)查結(jié)果與分析

3.1 生境調(diào)查

長白山區(qū)返魂草主要生于海拔700～1100m的林間濕地、山溝林緣及濕草甸子。在實(shí)地調(diào)查的過程中發(fā)現(xiàn)，林蔭千里光與返魂草混生于山溝林緣處。兩種外觀形態(tài)相似，易于混淆。

3.2 DNA材料

本研究共收集23份樣品，詳細(xì)信息見表1。

表1 實(shí)驗樣品信息表

3.3 樣品處理結(jié)果

從全部樣品的根提取基因組總DNA，對DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物電泳均顯示較亮條帶，結(jié)果見圖1。

圖1 凝膠電泳圖

圖1 表明基因組總DNA提取質(zhì)量較好，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序得到高質(zhì)量的ITS2條形碼序列。

3.4 物種遺傳距離分析及發(fā)育樹構(gòu)建

根據(jù)測序結(jié)果對返魂草和林蔭千里光進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。

表2 單麻葉千里光、麻葉千里光、林蔭千里光遺傳距離

由表2可知，返魂草、林蔭千里光的種內(nèi)遺傳距離均為0，單麻葉千里光、麻葉千里光中間遺傳距離為0.1302，而與林蔭千里光種間遺傳距離均為0～0.1735，其種間遺傳距離都大于種內(nèi)遺傳距離。

基于ITS2序列，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖2 ITS2序列構(gòu)建返魂草、林蔭千里光NJ樹

結(jié)果表明返魂草與林蔭千里光聚為二支，返魂草與林蔭千里光在分子上可以區(qū)分。所以采用K2P遺傳距離、NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可區(qū)分返魂草和林蔭千里光。

4 結(jié)論與討論

本研究通過對返魂草資源情況調(diào)查可知，返還草野生資源逐年減少，在長白山海拔 700～1100m左右或在此類條件下栽培，也可在環(huán)境條件相似或相近的地方栽培，對野生資源的保護(hù)起到一定的作用。

另比較了藥材返魂草和林蔭千里光的遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育樹。返魂草藥材來源的麻葉和單麻葉千里光，雖然在遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育上差異不明顯，但在我們多年野外考察經(jīng)驗上看，這兩種植物從形態(tài)上有較大區(qū)別，而林蔭千里光與返魂草之間區(qū)別在細(xì)節(jié)上，非專業(yè)鑒別不能很好的區(qū)分。這說明，經(jīng)典形態(tài)分類鑒別與分子鑒別相結(jié)合才能科學(xué)合理分類。今后還應(yīng)進(jìn)一步加大千里光屬藥用植物資源的樣本量，來更好開發(fā)該屬植物。